“Perfil Inmunofenotípico de Síndromes Linfoproliferativos Crónicos”
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UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CÓRDOBA Facultad de Ciencias Químicas Carrera de Especialización en Bioquímica Clínica: Área Hematología PROTOCOLO DE TRABAJO FINAL “Perfil Inmunofenotípico de Síndromes Linfoproliferativos Crónicos” por Bioquímica Susana Rubiolo Director del Trabajo Final Dr. Miguel Ángel Orsilles INDICE Pág. LISTAS DE ABREVIATURAS………..................…………................................................II LISTA DE FIGURAS……………..............……………………………………………………III LISTA DE TABLAS …………............……....………………………………………..……….VI RESUMEN....................................................................................................................VII SUMMARY...................................................................................................................VIII 1. INTRODUCCIÓN……..…………………………………………..…………………………1 2. CARACTERÍSTICAS INMUNOFENOTÍPICAS DE LAS POBLACIONES LINFOIDES……….……...................................................................................................2 2.1 Linfocitos B…………......……………………………………………………….…2 2.2 Linfocitos T…………...……………………………………………………….…5 2.3 Células NK ……………..…………………………………………………….……7 3. LINFOMAGENESIS……………………………………………………….……………..…9 4 . C L A S I F I C A C I Ó N D E L O S S I N D R O M E S L I N F O P R O L I F E R AT I V O S CRONICOS…………................................................................................................….10 5.CARACTERÍSTICAS INMUNOFENOTIPICAS DE SLPC CON EXPRESIÓN PERIFÉRICA….........................................................................................................….13 5.1 Linfomas de células B……………….........……………………………………..13 5.1.1 LLC/linfoma de linfocitos pequeños …......…….......…….……………13 5.1.2 Leucemia prolinfocítica B ……..........…………………………..……...…14 5.1.3 Linfoma linfoplasmocítico …..........……………....………….……………15 5.1.4 Linfoma B de la zona marginal …...........……......……………..…..……16 5.1.5 Leucemia de células vellosas (Tricoleucemia)……........……………….17 5.1.6 Linfoma folicular …………………............…………………………..……18 5.1.7 Linfoma de células del manto …..........…………….....………………….18 5.1.8 Linfoma de Burkitt ……………...........…………………………….………19 5.2 Linfomas de células T y células NK …………………………...………..…..20 5.2.1 Leucemia prolinfocítica T ……....………………………….………………20 Pág. 5.2.2 Leucemia linfocítica de células T grandes granulares…...……………21 5.2.3 Micosis fungoide/síndrome de Sézary………………………………….22 6. OBJETIVOS ……...…………………………………………………………………..……23 7. MATERIALES Y MÉTODOS ………………......…………………………………………24 8. RESULTADOS …………………....……………………………………………………….26 9. DISCUSIÓN …………....………………………………………………………………….38 10. CONCLUSIÓN …………………………………………………………….……………..44 11. BIBLIOGRAFÍA …………....……………………………………………………………..45 LISTA DE ABREVIATURAS - Ac Mo: Anticuerpos monoclonales - CD: Cluster de diferenciación - FITC: Isotiocianato de fluoresceína - FSC: Dispersión frontal de luz (tamaño celular) - HLA-DR: Antigeno leucocitario humano- DR - IgD: Inmunoglobulina D - IgM: Inmunoglobulina M - Igs: Inmunoglobulina de superficie - LF: Linfoma folicular - LGG: Linfocitos grandes granulares - LLC: Leucemia linfática crónica - LLGG: Leucemia de linfocitos grandes granulares - LM: Linfoma del manto - LNH: Linfoma no Hodking - LPL: Leucemia Prolinfocítica - LZM: Linfoma de zona marginal - MALT: Linfoma de la zona marginal asociado a mucosas - MF/SZ: Micosis fungoide/ Síndrome de Sézary - MM: Mieloma múltiple - NK: Célula asesina natural - OMS: Organización Mundial de la salud - PE: Ficoeritrina - RCT: Receptor de células “T” - SLPC: Síndromes linfoproliferativos crónicos - SS: Dispersión lateral de luz (complejidad interna de la célula) - TC: Tricoleucemia - TdT: Deoxirribonucleotidil transferasa terminal LISTA DE FIGURAS Pág. Figura 1. Expresión de marcadores durante la ontogenia normal de células B……..….4 Figura 2. Diferenciación de los linfocitos B en órgano linfoide central y en órganos linfoides periféricos…..................................................................................................….5 Figura 3. Expresión de marcadores durante la ontogenia T …………………...…………6 Figura 4. Diferenciación de los linfocitos T en órgano linfoide central y en órganos linfoides periféricos…......................................................................................................7 Figura 5. Desarrollo de las células NK………..........………………………………..………8 Figura 6. Origen de distintos tipos de linfomas B a nivel del ganglio linfático……..…..10 Figura 7. Frotis de sangre periférica de una leucemia linfática crónica B……….……..13 Figura 8. Frotis de sangre periférica de una leucemia prolinfocítica B….………..........15 Figura 9. Sangre periférica de un linfoma linfoplasmocítico leucemizado….…….........15 Figura 10. Linfoma esplénico con abundantes linfocitos vellosos…….....………..........16 Figura 11. Frotis de sangre periférica de una tricoleucemia…..…………..……………..17 Figura 12. Linfoma folicular leucemizado de tipo centrocítico (izquierda) y de tipo centroblástico (derecha)………….…………………………………………………............18 Figura 13. Frotis de sangre periférica de un linfoma de células del manto……..………………………………………………………………..…………………..19 Figura 14. Linfoma de Burkitt. Célula con intensa basofilia y vacuolas en el citoplasma.....................................................................................................................19 Figura 15. Leucemia prolinfocitica T………………....……………………………………..20 Figura 16. Leucemia de linfocitos grandes granulares……......………………………....21 Figura 17. Células de Lutzner y Sézary…………...……………………………….………22 Figura 18. Distribución de linfomas de estirpe B en 120 pacientes con SLPC….……..26 Figura 19. Distribución de linfomas de estirpe T/NK en 120 pacientes con SLPC…….27 Figura 20 Características morfológicas de linfocitos de sangre periférica de un caso de LLC-B………......................................................................................................……….28 Figura 21. (A) Histograma de distribución de la población linfoide neoplásica Pág. según dispersión de la luz láser y (B) Histograma de la expresión de cadena liviana k/CD19 ..........................................................................................................................28 Figura 22. A) Histograma que muestra la coexpresión CD5/CD19, B)Histograma que muestra la coexpresión CD23/CD20 y C) Histograma que muestra la falta de expresión de FMC-7 en un caso de LLC-B………………......……………………………….…..…...29 Figura 23. Características morfológicas de prolinfocitos en sangre periférica de un caso de LPL-B………........……………………………………………………………………..…..30 Figura 24. A) Histograma que muestra la expresión de CD19 y ausencia de CD5 y B) Histograma que muestra la expresión de CD22 en un caso de LPL-B………..............30 Figura 25. A) Infiltración de la médula ósea por células plasmáticas en un paciente con MM y B) Histograma de la coexpresión CD138/CD38………......