Para alumnos de TECNOLOGIA DE ENZIMAS

Enzimas
A. Propiedades generales de las enzimas
B. Principios fundamentales de su acción catalítica
C. Introducción a la cinética enzimática
D. Enzimas regulador
A) Propiedades generales de las enzimas
1. Son los catalizadores de las reacciones químicas en
los sistemas biológicos
2. Aceleran muchísimo la velocidad de las reacciones
(106 – 1014 veces).
3. La actividad
catalítica
depende de la
integridad de la
estructura
nativa
Interacciones no covalentes
SITIO ACTIVO:
Sitio de ligamiento: attracts and positions the substrate
Cambios
conformacionales
Grupos catalíticos: (the reactive side chains of amino acids
or cofactors,which carry out the bond-breaking and bond-forming
reactions involved)
Grupo prostético : hemo en los
citocromos
(unión fuerte, covalente)
Holoenzima:
Holoenzima:
Apoenzima (parte
proteica, inactiva) +
Carácter inorgánico
(iónes metálicos)
Cofactor
(unión debil)
Carácter orgánico
(NADH, FAD,
Vitaminas, etc):
Coenzimas
http://www.biorom.uma.es/contenido/cibertexto/enz/enz3.htm#mm
depa.pquim.unam.mx/proteinas/enzimas/img17.html
4. ESPECIFICIDAD DE SUSTRATO
Complementariedad Geométrica
Complementariedad electrónica (grupos
de los aa que forman el sitio de unión)
Absolutamente específica
Sólo actúa sobre un sustrato
Grupo específica
Actúa sobre moléculas que comparten
una característica estructural
(gpo. funcional)
Enlace específica
Cataliza una combinación específica de
enlaces
Las E son estereoespecíficas (en virtud de su quiralidad
inherente a L aa forman sitios activos asimétricos)
Actúa sólo sobre uno de los estereoisómeros
(D o L)
Las E varían en especificidad geométrica
5. La ACTIVIDAD de las E depende no solo del
mantenimiento de su estructura nativa sino del pH,
temperatura
6. Control regulatorio:
Efecto sobre la actividad catalítica por un efector
(activador o inhibidor) hasta el control de la expresión
y el turnover de proteínas
Las enzimas alteran las velocidades de reacción
pero no los equilibrios
(A) S
(B) E + S
ES
P
EP
E+P
energia de activación, v
∆G
fijación
(A)
Cambio de energia libre
(equilibrio)
(B)
Un equilibrio viene descripto por una constante de equilibrio
K´eq= [P]/ [S]
∆G’° = -RT ln keq
La constante de equilibrio es un reflejo de la variación de energía
libre estandar gobal de la reacción
Para una reacción unimolecular la velocidad de una reacción viene
determinada por la concentración de sustrato (reactivos) y por una
constante de velocidad (s-1)
V= k [S]
Si una reacción de primer orden tiene una constante de velocidad de
0,03 se puede interpretar que el 3% de sustrato será convertido en
producto en un segundo
Energía de fijación: es la principal fuente
de energía libre utilizada utilizada por las
enzimas para disminuir la energía de
activación de las reacciones
Interacciones débiles
no covalentes entre la
E y el S: puente
hidrógeno,
interacciones iónicas
donde
e hidrofóbicas
De
viene la
La energía obtenida a partir
energía que
de la formación de una sola
interacción debil es entre 4proporciona el
30 KJ/mol
Para una reacción global se
descenso
necesitan 60-100 kJ/mol
espectacular
de la Energía Interacciones covalentes
de activación entre la E y el S reducen
la energía de activación:
La energía de fijación entre enzima y sustrato
proporciona especificidad de reacción y
catálisis
Disminuye la entropía
Disminuye la solvatación
Ayuda a la redistribución
electrónica
Cambios
conformacionales: teoría
del encaje inducido
Los grupos
funcionales catalíticos
pueden formar
enlaces covalentes
transitorios
Los grupos funcionales
del S pueden
transferirse
transitoriamente a la
Enzima
Interacciones no covalentes
SITIO ACTIVO:
Sitio de ligamiento: attracts and positions the substrate
Cambios
conformacionales
Grupos catalíticos: (the reactive side chains of amino acids
or cofactors,which carry out the bond-breaking and bond-forming
reactions involved)
Descomponer en sus
especies reactivas
Catálisis ácidoácido-base
Se puede estabilizar
transfiriendo protones
(agua, aa
aa,, acidos
orgánicos)
Intermediario cargado inestable
Catálisis covalente o nucleofílica
A-B
Mecanismos
catalíticos
A+ B
H2O
A-B + E-X:
Catálisis de iones metálicos
Efectos de proximidad y
orientación
A-X + B
A+X: + B
H2O
1. Por unión a sustratos para
orientarlos adecuadamente
2. Por mediación de reacciones
de oxidoreducción
3. Por estabilización
electrostática o protección de
las cargas negativas
Unión preferencial del complejo del estado
de transición
La mayoria de las enzimas utilizan una combinación de estrategias
catalíticas para conseguir un incremento de la velocidad
Grupos catalíticos específicos contribuyen a la catálisis
Catálisis covalente: ruptura de enlace peptidico
Catálisis básica: grupo hidroxilo actua como
nucleófilo
* La presencia de restos aminoacídicos cargados en el centro activo
puede estabilizar el estado de transición, y por tanto contribuir a la
catálisis enzimática.
