Unidad 3.

3
Replicación,
trascripción
traducción del material genético.
y
La expresión génica se concretiza por la transformación de la información genética desde
moléculas de ADN a moléculas de ARN y desde estas hasta los polipéptidos
correspondientes.
Objetivo: Describir como una célula duplica
su material genético precisamente a partir
del ADN y explicar como decodifica y
utiliza la información contenida en su
genoma.
3.2 Mecanismos de transcripción.
Los precursores en la síntesis de ARN (unidades
estructurales) son cuatro ribonucleótidos trifosfatados:
rATP; rCTP; rGTP; rUTP.
Las moléculas de ARN
son sintetizadas usando
como molde a segmentos
específicos de ADN, en la
reacción de polimerización
que es catalizada por la
enzima conocida como
ARN polimerasa.
La secuencia de bases, del ARN a polimerizar, esta
determinada por medio de la secuencia de bases de la
molécula de ADN utilizada como molde para su
síntesis.
He ahí que se la denomine Cadena Molde de ADN (o
cadena templada).
La cadena de ARN crece en dirección 5’ – 3’. Esta
dirección coincide con la síntesis de ADN.
La ARN polimerasa, a diferencia de la ADN
polimerasa, es capaz de iniciar su síntesis sin la
presencia de ningún tipo de molécula cebadora.
En eucariotas, los
nucelosomas deben ser
removidos y
reestablecidos una vez
que la lectura se ha
realizado.
1
Características de la ARN polimerasa
procariota.
La ARN polimerasa es una de las enzimas
más grandes que se conoce. Consta de
varias sub-unidades: dos alfa (α), beta (β),
beta prima (β’) y sigma (σ).
1° etapa- UNIÓN de la ARN polimerasa al ADN
La enzima completa es
2° etapa- INICIACIÓN de la síntesis
3° etapa- ELONGACIÓN de la cadena de ARN
mensajero
denominada Holoenzima y se divide en
dos componentes principales:
• La enzima central, denominada Core,
formada por las sub unidades 2 α, β y β’
• El Factor Sigma ( el polipéptido σ)
4° etapa- TERMINACIÓN de la síntesis y
liberación de la cadena de ARNm.
2
Los factores Sigma suelen estar
organizados en cascadas
• La cascada de factores sigma se
genera cuando un factor sigma es
necesario para transcribir el gen que
codifica para el siguiente factor sigma.
• Los genes tempranos del faho SPO1
son transcritos por la RNA polimerasa.
• Uno de estos genes tempranos codifica
para un factor sigma que causa que la
RNA polimerasa transcriba los genes
medios.
• Dos de los genes medios codifican las
subunidades del factor sigma que hace
que la RNA polimerasa transcriba los
genes tardíos.
Secuencia terminadora
Todas contienen secuencias
Palindrómicas justo antes del
punto de terminación.
El palíndromo está caracterizado
por poseer repeticiones inversas
conteniendo un segmento central
no repetido (ej. ATCATCGACTA).
La secuencia de Uracilos
suministra la señal que permite a
la ARN polimerasa disociarse del
ADN molde.
La secuencia palindrómica
continúa con una secuencia de
pares A-T, las cuales producen en
el ARN mensajero una secuencia
de 6 a 8 Uracilos en el extremo
transcrito.
Antiterminación es un
evento regulador. Se usa
como mecanismo de
control en operones de
fagos y bacterias.
Rho se enlaza al RNA y utiliza su
actividad ATPasica para proveer energía
para traslocarse a lo largo del RNA hasta
que alcanza la región helical RNA-DNA,
desenrollando la estructura.
• La Terminación se evita
cuando proteínas antiterminación actúan sobre
la RNA polimerasa
ocasionando que lea a
través de un terminador o
terminadores específicos.
3
ESTRUCTURA DEL ARN mensajero en PROCARIOTAS
En células Procariotas es común hallar ARNm que codifican para varias cadenas polipeptídicas diferentes, en este caso
esta molécula se denomina ARNm Policistrónico.