……………….....…...31 Figura 26. Características morfológicas de las células linfoides de sangre periférica de un caso de LZM…………......………………………………………………………………..31 Figura 27. Morfología de un tricoleucocito de un caso de TC…………………..……….32 Figura 28. A) Características citomorfológicas de las células linfoides de un caso de LM, B) Histograma que muestra la coexpresión de CD5/CD19 y C) Histograma que muestra la expresión de CD20 y ausencia de CD23 en un caso de LM………...……..33 Figura 29. Histograma que muestra la ausencia de CD5 en un caso de LLC-B……....35 Figura 30. Prolinfocitos en sangre periférica de un paciente con LPL-T………........….36 Figura 31. Histogramas que muestran la ausencia de CD25 (A), la expresión de CD5 (B), coexpresión CD4/CD3 (C) y ausencia de CD2 y CD7 en el paciente con MF…....37 Figura 32. Histogramas que muestran la expresión de CD56 (A) y CD16 (B) en el caso de LLGG-NK…………....………………………………………….………………………....37 LISTA DE TABLAS Pág. Tabla I. Clasificación de las neoplasias de células B según la OMS ...........................12 Tabla II. Clasificación de las neoplasias de células T y NK según la OMS ..................12 Tabla III. Inmunofenotipo diferencial de los SLPC-B ................................................... 20 Tabla IV. Inmunofenotipo diferencial de los SLPC-T ................................................... 22 Tabla V. Distribución de los SLPC según rango etario ................................................ 26 Tabla VI. Distribución de los inmunofenotipos de SLPC según sexo .......................... 27 Tabla VII. Expresión de antígenos de superficie de LLC-B ......................................... 29 Tabla VIII. Inmunofenotipos de los tricoleucocitos de 8 pacientes con TC ..................... 32 Tabla IX. Expresión de CD23 y FMC-7 en distintos SLPC-B........................................ 34 Tabla X. Expresión de CD5 y CD10 en distintos SLPC-B .............................................34 Tabla XI. Marcadores y sistemas de puntuación para diferenciar LLC-B de otros SLPC-B .......................................................................................................................................34 Tabla XII. Aplicación del sistema de puntuación en LLC-B y otros SLPC-B................. 35 Tabla XIII. Perfil inmunofenotipico de linfomas de células T/NK ................................. 36 INTRODUCCIÓN 1 1. Introducción Los Síndromes Linfoproliferativos Crónicos (SLPC) son procesos neoplásicos que se originan en el tejido linfoide tanto central como periférico presentando diversas variedades morfológicas, inmunológicas, genéticas y clínicas. Estas características representan la expresión de la variedad citológica y de la diversidad de la función inmune que corresponde a las estructuras linfoides (1). Numerosos factores de riesgo han sido identificados en el desarrollo de las enfermedades linfoproliferativas, entre ellos, se incluyen a: inmunodeficiencias congénitas y adquiridas (2), síndromes de inestabilidad cromosómica (3), infección por virus de Epstein-Barr (4), infección por Helicobacter pylori (5), desórdenes autoinmunes (6) y exposición a agentes químicos y físicos (7). La incidencia de los SLPC a nivel mundial se encuentra en un incremento considerable, no sólo debido a la epidemia de la infección por el Virus de la Inmunodeficiencia Humana, sino también al aumento de la prevalencia de linfomas en mayores de 65 años (8). Además, la incidencia de estas neoplasias linfoides varía en diferentes áreas geográficas (9). Así, la leucemia linfática crónica (LLC) de origen B y el linfoma folicular (LF) son significativamente más frecuentes en los países europeos, Israel y Estados Unidos de Norteamérica (USA), con una frecuencia estimada de 3,4-5,4 por 100.000 habitantes (10). Por el contrario, en países asiáticos como Japón y China, la incidencia de LLC se estima en alrededor de 0,01-0,5 por 100.000 habitantes (11). La LLC es la leucemia crónica más frecuente del adulto en países occidentales y constituye el 30% de todas las leucemias en USA y Europa (12). Por el contrario, en Japón la LLC representa sólo 2% de los casos y en China (Hong Kong) 12%. En Latinoamérica, algunos estudios parecen indicar que la LLC es poco frecuente en México, especialmente en mestizos mexicanos. La LLC se diagnosticó sólo en 9% de los casos de leucemia del adulto y en 5% de los pacientes de raza mestiza (13). Del mismo modo, su incidencia es significativamente menor en la población blanca hispana residente en Florida, comparada a la de blancos no hispanos (14). Respecto a linfoma no Hodgkin, ocupa el tercer puesto entre las neoplasias más comunes de la niñez y representa aproximadamente el 5 % de los cánceres en niños y jóvenes menores de 20 años de edad. La incidencia es de aproximadamente 1,0 a 1,5 por 100.000 habitantes. A pesar de que no hay una 2 edad específica de mayor ocurrencia, se presenta comúnmente en el segundo decenio de vida, y no es común en niños menores de 3 años de edad. El diagnóstico y la clasificación de los SLPC se basan en gran medida en criterios morfológicos, citoquímicos, histológicos e inmunohistoquímicos. Sin embargo, estas metodologías presentan un importante componente subjetivo, inclusive observándose discrepancias entre expertos, en una gran proporción de los casos. Desde hace unas décadas, con la aparición de los anticuerpos policlonales en principio, y monoclonales a posteriori, se han ensayado diversas técnicas de inmunofenotipificación de los SLPC. Actualmente, la citometría de flujo constituye una herramienta de gran utilidad, por su rapidez, precisión y alto grado de sensibilidad. Esta metodología constituye un criterio objetivo que ha sido integrada con otros parámetros clínicos, biológicos y morfológicos para arribar a un diagnóstico final (15). 2. Características inmunofenotípicas de las poblaciones linfoides El sistema linfoide está formado por los órganos linfoides primarios o centrales y los órganos linfoides secundarios o periféricos. En el hombre, la médula ósea y el timo desempeñan el papel de órganos primarios. Los linfocitos que maduran en la médula ósea se denominan linfocitos B y son los responsables de producir anticuerpos como respuesta a un estímulo antigénico. Los que maduran en el timo se denominan linfocitos T y son los responsables de las respuestas inmunes producidas por células. Los órganos linfoides secundarios corresponden a los ganglios linfáticos, el bazo, el tejido linfoide asociado a las mucosas, la piel y el tubo digestivo. En estos órganos, los linfocitos encuentran el ambiente adecuado para poder interaccionar con los antígenos y con las células accesorias del sistema linfoide o células presentadoras de antígenos. 2.1. Linfocitos B Los linfocitos B derivan de una célula germinal linfoide pluripotente y adquieren su competencia inmunológica en la médula ósea independientemente de la presencia de antígenos. Posteriormente, migran a órganos linfoides secundarios donde su diferenciación requiere la presencia de antígeno (16). 