La catálisis enzimática debida a un mecanismo de catálisis ácido-base
concertada, es muy frecuente, y como ejemplo podemos ver la hidrólisis
de un éster por una esterasa:
La cinética enzimática como método para comprender
el mecanismo de acción de una enzima
Variables o factores que influyen en la velocidad de una
reacción enzimática
1. Concentración de sustrato
2. Concentración de enzima
3. pH
4. Temperatura
5. Efectores (Activadores e Inhibidores)
La concentración de sustrato afecta la velocidad
de reacción catalizada por enzimas
+ E + Buffer de pH apropiado
Una cinética hiperbólica implica un proceso saturante:
La concentración de sustrato afecta la velocidad de una reacción
catalizada por Enzimas
Hipótesis de Michaelis - Menten
E+S
k+1
ES
k+2
E+P
k-1
- La primera parte del mecanismo,
k+1
E+S
ES
k-1
Tiene lugar mucho más rápidamente que la segunda:
ES
k+2
E+P
Hipótesis de Michaelis - Menten
EQUILIBRIO RÁPIDO
E+S
k+1
k2
ES
k-1
La segunda reacción es la mas lenta. El paso que
limita la velocidad de la reacción, es la
descomposición del complejo ES
E+P
Significado de la constante Km
1. Constante de equilibrio de disociación del complejo ES
(en condiciones de equilibrio rápido)
2. Medida inversa de la afinidad de la enzima por el sustrato
(en condiciones de equilibrio rápido)
3. Mide la función de fijación (en cond.de equilibrio rápido)
4. Concentración de sustrato para la que la velocidad se hace
igual a la mitad de la máxima (V0.5)
5. Se define para un complejo enzima-sustrato
6. Se mide en unidades de concentración
E+S
k+1
ES
k+2
E+P
k-1
Km = (k-1 + k+2)/k+1 en mecanismo de E.E.
Cuando k2 es menor que K-1
Km = k-1/k+1
Entonces Km se define como una constante de disociación
del complejo ES
Muchas veces las reacciones enzimáticas transcurren en pasos
múltiples después de la formación del complejo ES, en estos casos
Km es una función compleja de muchas constantes de velocidad
La quimiotripsina,por ejemplo, procede con un mecanismo
de este tipo:
K1
Del primer complejo ES se libera velozmente un primer producto P1
Mientras el complejo ES' tiende a acumularse en tanto la constante
cinetica de trasformacion en E y P2 resulta mas pequeña que la constante
cinetica de transformacion del complejo ES in ES' ( k4<<k3).
En este caso Vmax = K4 [Et]
Por ello es útil definir una constante de velocidad mas general: Kcat
para describir la velocidad limitante de cualquier reacción enzimática
en condiciones de saturación
[S] << Km v= kcat/km [E] [S]
Velocidad de segundo orden
La kcat es una constante de velocidad limitante de cualquier
reacción en condiciones de saturación.
En un mecanismo simple de Michaelis-Menten o Briggs-Haldane
kcat = k2 .
La constante catalitica kcat numero de
turnover o recambio
Cuando la enzima es saturado por el sustrato es decir
[S] >> km :
La comparación de la eficiencia catalítica de diferentes enzimas
requiere la selección de parámetros adecuados. La selección de Kcat
no es totalmente satisfactoria.