Todo ARNm contiene dos tipos de regiones,
No codificante. Son los segmentos Líder, Trailer.
ESTRUCTURA DEL ARN mensajero en EUCARIOTAS
La estructura de los ARNm y el proceso de transcripción en las células eucariotas, es
similar a lo expresado anteriormente para las células procariotas. Sin embargo,
debemos considerar las siguientes diferencias:
Codificante- Son los cistrones o segmentos con codones que determinan la serie de aminoácidos de la
proteína.
Esta región se extiende desde un codón de inicio (usualmente AUG) hasta un codón stop (UAA, UAG, UGA).
Raramente el codón de inicio se encuentra en el extremo 5’ del ARNm, ya que a éste lo preceden centenares de bases que
conforman una de las regiones no codificantes. El sector comprendido entre el extremo 5’ y el codón de inicio se denomina
Lider.
Tampoco se traduce la secuencia comprendida entre el codón sin sentido y el extremo 3’ del ARNm y, a esta región, se la
denomina extremo Trailer.
Los ARNm Policistrónicos presentan secuencias de longitud variable que separan las regiones codificantes o Cistrones,
estas se denominan regiones espaciadoras, usualmente de 10 pb. de longitud. Cada Cistrón posee un codón de inicio y
un stop.
Por lo general las proteínas codificadas por un ARNm Policistrónico, participan en una misma vía metabólica
(ver Operón Lac).
a) Las células eucariotas poseen tres clases de ARN polimerasas (I, II y III), las
cuales se utilizan para sintetizar los distintos tipos de ARN existentes.
La RNA polimerasa no puede iniciar la síntesis sola, requiere factores
de trascripción específicos para cada sitio.
b) Los extremos 3’ y 5´ de los ARNm están modificados. En el caso del extremo 5’
encontraremos una estructura denominada CAP y, en el correspondiente extremo
3’, se encuentra adherido una larga secuencia de nucleótidos cuya base
nitrogenada es la Adenina (Cola Poly A).
c) Las moléculas de ARNm, luego de ser sintetizas, son modificadas. Los “transcritos
primarios” eucariotas sufren un proceso por el cual determinadas secuencias
(Intrones) son eliminadas.
d) Los ARNm eucariotas son Monocistrónicos - codifica para una cadena
Inicio
Stop
Inicio
Stop
ARNm
policistrónico
polipeptídica simple.
e) TATA box localizada a -25 Pb del punto de inicio.
f) La presencia del promotor esta aumentada por un Exaltador o Enhancer.
Principales Diferencias en la Transcripción
y Traducción entre Procariotas y Eucariotas
4
3
Replicación,
trascripción
traducción del material genético.
y
Objetivo: Describir como una célula duplica
su material genético precisamente a partir
del ADN y explicar como decodifica y
utiliza la información contenida en su
genoma.
3.3 Síntesis de Proteínas.
Traducción- La información del ADN transcrita a mRNA es
interpretada por el rRNA, lo que permite el transporte (tRNA) e
incorporación de los aa específicos de la proteína codificada.
Esta estrechamente acoplado a la trascripción.
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- Molécula mRNA policistrónico. Regiones codificantes para varias proteínas
(generalmente de una misma ruta metabólica, Operón Lac).
Región codificante: serie de codones que determinan los a.a de una proteína (codón
de inicio (AUG) y un codón sin sentido)ÎCistrón.
RNA mensajero (mRNA)
RNA ribosomal (rRNA)
•El rRNA es el más abundante (> 80% del RNA celular).
•El RNA menos abundante. 5-10% del RNA celular.
•Porta el mensaje genético del DNA. Secuencias de 3 nucleótidos
codifican para los aminoácidos de una cadena polipéptida.
•Su tamaño es muy variable y depende de la longitud del polipéptido
que codifica.
•Componente mayoritario de los ribosomas (rRNA 60-65%, proteínas
35-40%).
•Algunos de ellos son RNA muy largos y con muchos apareamientos
internos que generan una estructura secundario con horquillas y lazos
muy compleja.