3 Durante la ontogenia, las variaciones del fenotipo se pueden esquematizar en las siguientes etapas: 1. Célula Precursora B: Estas células, denominadas por algunos autores células pre-pre B o células pro-B, expresan la molécula CD34, la enzima TdT y los antígenos HLA-DR, CD10, CD19, CD24. No poseen inmunoglobulinas de superficie, pero sí reordenamiento del gen de la cadena pesada μ que representa la primera indicación de compromiso con el linaje B. 2. Célula Pre B: En este estadio todavía existe TdT y el antígeno CD10 y es positivo para el CD34. Además, expresa los antígenos HLA-DR, CD19, CD24 y aparece el antígeno CD20 y la molécula especifica de linaje: CD22. Estas células también expresan CD79a, molécula que se asocia con las inmunoglobulinas de superficie. En este estadio pueden identificarse cadenas pesadas μ en el interior del citoplasma, en ausencia de cadenas livianas y de inmunoglobulinas de superficie. 3. Linfocito B inmaduro: A medida que la maduración progresa, se pierde el CD10, se reordenan los genes de las cadenas livianas que se transcriben, se sintetizan y ensamblan con las cadenas μ. La célula pasa a expresar IgM de superficie. 4. Linfocito B maduro: Expresa los antígenos de membrana CD19, CD20, CD21, CD22 y CD24 y las inmunoglobulinas de superficie IgM e IgD. La Figura 1 muestra la expresión de marcadores durante la diferenciación de los linfocitos B. Los linfocitos B maduros pasan de la médula ósea a la sangre periférica donde existe una subpoblación que expresa la molécula CD5. Posteriormente, migran a los órganos linfáticos inmunológicamente B dependientes. periféricos, ubicándose en las zonas 4 Figura 1. Expresión de marcadores durante la ontogenia normal de células B. En el ganglio, cuando los linfocitos B son activados por antígenos, maduran a células formadoras de anticuerpos y a estadios maduros de célula plasmática, o evolucionan a células de memoria (Figura 2). Las células B vírgenes específicas de antígeno colonizan el folículo linfoide y cuando son estimuladas por el antígeno se transforman en células blásticas constituyendo el centro germinal. Los blastos del centro germinal proliferan y se transforman en centroblastos que expresan en su superficie los antígenos CD20, CD79a y CD10. No expresan en su superficie los antígenos CD5, CD21, CD23 y en su citoplasma no se detecta expresión de cadenas livianas de Igs. Los centroblastos dan origen a los centrocitos que expresan en su superficie los antígenos CD20, CD79a y, al igual que los centroblastos, no expresan CD5, CD21, CD23, ni cadenas livianas de Igs en su citoplasma. Después de ser estimulados por antígenos presentados por las células dendríticas foliculares, los centrocitos se activan y abandonan los folículos secundarios quedando como células de memoria o como precursores de células 5 plásmáticas. Las células plasmáticas expresan los antígenos CD19, CD38 y CD138. Figura 2. Diferenciación de los linfocitos B en órgano linfoide central y en órganos linfoides periféricos. Adaptado de Jaffe ES, Lee Harris N, Stein H, Isaacson PG. Classification of lymphoid neoplasms: the microscope as a tool for disease discovery. Blood. 2008;112:4384-4399. AG: Antígeno. 2.2. Linfocitos T Los linfocitos T proceden de la célula progenitora linfoide ubicada en la médula ósea. Estas células cuando llegan al timo sufren un proceso de maduración y adquieren inmunocompetencia. Posteriormente abandonan el timo y pasan a la sangre periférica y a los órganos linfáticos secundarios, transformándose en linfocitos T funcionalmente maduros. La madurez se alcanza con la expresión en la membrana citoplasmática de los receptores de células T (RCT). Existen dos tipos, uno constituido por las cadenas α y β (presente en la mayoría de los linfocitos T periféricos) y otro formado por las cadenas γ y δ. Ambos receptores están asociados al complejo CD3. Las variaciones del fenotipo se pueden esquematizar en tres etapas (17): 1. Fase de timocito inmaduro o pretimocito cortical blástico: En este estadio, las células expresan la enzima TdT y los antígenos CD2, CD5 CD7, CD25, 6 CD45. Son negativos para los antígenos CD4 y CD8. En un período mas avanzado de timocito inmaduro, se expresa el CD3 en el citoplasma, pero no en la superficie. En esta fase se pueden detectar algunos marcadores de proliferación como el CD38 y el receptor de la transferrina. 2. Fase de timocito intermedio o pretimocito cortical pequeño: Se caracteriza por expresar los antígenos CD2, CD5, CD7, CD45 y por adquirir los antígenos CD4 y CD8. El complejo CD3-RCT se expresa en la superficie. 3. Fase de timocito maduro (medular): En este estadio se pierde la expresión de la enzima TdT y del CD1, expresa intensamente el complejo CD3-RCT y se diferencia en dos poblaciones, una que expresa el antígeno CD4 y otra el CD8, con expresión de CD2, CD5 y CD7. La Figura 3 muestra la expresión de marcadores durante la diferenciación de los linfocitos T. Figura 3. Expresión de marcadores durante la ontogenia T. 7 Todos los linfocitos maduros de la sangre periférica que emigran del timo expresan los siguientes antígenos: CD2, CD3, CD7, CD5 y CD45RA. Entre un 45 % y 65 % expresan la molécula CD4 y entre un 25 % y 35 % expresan el antígeno CD8. Los linfocitos T llegan con la sangre a los órganos linfoides periféricos, asentándose en localizaciones precisas: zona cortical profunda y área interfolicular de los ganglios linfáticos, manto periarteriolar de la pulpa blanca del bazo, áreas interfoliculares de las placas de Peyer del intestino y órganos linfoides bucofaríngeos (Figura 4). Figura 4. Diferenciación de los linfocitos T en órgano linfoide central y en órganos linfoides periféricos. Adaptado de Jaffe ES, Lee Harris N, Stein H, Isaacson PG. Classification of lymphoid neoplasms: the microscope as a tool for disease discovery. Blood. 2008;112:4384-4399. AG: antígeno, TFH: Células folicular dendrítica. 2.3. Células NK Los Linfocitos Grandes Granulares (LGG) constituyen < 5 % de las células mononucleares de sangre periférica. Existen dos poblaciones celulares fenotípicamente distintas de estas células: una CD3 positiva y otra CD3 negativa. Los LGG CD3 negativos son las auténticas células NK. 8 Las células NK se desarrollan a partir de una célula madre hematopoyética CD34+ en la médula ósea que se diferencia a progenitores mieloides y progenitores linfoides. El progenitor linfoide se diferencia a células B, células dendríticas, células T y células NK (Figura 5) (18,19). Figura 5. Desarrollo de las células NK. Tomado de Oshimi K. Progress in understanding and managing natural killer-cell malignancies. Br J Haematol 2007;139(4):532-44. La diferenciación NK ocurre a través de los siguientes estadios de diferenciación: estadio 1 o célula progenitora NK (pro-NK), estadio 2 o célula precursora NK (pre-NK), estadio 3 o célula inmadura comisionada NK (NK inmadura), estadio 4 o células NK madura con expresión intensa de CD56 y estadio final 5 o células NK madura con expresión débil de CD56. Las células del estadio 1 y estadio 2 también pueden diferenciarse en células T y