DOS E QUE CATALIZAN REACCIONES DIFERENTES
PUEDEN TENER LA MISMA kcat
Un parámetro mas útil es la
constante de especificidad
Para [S] << Km la
ecuación
asume la siguiente forma:
Vmax
= Vmax/Km [S]
El cociente kcat/Km es una constante de velocidad aparente
de segundo orden para la formación de E+P a partir de E+S
cuando el proceso depende del encuentro de
E con S ([S] << Km).
Límite superior de Kcat/Km 108 y 109 M-1 S-1 Perfección catalítica
Representación s -s/v
(Eadie - Hofstee)
1.2
s/v
1.0
0.8
0.6
s
1
Km
=
⋅s+
v Vmx
Vmx
0.4
-Km
0.2
0.0
-20
0
20
40
60
80
100
120
s
Representación v/s - v
(Wong - Hanes)
Vmax
v
100
v
v = − Km ⋅ + Vmx
s
80
60
40
20
v/s
0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
Efecto del pH
Los enzimas poseen grupos
químicos ionizables
(carboxilos -COOH; amino NH2; tiol -SH; imidazol,
etc.) en las cadenas laterales
de sus aminoácidos. Según
el pH del medio, estos
grupos pueden tener carga
eléctrica positiva, negativa o
neutra. Como la
conformación de las
proteínas depende, en parte,
de sus cargas eléctricas,
habrá un pH en el cual la
conformación será la más
adecuada para la actividad
catalítica. Este es el llamado
pH óptimo.
NH
-
+
H 3N
COO
C
Arg
NH
CH2
CH
CH2
COO+
H3N
Lys
CH
Succinato y
centro activo de SDH
pH 7
NH
+
H 3N
COOH
C
NH
CH2
CH
CH2
COOH
+
H 3N
CH
Succinato y
centro activo de SDH,
pH 2
NH
C
COO-
H 2N
NH
CH2
CH
CH2
COOH 2N
CH
Succinato y
centro activo de SDH,
pH 13
Efecto de la temperatura
Log V
1. Aceleración de la reacción por la T según la ecuación
de Arrhenius
1/T
k = A exp (-Ea/RT)
En condiciones definidas de pH, fuerza iónica y S
log v = log C – Ea/2,3RT
Efectores
Muchas sustancias alteran la actividad de una E al combinarse
con ella en una forma que influencia la unión con el S, su número
de recambio o ambos
Inhibidor: Efector que hace disminuir la actividad enzimática, a través
De interacciones con el centro activo u otros centros específicos
(alostéricos).
Esta definición excluye todos aquellos agentes que inactivan a
la enzima a través de desnaturalización de la molécula enzimática
De esta forma, habrá dos tipos de inhibidores:
I. Isostéricos: ejercen su acción sobre el centro activo
II. Alostéricos: ejercen su acción sobre otra parte de la
molécula, produciendo un cambio conformacional con
repercusión negativa en la actividad enzimática.
Los inhibidores isostéricos pueden ser de dos tipos:
1. Inhibidor reversible: establece un equilibrio con la enzima libre,
con el complejo enzima-substrato o con ambos:
E+I
EI
ES + I
ESI
2. Inhibidor irreversible: modifica químicamente a la enzima:
E+I
E’
Inhibición reversible
(a) El inhibidor se fija al centro activo de la enzima libre,
impidiendo la fijación del sustrato: Inhibición Competitiva
(b) El inhibidor se fija a la enzima independientemente de que lo
haga o no el sustrato; el inhibidor, por tanto, no impide la
fijación del sustrato a la enzima, pero sí impide la acción
catalítica: Inhibición No Competitiva
(c) El inhibidor se fija únicamente al complejo enzima-sustrato
una vez formado, impidiendo la acción catalítica; este tipo
se conoce como Inhibición Anticompetitiva
Inhibición Competitiva
S
E
ES
E+P
I
EI
Se define una constante de
equilibrio de disociación del
inhibidor:
[E] [I]
Ki =
[EI]
Características:
- Las fijaciones de sustrato e inhibidor son mutuamente excluyentes
- A muy altas concentraciones de sustrato desaparece la inhibición
- Por lo general, el inhibidor competitivo es un análogo químico del
sustrato.