•Interacciona con los otros RNAs (mRNA y tRNA) en cada paso de las
síntesis de proteínas.
rRNA Î Ribosomas
RNA de transferencia (tRNA)
•Hay al menos un tRNA por cada aminoácido.
•Cadena sencilla de RNA de 75-85 nucleótidos con bases modificadas.
•Estructura secundaria en hoja de trébol debido a apareamientos internos que
dan lugar a horquillas y lazos. Estructura terciaria en forma de L.
•Dos motivos estructurales esenciales:
9Extremo 3’que forma enlace covalente con el aminoácido
correspondientes.
9Secuencia anticodón complementaria de los tripletes que codifican
aminoácidos.
1
El proceso dinámico de la traducción del mRNA consta de tres etapas:
1-Iniciación
2-Elongación
3-Terminación
1-Iniciación representa todos los procesos requeridos para ensamblar el
ribosoma con el codon de inicio.
2-Durante la elongación se lleva a cabo la síntesis de polipéptidos en la
sub-unidad ribosomal grande.
3-Cuando el ribosoma alcanza la señal de “stop” se libera con el péptido.
Durante todo el proceso el ribosoma requiere factores de traducción que le
auxilian a enlazarse al mRNA, a seleccionar los aa y a mediar la terminación.
Proceso particularmente complejo en eucariotas.
1. Unión de la subunidad pequeña ribosomal al codón de inicio.
1. Reunir los elementos necesarios
2. Reconocer el sitio de inicio (AUG)
3. Proveer sitios para que se inicie la
elongación
Iniciación
P
R
O
C
A
R
I
O
T
A
S
..
1 Unión de la sub-unidad pequeña ribosomal al codón de inicio.
2 Unión del complejo aminoácido, el tRNA al ribosoma.
3 Establecer el complejo de iniciación con sub-unidad grande.
4 Inicia fase de elongación.
Factores proteicos requeridos para el inicio de la traducción en bacterias
•
•
•
IF‐1 Evita la unión prematura del tRNA al sitio A
IF‐2 Facilita la unión de fMet‐tRNAfMet a la subunidad ribosómica 30S
IF‐3 Se une a la subunidad ribosómica 30S; impide la asociación prematura de la subunidad
50S; mejora la especificidad del sitio P hacia fMet‐tRNAfMet
Reconocimiento
Secuencia de Shine-Delgarno:
5 a 10 primeros nucleótidos antes del
codón de inicio complementaria a los
nucleótidos cerca del extremo 3’ de la
sub-unidad 16s rRNA.
Secuencias
complementarias
que
permiten que llegue la sub-unidad 30s y
se pegue.
Elongación
2. Unión del tRNA al ribosoma.
Requerimientos
- mRNA
- tRNA (N-formil-metionina)
- codón de inicio
- 2 subunidades ribosomales
- factores de iniciación (IF1, IF2 y IF3)
- GTP, Mg 2+
3. Establecer el complejo de iniciación.
Etapas:
5- Selección del amino-acil-tRNA.
6- Formación del enlace peptídico.
7- Translocación y liberación del tRNA deacilado.
2
Translocación
Cambio en la posición de las dos
subunidades del ribosoma para dar
paso al tercer aminoacido.
Formación del enlace se logra cuando el
Nitrógeno del grupo amino del aminoácido 1
se une al grupo carbonilo del aminoácido 2
Factor de elongación requerido
Enzima involucrada: Peptidil-transferasa
•
Terminación
•
•
3 codones
Î terminación
de la adición de a.a
•
UAA, UAG o UGA Î detener la
elongación y liberar el polipéptido
asociado al último tRNA.
•
Reconoce que aquí ha
terminado la proteína
1.
Complejo
covalente con
el codón.
2.
Cambio en la
conformación
del ribosoma,
se une al RF.
3.
Hidrólisis
CONTROL DE LA TRADUCCIÓN
Factores de liberación (RF:release
factors)
–
–
–
•
•
Los genes que codifican para los factores de liberación en procariotas, RF1 y RF2,
se han identificado como prfA y prfB, respectivamente.