células dendríticas y por ello son progenitores comunes tripotenciales T/NK/células dendríticas (20). Para el desarrollo de células NK, las células progenitoras linfoides circulan en sangre periférica y pasan a los nódulos linfáticos a través de las vénulas endoteliales altas ubicándose en el espacio parafolicular. Aquí las células progenitoras NK son activadas progresando a través de los distintos estadios de maduración. Las células NK maduras (estadio 5) retornan a 9 circulación por el linfático eferente mientras que las células NK maduras (estadio 4) quedan dentro de tejido linfoide secundario para interaccionar con las células dendríticas (21). Las células NK maduras (estadio 4) se caracterizan por expresar intensamente el antígeno CD56 y en menor intensidad el CD16. Además expresan CD2 y CD7. No expresan CD3, CD5 ni RCT. 3. Linfomagénesis Los linfomas derivan de células linfoides que se encuentran en distintas etapas de su desarrollo en órganos linfoides secundarios y que conservan las características biológicas de su contraparte celular normal. El análisis molecular de los genes de las inmunoglobulinas o del RCT permitió determinar errores en la recombinación de distintos segmentos de estos genes que pueden causar traslocaciones cromosómicas aberrantes y, que por lo general, se encuentran yuxtapuestas a una variedad de oncogenes (22,23). De este modo, se pudo establecer el origen de la célula linfomatosa, y por lo tanto de los distintos tipos de linfomas B, en términos de su ubicación pre centro germinal, centro germinal o post centro germinal (24) (Figura 6). La linfomagénesis es gobernada, además, por mutaciones somáticas en varios genes que normalmente intervienen en la regulación del ciclo celular, apoptosis, diferenciación celular, transducción de señales y otros procesos biológicos vitales. Por último, factores exógenos y genéticos que producen señales positivas para la supervivencia y proliferación celular pueden tener un rol importante en la linfomagénesis. 10 4. 5. Figura 6. Origen de distintos tipos de linfomas B a nivel del ganglio linfático. 4. Clasificación de los Síndromes Linfoproliferativos Crónicos Los SLPC engloban a los linfomas no Hodgkin y al linfoma de Hodgkin. Los primeros comprenden una serie de entidades que pueden cursar con una importante expresión sanguínea y corresponden a la concepción clásica de SLPC con expresión periférica. La clasificación de los linfomas no Hodgkin ha sido, desde finales de la década de 1970 hasta finales de la década de 1990, uno de los campos de debate científico más intenso. La falta de acuerdo entre patólogos americanos y europeos tuvo como consecuencia la frustración en los clínicos que debían tratar a los enfermos. 11 En 1966, Rappaport (25), publicó una clasificación basada en criterios citológicos y arquitecturales, pero con la novedad de que trataba de proporcionar criterios pronósticos. En 1974, dos norteamericanos, Lukes y Collins (26), publicaron su clasificación funcional de los linfomas no Hodking, la cual presentaba la novedad de subdividir los linfomas en función de su fenotipo B o T, y de clasificarlos en función de su histogénesis. En el mismo año, un grupo de patólogos europeos, liderados por Lennert (27), publicó el primer esbozo de la que sería conocida posteriormente como clasificación de Kiel (28). Primero era citológica y arquitectural, posteriormente incorporó el inmunofenotipo. La clasificación de Kiel, aunque muy parecida conceptualmente a la de Lukes y Collins, difería de la misma en la nomenclatura y en que estratificaba los LNH en grados de malignidad. La falta de acuerdo entre las dos escuelas (Americana y Europea) condujo a que en 1982, el Instituto Nacional del Cáncer de Estados Unidos promoviera una clasificación de consenso conocida como Working Formulation (29). Esta clasificación estratificaba las entidades en grados de malignidad, y estaba basada en criterios citológicos y arquitecturales pero no tenia en cuenta la histogénesis. Fue considerada, por muchos patólogos como un paso atrás conceptual, pero fue aceptada, por la mayoría de los clínicos como una vía para lograr un “lenguaje común”. En 1994, un segundo intento de consenso dio lugar a la clasificación propuesta por el Grupo internacional de estudio del linfoma denominada REAL (Revised European American Classification of Lymphoid Neoplasms) y basada en la identificación de entidades clínico-patológicas y adoptada de manera progresiva por los patólogos y clínicos (30). La clasificación REAL estratifica a las neoplasias hematológicas en función del linaje: mieloide, linfoide, células histiociticas/dendríticas y células cebadas. En cada linaje, las distintas entidades se definen en función de una serie de características morfológicas, inmunofenotipicas, moleculares y clínicas. No se distribuyen en grupos en función de su grado de malignidad, pero si de pronósticos favorables o desfavorables. Por iniciativa de la Organización Mundial de la Salud (OMS), las sociedades Americana y Europea de Hematopatología, junto con la participación de hematólogos y oncólogos de todo el mundo, reeditaron las entidades descritas en la clasificación REAL, y de esta manera, en el año 2001 surgió la clasificación de la OMS (Tablas I y II) (31). 12 Tabla I: Clasificación de las neoplasias de células B según la OMS. Neoplasias de precursores de células B Leucemia/ linfoma linfoblástico de células precursoras B Neoplasias de células B maduras Leucemia linfocítica crónica/linfoma de linfocitos pequeños Leucemia prolinfocitica de células B Linfoma linfoplasmocítico/macroglobulinemia de Waldenström Linfoma de células B de la zona marginal esplénica Leucemia de células vellosas Neoplasias de células plasmáticas: Mieloma de células plasmáticas Plasmocitoma Enfermedades con depósito monoclonal de Inmunoglobulinas Enfermedades de cadenas pesadas Linfoma de células B de la zona marginal extranodal (MALT) Linfoma de células B de la zona marginal nodal Linfoma folicular Linfoma de células del manto Linfoma difuso de células B grande Linfoma de células B grande mediastinico (tímico) Linfoma de células B grande intravascular Linfoma primario de los derrames Linfoma/leucemia de Burkitt Granulomatosis linfomatoide Tabla II: Clasificación de las neoplasias de células T y NK según la OMS. Neoplasias de células precursoras T Leucemia / linfoma linfoblástico de células precursoras T. Neoplasias de células T/NK madura Leucemia prolinfocítica de células T Leucemia linfocitica de células T grandes granulares Leucemia agresiva de células NK Linfoma/leucemia de células T del adulto Linfoma de células T/NK extranodal, de tipo nasal Linfoma de células T, de tipo enteropático Linfoma de células T hepatosplénico Linfoma de células T subcutáneo seudopaniculítico Linfoma blástico de células NK Micosis fungoide/síndrome de Sézary Procesos linfoproliferativos de células T CD30+, primarios cutáneos: Linfoma anaplásico de células grandes, primario cutáneo Papulosis linfomatoide Lesiones borderline Linfoma de células T angioinmunoblástico Linfoma de células T periféricas, sin especificar Linfoma anaplásico de células grandes T 13 La última modificación de esta clasificación fue realizada en el año 2008 (32). En esta clasificación sólo se reconocen enfermedades con características morfológicas y clínicas diferenciales. Las variaciones del grado histológico o de agresividad de una misma enfermedad no se reconocen como enfermedades distintas. Asimismo, a la localización anatómica de los distintos linfomas se le da mucha relevancia. Dentro de las categorías de células B y células T y NK, se reconocen dos subdivisiones: neoplasias de precursores, que corresponden a los estadios más tempranos de diferenciación y neoplasias de células maduras. 