-El inhibidor es tan específico como el sustrato
-Un inhibidor competitivo reduce la [E] libre disponible para la unión
-con el S
Problema 1: En ausencia de un inhibidor competitivo una E tiene un
Km= 8 µ M y en presencia de 3 µ M de inhibidor tiene un km
aparente de 12 µ M . Calcule Ki
Km aparente = α Km
α= Km aparente/km
α= 12/8 = 1,5
α= 1 + [ I ] / ki
Ki = [ I ] / α - 1
Ki = 3/1,5- 1 = 6 µM
Por tanto, en la inhibición competitiva,
1. El efecto cinético del inhibidor es el aumento aparente de la
Km, que aparece multiplicada por el factor (1 + I/Ki)
2. La Vmax no aparece modificada; para concentraciones muy
altas del sustrato, v = Vmax, igual que en ausencia de inhibidor
3. Cuanto más pequeño sea el valor de Ki mayor será la potencia
del inhibidor competitivo.
Succinato deshidrogenasa
Inhibidores
competitivos
COO-
CH2
COO-
FAD
FADH2
CH2
CH2
COOSuccinato
COOCH
SDH
CH
COOFumarato
COOMalonato
No puede
deshidrogenarse
COOC O
CH2
COOOxalacetato
Un paso más allá en el desarrollo de inhibidores potentes
es el concepto de Análogo de Estado de Transición (AET)
- El inhibidor no es estrictamente análogo del sustrato,
sino del Estado de Transición de la reacción.
- La afinidad de las enzimas por los AET es enorme, del
orden nM o pM, con lo que la fijación es tan fuerte que
puede considerarse irreversible
O
O2N
O
C
-
N+ CH3
O
C
O
H3 C
N+ CH3
O
OH
-
O2N
+
O
HO
O-
O
P
Estado de transición
CH3
O
O2N
Sustrato
CH3
O-
O
O2N
H3 C
O
C
H 3C
O
N+ CH3
Productos
CH3
H3C
N+ CH3
CH3
Análogo de
estado de transición
Inhibición no competitiva
S
E
ES
I
I
Inhibición
No Competitiva
S
EI
E+P
ESI
El inhibidor se fija indistintamente a la enzima libre E
y al complejo enzima-sustrato ES; ni el complejo EI
ni el complejo ESI son productivos
α’/Vmax
S
E
Ks
ES
K3
E+P
I
KI
Inhibición
Anticompetitiva
ESI
El inhibidor sólo puede fijarse reversiblemente al complejo ES;
el complejo ESI no es productivo
α’/Vmax
α´/Km
Inhibición Irreversible
- Los inhibidores irreversibles reaccionan con un grupo
químico de la enzima, modificándola covalentemente
-Su acción se describe por una constante de velocidad ki:
E+I
E’
- A diferencia de la inhibición reversible, el efecto de los
inhibidores irreversibles depende del tiempo de actuación
del inhibidor.
- Los inhibidores irreversibles son, por lo general, altamente
tóxicos.
Algunos tipos de inhibidores irreversibles
1. Reactivos de grupos -SH
2. Organofosfóricos
3. Ligandos de metales
4. Metales pesados
Reactivos de grupos -SH, 1
(a) Agentes alquilantes
Yodoacetato
E
ICH2 COO-
SH
IH
E
S CH2 COOO
(b) Compuestos insaturados
E S
E
SH
N CH2 CH3
O
O
N CH2 CH3
N-Etil maleimida (NEM)
O
Reactivos de grupos -SH, 2
(c) Formadores de mercáptidos
HOHg
E
SH
COO-
p-Hidroximercuribenzoato
E S Hg
COO-
(d) Oxidantes
Promueven la oxidación de dos tioles a un disulfuro
Organofosfóricos
Ser CH CH2
H 3C
OH
Ser CH CH2
H3 C
CH3
CH
F
P O
CH
H3 C
CH3
DFP:
diisopropil
fluorofosfato
CH3
CH
O P O
CH
CH3
H 3C
- Actúan sobre enzimas serínicas
- Únicamente sobre la Ser activa
- Insecticidas: Parathion, Malathion
- Inhibidores de la Acetilcolinesterasa
- Neurogases
Ligandos de coordinación de metales
Es el caso del ion cianuro, CNSe fija con gran afinidad a la sexta posición de coordinación
del Fe hemínico, impidiendo toda modificación posterior.