Mutaciones en estos genes pueden provocar la falta de lectura a las señales de
terminación, provocando una terminación ineficiente y una lectura continua.
El proceso de terminación es de crítica importancia en la síntesis de proteínas.
Mala interpretación del STOP Î adición no funcional e incluso dañina a la cadena
de polipéptidos Î pérdida de la función real de la proteína.
FR1: UAA y UAG
FR2: UAA y UGA
FR3: no específico, incrementa la
actividad de FR1 y FR2.
Riboswitches
RF Î sitio A.
–
sRNA
Tripéptido interactúa con el codón
STOP, hidroliza el enlace éster del
tRNA y libera el a.a.
Inhibidores
Poliribosomas
Operón
La iniciación de la síntesis de proteínas en el citoplasma de
los eucariotas es parecido al de las bacterias.
Diferencia entre la expresión génica de procariotas y eucariotas
pero el orden de los sucesos es diferente y el numero de
factores accesorios es mayor.
•La metionina inicial (AUG) en presenta el grupo formil (formilmetionil-tRNA).
•Los factores de iniciación (IEF 1, IEF2 y IEF 3) son menos abundantes que en eucariota
(al menos 12).
•La traducción y la trascripción están acopladas.
•La proteína producto se madura directamente en el citosol.
•
En Eucariotas, la subunidad pequeña reconoce primero el extremo 5’ del
ARNm, y se desplaza al punto de iniciacion, donde se unen las subunidaes
grandes.
•
Casi todos los ARNm de los eucariotas son monocistronicos, pero cada
ARNm es por lo menos sustancialmente mas largo que lo estrictamente
necesario para codificar su proteína.
•
El ARNm medio de un citoplasma eucariótico es de unas 1000-2000 bases
de longitud.
•
Tiene un cap metilado en el extremo 5’ y transporta entre 100 y 200 bases de
Poli(A) en el extremo 3’ .
3
Se necesitan varios
factores de iniciación en
eucariotas para
desenrollar el ARNm,
unir la subunidad del
complejo de iniciación y
colaborar con la unión de
la subunidad mayor.
•
El codon de iniciacio AUG esta situado a menos de 40 bases del
extremo 5’ del ARNm, de manera que tanto el cap como el AUG estan
unidos simultaneamente al ribosoma.
•
Pero en muchos ARNm, el cap y el AUG están mas separados, en
casos extremos a ~1000 bases de distancia (5’-ACCAUGG-3´).
•
Aun así la presencia del cap sigue siendo necesaria para que se forme
un complejo estable en el codon de iniciación. Control regulatorio por
sRNA
•
Como puede el ribosoma depender de dos puntos tan separados ?
•
La migración se detiene cuando la unidad 40S encuentra el codon
AUG.
El triplete AUG detiene la migración cuando consta de la secuencia
GCCªCCCAUGG.
Las tres bases purinicas ( A o G ) previas al codon AUG y la G que le
sigue inmediatamente son de máxima importancia, e influyen en la
eficacia de la traducción.
•
El modelo de “busqueda”,
supone que la
subunidad 40S
reconoce inicialmente
el cap 5’ y “migra”
entonces a lo largo del
ARNm.
•
•
La unión se estabiliza en el punto de inicio cuando la unidad 40S se une a la
subunidad 60S.
La búsqueda a partir del
extremo 5’ es un
proceso lineal.
•
La metionina del ARNt iniciador no se formila, se llama ARNti Met.
•
Tiene una estructura terciaria poco habitual, esta modificado por
fosforilación 2’ribosa en la base 64 (si se impide esta modificacion, el
iniciador se puede utilizar para la elongacion ).
La unión de las subunidades 60S con el
complejo de iniciación no se puede
producir hasta que elF2 y elF3 se han
liberado de este complejo de iniciación.
Como reconoce el
ribosoma el ARMm ?
elF4G se une a elF3, que se asocia con la unidad ribosómica pequeña.