5. Características inmunofenotípicas de SLPC con expresión periférica. 5.1. Linfomas de células B 5.1.1. LLC/linfoma de linfocitos pequeños La LLC B es una enfermedad caracterizada por la proliferación y acumulación de linfocitos de pequeño tamaño y aspecto maduro (Figura 7). Figura 7. Frotis de sangre periférica de una leucemia linfática crónica B. Archivo personal. La LLC podría tener un doble punto de partida: unas procederían de linfocitos ubicados en el manto perifolicular (linfocitos B vírgenes) y otras se originarían en los linfocitos con memoria, que han experimentado hipermutaciones 14 somáticas de las regiones variables del gen de las cadenas pesadas de inmunoglobulinas, a su paso por el centro germinal. El fenotipo de los linfocitos de la LLC-B se caracteriza por la expresión de los diversos antígenos pan-B (CD19, CD20, CD79b e inmunoglobulinas de superficie) y la coexpresión de CD5/CD19 y CD23/CD20 con negatividad para CD10 y FMC7. Las inmunoglobulinas de superficie son de fenotipo IgM ó IgM+IgD y sus cadenas ligeras son kappa o lambda, lo que indica su monoclonalidad. La LLC-B tiene un perfil inmunofenotípico muy característico, pero ningún marcador le es absolutamente específico, por lo que algunos autores (33) han elaborado un sistema de puntuación a base de la utilización de cinco marcadores, valorando su presencia o ausencia así como su intensidad de expresión (CD5, CD23, FMC-7, Igs, CD22), que resulta útil para diferenciar la LLC-B de otros procesos linfoproliferativos B con expresión leucémica y que ha sido mejorado con la incorporación del anticuerpo monoclonal CD79b (34). La aplicación de este sistema de puntuación demostró que la LLC-B oscila entre 3 y 5 puntos (en la mayoría 4 o 5), mientras que los demás SLPC-B puntúan por debajo de 3. Las formas atípicas de LLC tienen un fenotipo menos característico de LLC ya que la expresión de CD20, CD22, FMC7 es más intensa, la de CD23 es más débil y la de CD5 débil o ausente (35). 5.1.2. Leucemia prolinfocítica B La leucemia prolinfocítica B resulta de una expansión de un linfocito B maduro en un estadio de diferenciación probablemente intermedio entre el linfocito de la LLC y el de la tricoleucemia y/o célula linfoplasmática. La clave diagnostica de esta enfermedad es la presencia de prolinfocitos (más del 55%). Estas células se caracterizan por tener mayor tamaño que el linfocito de la LLC, moderada basofilia citoplasmática, cromatina condensada y nucleolo central prominente (Figura 8.). 15 Figura 8. Frotis de sangre periférica de una leucemia prolinfocítica B. Archivo personal. Aunque de apariencia morfológica más inmadura que el linfocito de la LLC, el prolinfocito presenta características antigénicas de mayor grado de diferenciación: inmunoglobulinas de superficie de alta intensidad de tipo IgM e IgD y mayor expresión de los antígenos FMC7, CD19, CD20, CD22, CD79a y CD79b (36). Son, asimismo, CD23, CD11c y CD103 negativos. La expresión de CD5, CD10 y CD25 es muy débil o ausente. 5.1.3. Linfoma linfoplasmocítico Este linfoma se origina a partir de un linfocito B post-folicular y previo a la etapa de célula plasmática. Cuando hay expresión hemoperiférica, pueden observarse linfocitos pequeños y los típicos linfoplasmocitos e incluso células plasmáticas (Figura 9). Figura 9. Sangre periférica de un linfoma linfoplasmocítico leucemizado. Tomado de Woessner S y Florensa L. La citología óptica en el diagnóstico hematológico. Pág. 456. 4ta Ed. Ed. Acción Médica. Madrid. 2000. 16 El comportamiento inmunofenotípico es algo heterogéneo y el diagnóstico diferencial debe plantearse con la LLC y sobre todo con el linfoma de Zona Marginal Esplénica. La célula neoplásica muestra inmunoglobulina de superficie y marcadores pan-B, pero lo más característico es la presencia de inmunoglobulina intracitoplasmática, generalmente de tipo IgM (37). El CD5 y el CD23 son negativos, pero si predominan las características linfoplasmocitoides puede ser CD5 positivo. Suelen ser FMC7 y CD22 positivos de forma intensa y, asimismo, pueden expresar CD38, CD138 y otros marcadores de línea plasmocelular. 5.1.4. Linfomas B de la zona marginal Los linfomas de la zona marginal, según la clasificación de la OMS, incluyen tres entidades: 1) el linfoma de la zona marginal esplénica con o sin linfocitos vellosos circulantes, 2) el linfoma de la zona marginal asociado a mucosas (tipo MALT) y 3) el linfoma de la zona marginal ganglionar con o sin células B monocitoides. El linfoma de la zona marginal esplénica con o sin linfocitos vellosos circulantes se leucemiza con frecuencia mientras que los otros dos tipos lo hacen de forma excepcional. El linfoma de zona marginal leucemizado presenta una linfocitosis con linfocitos circulantes de aspecto velloso que generalmente superan el 30 % de todos los linfocitos (Figura10). Figura 10. Linfoma esplénico con abundantes linfocitos vellosos. Tomado de Woessner S y Florensa L. La citología óptica en el diagnóstico hematológico. Pág. 458. 4ta Ed. Ed. Acción Médica. Madrid. 2000. 17 Desde el punto de vista inmunofenotípico, las células neoplásicas expresan intensamente inmunoglobulina de superficie y positividad para los antígenos CD19, CD20, CD22, CD24, CD79b y FMC-7. Son CD23, CD25 y CD10 negativas (38). En la mayoría de los casos con CD5 negativas, mientras que la expresión de CD11b es variable. 5.1.5. Leucemia de células vellosas (Tricoleucemia) La Tricoleucemia constituye una proliferación clonal de linfocitos B tardíos, post-foliculares y con baja actividad proliferativa a pesar de presentar un fenotipo activado. El hallazgo diagnóstico clave en esta enfermedad es la presencia de tricoleucocitos circulantes que son células grandes, en las que se destacan finas prolongaciones citoplasmáticas (pelos) (Figura 11). El núcleo es excéntrico, con forma variable y cromatina de aspecto esponjoso mientras que el citoplasma es amplio y azulado. Figura 11. Frotis de sangre periférica de una tricoleucemia. Archivo personal. Los tricoleucocitos expresan con gran intensidad inmunoglobulina de superficie con un solo tipo de cadena ligera. Además, expresan una intensa reacción con el CD19, CD20, CD22, CD11c, CD103, CD25, CD79a y FMC7 (39). Muestran negatividad para CD5, CD10 y CD23. El diagnóstico diferencial de la tricoleucemia se debe realizar con la tricoleucemia variante y la leucemización del linfoma esplénico con linfocitos vellosos. Además de las características clínicas y morfológicas diferenciales, la tricoleucemia variante no expresa CD25 y débilmente CD24 y CD79b (40). El linfoma esplénico con linfocitos vellosos se 18 caracteriza por la ausencia de CD103 y la casi constante positividad para CD11c (40). 