Por ello actúa sobre sistemas de Fe hemínico con la sexta
posición de coordinación libre, como la citocromo oxidasa,
de lo que deriva su elevadísima toxicidad
Inhibidores suicidas
(Inhibidores activados enzimáticamente)
- Se trata de moléculas que se unen al centro activo de manera
específica, igual que el sustrato o los inhibidores competitivos
- Una vez unidos al centro activo, la enzima transforma la
molécula en una especie química muy reactiva que modifica
covalentemente a la enzima, inactivándola
- Tienen por tanto (a) la especificidad del inhibidor competitivo
y (b) la potencia de los inhibidores irreversibles
Modo de acción de los inhibidores suicidas
E+I
1
EI
2
EI*
3
E’ + I*
1. El inhibidor se fija a la enzima igual que el sustrato o un
inhibidor competitivo convencional
2. La acción catalítica de la enzima convierte al inhibidor I
en una especie altamente reactiva I*
3. I* modifica covalentemente a la enzima, inactivándola
de forma definitiva al igual que un inhibidor irreversible.
Ejemplos de inhibidores suicidas, 1
- Sistema de la β-lactamasa bacteriana
La utilización masiva de antibióticos β-lactámicos (penicilinas,
sus derivados semisintéticos y cefalosporinas) ha conducido a
la aparición de resistencias a los mismos.
Los microorganismos resistentes a estos antibióticos lo son por
producir una enzima, la β-lactamasa, que inactiva a los antibió
ticos β-lactámicos.
Penicilina (activa)
S
R CO NH
CH3
CH3
N
O
COO-
β-Lactamasa
R CO NH
O C HN
O-
S
CH3
CH3
COO-
Ác.peniciloico (inactivo)
Muy a menudo los preparados de penicilinas o penicilinas
semisintéticas se formulan añadiendo un inhibidor suicida
de la β-lactamasa, el ácido clavulánico
O
CH2OH
C
N
β-Lactamasa
H
O
O
C
O-
CH2OH
C
HN
H
-
COO
COO-
Ác.clavulánico
O
O
C
CH CH2
Ser
O
O
HN
CH2OH
C
H
COO-
Esta molécula
reacciona con la
serina activa de la
β-lactamasa,
produciendo su
inactivación
Reacciones multisustratos
Nombre sistemático:
Grupo transferido
ATP: hexosa fosfotransferasa
Donador
Aceptor
Sustrato
Km
ATP
0,4
D-glucosa
0,05
D-fructosa
1,5
Grupo 1: Oxidorreductasas
Catalizan reacciones de oxidorreducción
Ared + Box
Glucosa + O2
Aox + Bred
Grupo 2: Transferasas
Catalizan reacciones de transferencia de grupo:
A-X + B
A + B-X
Dador: Aceptor - Grupo transferido - transferasa
ATP: D-Hexosa Fosfotransferasa EC 2.7.1.1
Nombre común: hexokinasa
Grupo 6: Ligasas
Catalizan la unión de dos grupos químicos a expensas
de la hidrólisis de un enlace de alta energía.
A + B + ATP
A-B + ADP + Pi
O bien
C + D + ATP
C-D + AMP + PPi
Mecanismos cinéticos de las reacciones con más
de un sustrato
1- Desplazamiento simple: Ordenado
Ordenado-- al azar
2- Doble desplazamiento o ping pong
Desplazamiento simple ordenado
S 1= A
NAD Y NADPH
(SUST.CONDUCTOR o
SUSTRATO ADELANTADO)
DESHIDROGENASAS
S2=B
P1= P
P2= Q
A
P
B
Q
E
EA
(EAB)--(EPQ)
(EAB)
EQ
E
A
Q
B
P
E
EA--EP
EA
F
FB
FB--FQ
E
Desplazamiento simple al azar
D-GALACTOSA+ATP-Mg+2
D-GALACTOSA-1P +ADP -Mg+2
galactoquinasa
Ping--Pong
Ping
E
R*OH
E-N + R-OPO3-2
fosfogliceromutasa
E-N-PO3-2
ENPO3-2
R-OH
EN +
R*-OPO3-2
E-SH + CH3COSCoA
E-SHCH3COSCoA
ES-COCH3
RNH2
HSCoA
ESH + RNHCOCH3
Aminotransferasas (Transaminasas)
Catalizan la interconversión reversible de aminoácidos
y cetoácidos. Utilizan piridoxal fosfato como cofactor
Enz--pirCHO
Enz
COOH
H2N CH
R1
COOH
+ C O
R2
COOH
COOH
C O + H2N CH
R1
R2
Su papel es importantísimo en el metabolismo de
aminoácidos. En clínica se determinan las siguientes:
EC 2.6.1.1, Aspartato aminotransferasa (AST, GOT)
EC 2.6.1.2, Alanina aminotransferasa (ALT, GPT)
Aspartato aminotransferasa, EC 2.6.1.1 (AST, GOT)
COO-
COO+
C O
H3N CH
+
CH2
-
COO
Aspartato
CH2
COOC O
CH2
CH2
-
-
COO
COO
α-Cetoglutarato
Oxalacetato
COO+
H3N CH
+
CH2
CH2
COOGlutamato
Aparece en citosol y mitocondrias de tejidos metabólicamente
muy activos. Su nivel se eleva en el suero ante afecciones
hepáticas y miocárdicas.