Esto hace que se unan la subunidad ribosómica 40S al elF4F y así es reclutada para el
complejo.
En efecto, el IF4F coloca el F4G en su lugar de forma que pueda atraer a la subunidad
pequeña 40S.
El IF6 (que tiene la mayor parte de actividad anti asociacion ) Se une a la unidad
ribosómica grande. Se libera cuando la subunidad mayor se une al complejo de iniciación.
4
Una vez que se ha formado el ribosoma completo en el codon de iniciación, el
escenario esta dispuesto para un ciclo en el que el aminoacil -ARNt entra en el
lugar A de un ribosoma cuyo lugar P esta ocupado por el peptidil -ARNt
•
Cualquier aminoacil –ARNt excepto el iniciador puede entrar en el
sitio A.
•
Su entrada esta mediada por un factor de elongación ( EFF-Tu en
las bacterias) en los eucariotas el proceso es parecido.
•
Una vez que el aminoacil-ARNt esta en su lugar, EF-Tu abandona
el ribosoma, para trabajar de nuevo con otro aminoacil- ARNt.
•
Así que muestra la asociacion cíclica con el ribosoma que es la
característica de los factores accesorios.
•
Se carga el aminoacil - ARNt en el sitio A
en dos fases.
•
Primero: el extremo del anticodon se une al
lugar A de las subunidades 30S. Entonces,
el reconocimiento codon -anticodosn
dispara un cambio en la conformación del
EF-Tu.
•
Se rompe el GTP. El extremo CCA del
ARNt se mueve hasta el lugar A de la
subunidad 50S.
•
Se libera el complejo binario EF-Tu-GDP.
Esta forma de EF-Tu es inactiva y no liga
de forma efectiva el aminoacil- ARNt.
Vía para que el aminoacil- ARNt entre en el sitio A
•
El EF- Ts es desplazado a su vez por el GTP, volviendo a formar
EF- GTP.
•
El complejo binario activo se une al aminoacil -ARNt; y el EF- Ts
liberado se puede reciclar.
•
Esto implica
que la mayoría de los aminoaciacil -ARNt
probablemente están presentes en forma de complejos ternarios.
•
Por lo tanto , la presencia de GTP es necesaria para que el
aminoacil -ARNt se una al lugar A, pero la hidrólisis no es
necesaria hasta mas tarde.
• El Principio básico es que las reacciones en que participa
EF- Tu ocurran con suficiente lentitud para permitir que los
aminoacil –ANRt incorrectos se disocien antes de que
queden atrapados en la sintesis de proteinas.
• En Eucariotas, el factor EF- 1ά es responsible de llevar al
aminoacil –ARNt al Ribosoma
5
La Translocacion mueve al
ribosoma
•
El Ribosoma permanece en su lugar
mientras la cadena polipeptídica se
alarga mediante la transferencia del
polipéptido unido al ARNt en el sitio P
al aminoacil –ARNt que esta presente
en el sitio A.
•
La actividad responsable de la síntesis
de la unión peptidica se llama peptidil
transferasa.
•
La translocacion necesita de GTP y de
otro factor de elongación, EF –G este
factor es un constituyente principal de
la celula.
Dominios que se parecen !
La estructura del complejo ternario de
aminoacil –ARNt . EF –Tu. GTP
(izquierda ) se semeja a la estructura
del EF –G ( derecha ) .
Los
Dominios
estructuralmente
conservados de EF –Tu y EF –G son
de color rojo y verde; el ARNt y el
dominio que se le parece el el EF –G
Son de color violeta.
La capacidad de cada de cada factor de elongación para excluir al
otro descansa sobre un efecto alosterico en la conformación
global del ribosoma o en la competición directa para los sitios de
unión que se superponen.
Terminación
Mapa de las rutas secretoras bioactivas y endocitoticas.
Las proteínas son transportadas del ER a la membrana vía endosomas o
lisosomas o bien pueden ser dirigidas al aparato de Golgi o al ER.
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Videos sobre síntesis de Proteínas
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