5.1.6. Linfoma folicular El linfoma folicular es una neoplasia derivada de los linfocitos B del centro germinal del folículo linfoide que han experimentado hipermutaciones de los genes que codifican la región variable de las cadenas pesadas de las inmunoglobulinas y del oncogen BCL-2. En el centro del folículo se distinguen dos tipos de células linfoides B, unas de núcleo hendido y otras de núcleo no hendido; ambas pueden ser de pequeño y gran tamaño (Figura 12). El inmunfenotipo revela intensa expresión de inmunoglobulina de superficie, principalmente IgM o IgD, Expresan los antígenos HLA-DR, CD19, CD20, CD21, CD22 y CD79b. No expresan CD5, CD43 ni CD11c y ocasionalmente pueden ser positivos para el CD23 (41). Los centroblastos expresan CD10. Figura 12. Linfoma folicular leucemizado de tipo centrocítico (izquierda) y de tipo centroblástico (derecha). Tomado de Woessner S y Florensa L. La citología óptica en el diagnóstico hematológico. Pág. 473. 4ta Ed. Ed. Acción Médica. Madrid. 2000. 5.1.7. Linfoma de células del manto El origen de este linfoma es la zona del manto folicular; este tipo de linfoma parte de una célula prefolicular virgen localizada en los folículos primarios o en la zona del manto de los folículos secundarios. La célula linfomatosa observada en 19 sangre periférica es polimorfa en lo que se refiere al tamaño celular y a la irregularidad del contorno celular (Figura 13). El tamaño celular es más bien pequeño y el núcleo posee una cromatina de aspecto punteado muy característico con 1 o 2 hendiduras poco profundas. El nucleolo es pequeño y el citoplasma escaso. Figura 13. Frotis de sangre periférica de un linfoma de células del manto. Archivo personal. Fenotípicamente, las células inmunoglobulina de superficie linfomatosas expresan con intensidad IgM e IgD. Son positivas para los antígenos CD79b, CD20, CD22, CD43, FMC7, con coexpresión de CD5/CD19 y sobreexpresión de Ciclina D1 (42). Son negativas para CD23 y CD10. 5.1.8. Linfoma de Burkitt Este linfoma se caracteriza por la proliferación de blastos de aspecto muy monomorfo, de mediano tamaño con cromatina laxa con varios nucleolos y citoplasma intensamente basófilo con abundantes vacuolas (Figura 14). Figura 14. Linfoma de Burkitt. Célula con intensa basofilia y vacuolas en el citoplasma. Archivo personal. 20 La detección de mutaciones en el rearreglo de genes de la región variable de la inmunoglobulina indica que este linfoma se origina en una célula B del centro germinal (43). Desde el punto de vista del inmunofenotipo, estas células presentan positividad para los antígenos CD19, CD20, CD21, CD22, CD79b y CD10. Son negativas para CD5, CD23 y TdT. Suelen expresar inmunoglobulina M de superficie de carácter clonal. Las células son intensamente proliferativas lo que se evidencia por la intensa positividad del Ki67. La Tabla III resume las principales características inmunofenotípicas de los SLPC-B con expresión periférica. Tabla III. Inmunofenotipo diferencial de los SLPC-B. Enfermedad Igs CD5 CD10 CD11c CD19 CD20 CD22 CD23 CD25 FMC7 LLC-B -/+ ++ +/+ + -/+ ++ +/LPL-B ++ -/+ + + + -/+ ++ LLP -/+ -/+ + + + + -/+ LZM ++ -/+ + + + -/+ + TC ++ ++ + + ++ ++ ++ LF ++ + -/+ + + + +/-/+ +/LM ++ + -/+ + + + -/+ -/+ LB + + + + + LLC-B: leucemia linfática crónica B; LPL-B: leucemia prolinfocítica B; LLP: linfoma linfoplasmocítico; LZM: Linfoma B de zona marginal; TC: tricoleucemia; LF: linfoma folicular; LM: linfoma de células del manto; LB: linfoma de Burkitt. 5.2. Linfomas de células T y células NK 5.2.1. Leucemia prolinfocítica T Aunque muchas veces los prolinfocitos T son indistinguibles de los prolinfocitos B, pueden presentar rasgos diferenciales como: menor tamaño, contorno más irregular con protrusiones, basofilia citoplasmática mas intensa, núcleo discretamente convoluto y nucleolo menos prominente (Figura 15). Figura 15. Leucemia prolinfocítica T. Tomado de Woessner S y Florensa L. La citología óptica en el diagnóstico hematológico. Pág. 484. 4ta Ed. Ed. Acción Médica. Madrid. 2000. 21 El inmunofenotipo de los prolinfocitos T se caracteriza por la expresión de CD2, CD5 y CD7. La expresión de CD3 puede ser débil o ausente lo que sugiere que estas células están en un estadio intermedio entre células tímicas y posttímicas (44). Algunos casos expresan CD25 y carecen de expresión de RCT-αβ en la membrana. Aunque generalmente son CD4+ CD8-, hay casos CD4+ CD8+ y CD4- CD8+. Carecen de reactividad para marcadores asociados con acitividad citotóxica y HLA-DR. 5.5.5. Leucemia linfocítica de células grandes granulares Desde el punto de vista citomorfológico, las células de estos linfomas son de tamaño grande, con un núcleo de cromatina madura sin nucleolo visible, de contorno redondo u oval y de situación excéntrica; el citoplasma es amplio, de tonalidad azul celeste o aspecto hialino y como rasgo morfológico más distintivo presenta varios gránulos azurófilos distribuidos irregularmente por todo el citoplasma (Figura 16). Figura 16. Leucemia de linfocitos grandes granulares. Tomado de Woessner S y Florensa L. La citología óptica en el diagnóstico hematológico. Pág. 489. 4ta Ed. Ed. Acción Médica. Madrid. 2000. De acuerdo al fenotipo, se reconocen dos variantes de leucemia de células grandes granulares: 1) T-citotóxica y 2) de células NK. La leucemia de células T grandes granulares es una anomalía clonal de células grandes granulares derivadas de linfocitos T post-tímicos, CD3 positivos, inmunocompetentes. Los linfocitos grandes granulares de fenotipo T, presentan un fenotipo maduro postímico: CD3+ y RCT-αβ+. En el 80% de los casos son CD8+ (el resto de los casos CD4+CD8-, CD4+CD8+ y CD4- CD8-). Además expresan CD2, CD16 y CD57 (45). Son negativos para CD56, CD5, CD25. Las neoplasias de células NK maduras que se reconocen son: el linfoma de células NK extranodal tipo nasal, la leucemia de células NK agresiva y la 22 linfocitosis de células NK crónica (46). Los linfocitos grandes granulares de fenotipo NK expresan el siguiente fenotipo: CD2+, CD3-/cCD3+, CD16+/CD56+/CD57+/- (47,48). El gen del RCT está en configuración en línea germinal. 5.2.2. Micosis fungoide/síndrome de Sézary La micosis fungoide es un proceso fundamentalmente dermatológico y la enfermedad se define por la presencia de las células de Lutzner, de aspecto cerebriforme y tamaño relativamente pequeño (Figura 17). Figura 17. Células de Lutzner y Sézary. Tomado de Woessner S y Florensa L. La citología óptica en el diagnóstico hematológico. Pág. 492. 4ta Ed. Ed. Acción Médica. Madrid. 