Alanina aminotransferasa, EC 2.6.1.2 (ALT, GPT)
COO-
COO-
C O
+
H3N CH
CH3
Alanina
+
CH2
CH2
COO-
α-Cetoglutarato
COOC O
CH3
Piruvato
COO+
H3N CH
+
CH2
CH2
COOGlutamato
Enzima citosólica, de elevada concentración en el parénquima
hepático. Se considera casi específica de lesión hepática.
Creatin kinasa, EC 2.7.3.2 (CK, CPK)
CH3
ATP
CH3
ADP
N CH2 COOH
HN C
NH2
Creatina
O
N CH2 CO O P OHN C
NH2
O-
Creatin fosfato
Creatin fosfato es una forma de almacenamiento de enlaces
ricos en energía en el tejido muscular. Es el prototipo de los
compuestos conocidos como fosfágenos.
v=
Vmaxs
Km + s
En un mecanismo de desplazamiento simple
v=
Vmax 1 [A][B]
Km B [A] + KmA [B] + [A][B
][B] + K sA
En mecanismo al azar K sA
K mB = K sB K mA
K mB
PARA LA REACCION EN SENTIDO CONTRARIO
v=
Vmax 1 [P][Q]
Km Q [P] + KmP [Q] + [P][Q
][Q] + K sQ K mP
En mecanismo al azar K sA
K mB = K sB K mA
Para A variable y B constante y saturante
REPRESENTACION
GRAFICA DE 1/V EN F DE
1/A A CONCENTRACION
FIJA DE B
Vmax [A][B]
v=
Km B [A] + KmA [B] + [A][B
][B] + K sA
Doble desplazamiento o ping pong
Vmax [A][B]
v=
K mB
Km B [A] + KmA [B] + [A][B
][B]
1
v
=
K
mA
Vmax
1
[A]
1
+
Vmax
(1
+ K mB)
[ B]
1
v
=
K mA
1
Vmax
[A]
1
+
Vmax
(1
+ K mB)
[ B]
Los mecanismos de reacción pueden caracterizarse además mediante
estudios de inhibición por los productos de reacción
Mecanismo
Ordenado
Al azar
Ping-Pong
Producto
inhibidor
Sustrato variable
A
B
P
NC
NC
Q
C
NC
P
C
C
Q
C
C
P
NC
C
Q
C
NC
Enzimas reguladoras
1. Enzimas alostéricas
Son reguladas por unión nono-covalente de
moduladores
2. Enzimas reguladas por
modificación covalente
Retroalimentación negativa en vías metabólicas, 1
Síntesis de Isoleucina
Thr
Treonina
desaminasa
α-cetobutirato
Ile
El producto final de la ruta, Isoleucina, inhibe a la primera
enzima de la misma, Treonina desaminasa
Retroalimentación negativa en vías metabólicas
Síntesis de pirimidinas
ATP
+
Asp + CP
ATCasa
Carbamil aspartato
CTP
El producto final de la vía, CTP (citidin trifosfato) inhibe a la
primera enzima de la ruta metabólica, Aspartato transcarbamilasa
Al mismo tiempo, dicha enzima puede ser activada por ATP
Rutas metabólicas controladas por retroalimentación
Ruta
Glicolisis
Neoglucogénesis
Bios. Ács. Grasos
Bios. Colesterol
Bios. Purinas
Enzima
Inhibidor
Fosfofructokinasa
ATP
FBP fosfatasa
AMP
AcetilCoA carboxilasa
AcilCoA
HMGCoA reductasa
Colesterol
PRPP sintetasa
AMP,GMP,IMP
1
1: Arogenato deshidratasa:
inhibida por Phe y activada
por Tyr
2: Arogenato deshidrogenasa
inhibida por Tyr
2
En el estudio de las enzimas controladas por realimentación
negativa, se comprobaron una serie de regularidades en las mismas:
1. Primer paso de una ruta metabólica o punto de ramificación
2. Enzimas de naturaleza compleja: subunidades; la enzima puede
desensibilizarse a sus inhibidores por diversos métodos.