2000. Con respecto al síndrome de Sézary, la mayor parte de los autores lo considera la variante leucémica de la micosis fungoide y desde el punto de vista fenotípico, las células de Sézary son CD3+, CD4+, CD8-, CD25-/+, CD26-, CD30/+, y CD7- en la mayoría de los pacientes (49). La Tabla IV resume las principales características inmunofenotípicas de los SLPC-T y NK con expresión periférica. Tabla IV. Inmunofenotipo diferencial de los SLPC-T Enfermedad CD2 CD3 CD5 CD7 CD25 CD11b CD16 CD56 CD4 CD8 LPL-T ++ + ++ ++ -/+ + LCGG-T ++ + -/+ -/+ ++ LCGG-NK + + -/+ + + + -/+ MF/SZ ++ + ++ -/+ -/+ -/+ + LPL-T: leucemia prolinfocítica T; LCGG-T: linfoma de células grandes granulares-T; LCGG-NK: linfoma de células grandes granulares-NK; MF/SZ: micosis fungoide/síndrome de Sézary. 23 6. OBJETIVOS La moderna clasificación y diagnóstico de los SLPC sería imposible sin tener en cuenta la expresión antigénica que identifica el linaje y estadio madurativo celular. La inmunofenotipificación de los SLPC a través de la citometría de flujo contribuye a un diagnóstico más objetivo y con certeza en la gran mayoría de estas entidades clínicas. Estos datos unidos a otros parámetros (clínicos, histológicos, citológicos, de biología molecular, etc.) aseguran la elección de la conducta terapéutica adecuada. Además, permite hacer comparaciones geográficas confiables y analizar factores ambientales y/o genéticos fuertemente sospechosos de estar asociados con la patogénesis de estos procesos neoplásicos. Por ello, los objetivos de este Trabajo Final de Especialización son: General Caracterizar el perfil inmunofenotípico de SLPC con expresión hemoperiférica diagnosticados en el Laboratorio de Citometría de Flujo de la Fundación para el Progreso de la Medicina de la ciudad de Córdoba en el periodo 2005-2010. Específicos Determinar la prevalencia de los SLPC con expresión hemoperiférica Analizar la expresión, co-expresión y/o expresión aberrante de marcadores inmunofenotípicos Establecer asociaciones entre SLPC y grupo etario MATERIALES Y MÉTODOS 24 7. MATERIAL Y MÉTODOS Tipo y diseño general del estudio: Se realizó un estudio de tipo descriptivo, retrospectivo y transversal. Ámbito de estudio: Este estudio se llevó a cabo en el laboratorio de Citometria de Flujo de la Fundación para el Progreso de la Medicina cito en calle 9 de Julio 941, Alberdi, Córdoba. Ubicación en el tiempo: Período de 2005-2010. Pacientes: Se incluyeron a 120 pacientes con distintos SLPC (67 mujeres y 53 varones) con un rango de edad que osciló entre 39 y 90 años. Muestras: Se incluyeron muestras de sangre periférica ó médula ósea anticoaguladas con EDTA que fueron obtenidas en la Fundación para el Progreso de la Medicina o que fueron derivadas de distintas instituciones asistenciales. En cada caso, se registraron datos personales como edad y sexo. Evaluación citomorfológica: Los extendidos de sangre periférica o de médula ósea fueron coloreados con May Grünwald–Giemsa y observados al microscopio con distintos aumentos. Fenotipificación: El estudio inmunofenotipico se realizó por inmunofluorescencia directa de tres colores con un panel de Anticuerpos Monoclonales (AcMo) que detectan antígenos específicos de linfocitos B, T y NK. Todos los anticuerpos fueron de Immunotech o Dako. Los anticuerpos estuvieron conjugados con los siguientes fluorocromos: isotiocianato de fluoresceína (primer fluorocromo), ficoeritrina (segundo fluorocromo) y PerCP (tercer fluorocromo). El primer panel de anticuerpos que se utilizó incluyó: CD5, CD19, CD23, CD20, CD10, CD11c, CD22, CD38, HLA-DR, CD34, FMC-7, anti-kappa, anti-lambda y CD45. Si la morfología sugería la presencia de células vellosas, se utilizaron los Ac Mo CD11c, CD25 y CD103 y si lo era a células plasmáticas CD38/CD138 y CD3/CD56. Si el inmunofenotipo con el primer panel demostró un origen T, se completó el estudio con los siguientes Ac Mo: CD2, CD3, CD4, CD7, CD8 y CD56. Los AcMo estaban conjugados con Isotiocianato de Fluoresceína (FITC) y con Ficoeritrina (PE). El análisis se realizó mediante citometría de flujo en un citómetro Coulter Epics XL analizando la reactividad con los Ac Mo en la ventana de la población patológica. Para cada tubo, 25 ul de sangre entera fueron incubados con 4 ul de 25 cada Ac Mo durante 15 minutos a temperatura ambiente y en oscuridad. Luego de la incubación, los eritrocitos fueron lisados con cloruro de amonio 1 % durante 5 minutos en frío. Inmediatamente después de la lisis, las células fueron analizadas en el citómetro. Para ello, fueron adquiridos entre 5.000 y 10.000 eventos en cada tubo. Un marcador se consideró positivo si un porcentaje superior al 20% de la población analizada expresó el antígeno. Se realizó un análisis multiparamétrico de las distintas poblaciones celulares basado en las propiedades morfológicas: Forward Scatter (FSC) y Side Scatter (SSC) y en la intensidad de fluorescencia. En éste último caso, se analizó la población celular en cada cuadrante de los histogramas de la siguiente manera: cuadrante inferior de la izquierda: doble negativo para ambos marcadores, cuadrante inferior de la derecha: positivo para el marcador del eje X, cuadrante superior izquierdo: positivo para el marcador del eje Y y cuadrante superior derecho: positivo para ambos marcadores. Los controles de la reacción consistieron en la sustitución del Ac Mo conjugados con una Inmunoglobulina de ratón sin especificidad y con el mismo isotipo que el Ac Mo. Análisis estadístico: Para comparar variables cualitativas se utilizó la prueba exacta de Fisher y la de 2. Para comparar variables cuantitativas en dos grupos se utilizó la prueba t de Student o la de Mann Whitney. Un valor de p<0,05 fue considerado estadísticamente significativo. RESULTADOS 26 8. RESULTADOS Características demográficas: La frecuencia de SLPC fue mayor en mujeres que en varones (56 % vs 44 %, p<0,05). La relación mujer/varón fue de 1,26. La edad media en varones fue de 65 años y en mujeres de 71 años. La Tabla V muestra la frecuencia de los SLPC según grupo etario. El 79 % de los pacientes tuvo una edad igual o mayor a 60 años. Tabla V. Distribución de los SLPC según rango etario. Edad Frecuencia (años) (%) 30 – 40 2 41 - 50 8 51 – 60 16 61 – 70 28 71 – 80 33 > 80 13 Perfil inmunofenotípico de los SLPC: De acuerdo a la expresión de antígenos de superficie, el 92 % de los SLPC fueron de estirpe B, el 7,5 % de estirpe T y el 0,8 % de estirpe NK. Entre los SLPC-B, la LLC fue la más frecuente (54 %) seguida por la LPL y MM (10 % y 10 %); los demás subgrupos comprendieron el 26 % (Figura 18). 10% LPL 10% 4% MM LF LZM 54% 9% 7% 6% LM TC LLC Figura 18. Distribución de linfomas de estirpe B en 120 pacientes con SLPC. Entre los SLPC-T/NK, la más frecuente fue la LPL-T (70%) (Figura 19). 27 10% 10% LPL LLGG-T LLGG-NK 10% MF 70% Figura 19. Distribución de linfomas de estirpe T/NK en 120 pacientes con SLPC. Cuando se consideró el sexo, tanto los SLPC-B como los SLPC-T fueron más frecuentes en mujeres. El único linfoma NK estuvo presente en una mujer. La Tabla VI muestra la distribución de los tipos de SLPC según el fenotipo celular en varones y mujeres. Tabla VI. Distribución de los inmunofenotipos de SLPC según sexo. Inmunofenotipo Linfoma Fenotipo B Fenotipo T Fenotipo NK Total n (%) 110 (92) 9 (7,5) 1 (0,8) Varones n (%) 50 (45) 3 (33) 0 (0) Mujeres n (%) 60 (55) 6 (67) 1 (100) Cuando se consideró la edad, tanto en SLPC-B como en SLPC-T la edad de las mujeres (72 vs 73 años) y varones (65 vs 57 años) fue similar. Características inmunofenotípicas de los SLPC-B LLC-B: fue el más frecuente de los SLPC-B (59/110). En sangre periférica, los linfocitos maduros se caracterizaron por su pequeño tamaño y núcleo redondo con cromatina condensada (Figura 20). 