3. Los inhibidores se comportan como competitivos (elevan el valor
de la Km aparente, pero sin embargo no son análogos estructurales
del sustrato
Estas últimas características lleva al concepto de alosterismo:
Una acción sobre la actividad enzimática que se desarrolla
fuera en el sitio de fijación fuera del sitio catalítico (Jacob y Monod, 1960)
Modelo de simetría- Modelo secuencial
Centro
alostérico
Centro
activo
s
En ausencia de inhibidor,
el sustrato se fija normalmente al centro activo
Inhibición alostérica
Centro
alostérico
i
Centro
activo
s
Cuando el inhibidor ocupa
el centro alostérico, tiene
lugar un cambio conformacional
en el centro activo que impide la
fijación del sustrato
Acción de un activador alostérico
(esquema de una subunidad)
Acción de un inhibidor alostérico
(esquema de una subunidad)
Otra característica importante de las enzimas alostéricas
es que presentan cinéticas anómalas, normalmente
cinéticas sigmoides:
v
La presencia de una
sigmoide implica
la existencia de
cooperatividad en la
fijación del substrato
Un incremento pequeño en la concentración de S
Se pueden asociar con grandes cambios en la actividad
De la E
s
La cooperatividad (positiva) consiste en que la fijación de una
molécula de sustrato favorece la fijación del siguiente, y así
hasta ocuparse toda la molécula
s
+
1
s s
+
2
s s
s
+
3
s s
s s
En términos de Km veríamos que Km1 > Km2 > Km3
Existe también cooperatividad negativa, cuando la fijación de
una molécula de sustrato dificulta la fijación del siguiente.
El comportamiento cooperativo implica:
1. Que hay más de un sitio de fijación de sustrato
por molécula de enzima (estr.cuaternaria)
2. Que hay interacciones entre los sitios de fijación
Enzima homotrópica
S es el efector
Efecto de moduladores positivos y
negativos que no afectan la Vmax
Efecto de moduladores positivos y
negativos que no afectan la K0,5 pero si
la Vmax
Enzimas reguladoras
2. Modulación covalente reversible
•
Fosforilación
•
Adenililación
•
Uridililación
•
ADP-ribosilación
•
Metilación
•
Carbamilación
Formas de modificación covalente, 1
Fosforilación: Protein kinasas
R CH
N
O C
Ser H C
H N
C
R' CH
N
H
ATP
ADP
CH2OH
O
H
Sobre residuos de Ser, Thr y Tyr
R CH
N
O C
Ser HC
H N
C
R' C H
N
H
O
CH2O P OOO
H
Formas de modificación covalente, 2
Defosforilación: Protein fosfatasas
R CH
N
O C
Ser HC
H N
C
R' C H
N
H2 O
H
O
CH2O P OOO
H
Pi
R CH
N
O C
Ser H C
H N
C
R' CH
N
H
CH2OH
O
H
Sobre residuos previamente fosforilados: Ser-P, Thr-P, Tyr-P
Formas de modificación covalente, 3
Adenilación: Sistema de la Glutamina sintetasa
R CH
N
O C
HC
Tyr
H N
C
R' C H
N
H2 N
H
N
N
O
CH2
O P O CH2
O-
O
N
O
H
OH
OH
N
Formas de modificación covalente, 4
ADP-ribosilación: actúa NAD+ como donador del
grupo ADP-ribosa
R CH
N H
O C
HC
H N
C O
R' CH
N H
H 2N
O
OH
NH
N
C H
NH2
+
N
N
O
O
OH
CH2 O P O P O CH2
O-
OOH
O
N
OH
N
Activación de la Rubisco por carbamilación
Formas de modificación covalente, 5
Rotura proteolítica:
N
Zimógeno
C
Proteinasa
específica
N
C
Enzima activada
+
N
C
Protrombina (II)
Precursores,
vía intrínseca
Fase 2
Fase 1
Protrombinasa
Precursores,
vía extrínseca
Trombina (IIa)
Fibrinógeno (I)
Monómero
de fibrina (Ia)
Fase 3
Polímero
de fibrina