28 Figura 20. Características morfológicas de linfocitos de sangre periférica de un caso de LLC-B. La población linfoide clonal osciló entre 60 % y 85 % (Figura 21). A B (80%) Figura 21. A) Histograma de distribución de la población linfoide neoplásica según dispersión de la luz láser y B) Histograma de la expresión de cadena liviana /CD19. FS: Forward scatter, SS: Side scatter. PE: ficoeritrina, FITC: isotiocianato de fluoresceína. La reactividad con los distintos marcadores se muestra en la Tabla VII. Estos hallazgos demuestran que el fenotipo más común de la LLC-B fue: HLADR+, CD19+, CD5+, CD23+, FMC7-, CD10-, CD20+/- y CD22-/+. En el 71 % de los casos se detectó co-expresión de CD5/CD19. 29 Tabla VII. Expresión de antígenos de superficie en la LLC-B. Antígeno Positividad/No pacientes Porcentaje (%) HLA-DR 34/34 100 CD19 56/58 97 CD5 49/58 84 CD23 48/59 81 CD20 40/59 68 CD38 20/59 34 CD11c 14/58 24 CD22 12/59 20 FMC7 1/31 3 CD10 0/59 0 La Figura 22 muestra histogramas que permitieron la caracterización inmunofenotípica de un caso de LLC-B. A B 27 % C Figura 22. A) Histograma que muestra la co-expresión CD5/CD19, B) Histograma que muestra la co.expresión CD23/CD20 e C) Histograma que muestra la falta de expresión de FMC-7 en un caso de LLC-B. FITC: isotiocianato de fluoresceína; PE: ficoeritrina. 30 LPL-B: fue SLPC-B que siguió en orden de frecuencia. Los prolinfocitos se caracterizaron por ser de tamaño mayor que los linfocitos de la LLC-B, con una cromatina nuclear moderadamente condensada y un nucléolo visible (Figura 23). Figura 23. Características morfológicas de prolinfocitos en sangre periférica de un caso de LPL-B Las células neoplásicas se caracterizaron por expresar HLA-DR, CD19, CD20, FMC-7, CD22 con ausencia de expresión de CD5 y CD23. La Figura 24 muestra el histograma de la expresión de CD19 con ausencia de CD5 y el histograma de la expresión de CD22 en un caso de LPL-B. A B Figura 24. A) Histograma que muestra la expresión de CD19 y ausencia de CD5 y B) Histograma que muestra la expresión de CD22 en un caso de LPLB. FITC: isotiocianato de fluoresceína; PE: ficoeritrina. 31 MM: tuvo una prevalencia similar a la LPL-B (10 %). La Figura 25A muestra la citomorfología de médula ósea de un caso de MM donde se observa la morfología típica de las células plasmáticas. La citometría de flujo permitió determinar que estas células expresaban CD38, CD138 y CD56 con débil expresión de CD45 (Figura 25B). La ausencia de expresión de HLA-DR fue detectada en el 89 % de los casos, mientras que en todos hubo falta de expresión de CD19 y CD20. B A Figura 25. A) Infiltración de la médula ósea por células plasmáticas en un paciente con MM y B) Histograma de la coexpresión CD138/CD38. LZM: Las células neoplásicas fueron de tamaño pequeño a mediano con un núcleo de cromatina punteada y ocasional nucleolo pequeño. En algunos casos se observaron pequeñas hendiduras en el núcleo. El citoplasma fue escaso o mediano (Figura 26). Figura 26. Características morfológicas de las células linfoides de sangre periférica de un caso de LZM. El fenotipo de las células neoplásicas se caracterizó por ausencia de CD5, CD10 y CD23 con expresión de FMC-7, CD19, CD20 y CD22. 32 TC: La Figura 27 muestra la morfología característica de los linfocitos de sangre periférica en los casos de TC: proyecciones vellosas del citoplasma, núcleo redondo y pequeño con cromatina condensada. Figura 27. Morfología de un tricoleucocito de un caso de TC. En la Tabla VIII se muestra la expresión de distintos antígenos de superficie en los 8 pacientes con TC. Como puede observarse, la principal característica fenotípica de los tricoleucocitos fue la falta de expresión de CD5 y CD10 asociada a la expresión de CD19, CD20, CD22, CD25, CD11c y CD103. Tabla VIII. Inmunofenotipos de los tricoleucocitos de 8 pacientes con TC. Paciente 1 2 3 4 5 6 7 8 CD5 - CD19 ++ ++ + + +/+/++ ++ CD23 + ND + CD20 ++ ++ + + + + ++ ++ CD10 - CD11c ++ ++ ++ ++ + + ++ + CD22 ++ ++ + + + + ++ ++ FMC-7 ND ND ND +/+/+ + + CD103 + + +/+/+ + ++ + CD25 ++ ++ +/+/+ + + ND: no determinado D LM: En sangre periférica se observaron linfocitos de pequeño tamaño y núcleo redondo junto a linfocitos de tamaño mediano con núcleo irregular, cromatina más dispersa y citoplasma más amplio. Estas células se caracterizaron fundamentalmente por la expresión de CD22, la coexpresión de CD5/CD19 con ausencia de CD23 y CD10. La Figura 28 muestra la morfología de las células linfoides en sangre periférica e histogramas de un caso de LM. 33 B A C Figura 28. A) Características citomorfológicas de las células linfoides de un caso de LM, B) Histograma que muestra la coexpresión de CD5/CD19 y C) Histograma que muestra la expresión de CD20 y ausencia de CD23 en un caso de LM. FITC: isotiocianato de fluoresceína; PE: ficoeritrina. LF: El material remitido para el estudio inmunofenotípico no permitió realizar la evaluación citomorfológica. En cuanto al inmunofenotipo, se detectó que un solo paciente evidenció un fenotipo característico: CD10+, CD19+, CD20+, CD22+ y HLA-CD+. Con el objeto de determinar el valor diagnóstico de la expresión de distintos antígenos en los SLPC-B, se analizaron las siguientes expresiones: CD23/FMC-7 y CD5/CD10. La Tabla IX muestra la expresión de los antígenos CD23 y FMC-7 en los SLPC-B incluidos en este trabajo. La LLC-B se caracterizó por ser CD23+/FMC-7-, mientras que los otros SLPC-B fueron principalmente CD23/FMC-7+ o doble negativos. 34 Tabla IX. Expresión de CD23 y FMC-7 en distintos SLPC-B. CD23/FMC-7 LLC (n:31) LPL (n:10) LZM (n:4) LM (n:5) LF (n:3) TC (n:4) +/- 23 0 0 1 0 1 -/+ 0 5 3 4 1 1 +/+ 1 0 1 0 1 1 -/- 7 5 0 0 1 1 La Tabla X muestra la expresión de los antígenos CD5 y CD10 en los distintos SLPC-B. La LLC-B y el LM se caracterizaron por ser CD5+/CD10mientras que la TC fue CD5-/CD10-. Tabla X. Expresión de CD5 y CD10 en distintos SLPC-B. CD5/CD10 +/-/+ +/+ -/- LLC (n:58) 49 0 0 9 LPL (n:11) 5 0 0 6 LZM (n:10) 4 1 0 5 LM (n:7) 7 0 0 0 LF (n:4) 0 0 1 3 TC (n:8) 0 0 0 8 Con el objetivo de distinguir entre LLC-B y otros SLPC-B se aplicó el sistema de puntuación propuesto por Matutes E (33) según la reactividad de los marcadores de superficie expuestos en la Tabla XI. Tabla XI. Marcadores y sistema de puntuación para diferenciar LLC-B de otros SLPC-B. Marcador Puntuación 1 0 IgS Leve Moderado/fuerte CD5 Positivo Negativo CD23 Positivo Negativo FMC7 Negativo Positivo CD22 Leve/negativo Moderado/fuerte Cuando se aplicó el sistema de puntuación, la mayoría de las LLC-B (80 %) manifestaron una puntuación ≥ 3 y solo una minoría una puntuación < 3 (20%). Los otros SLPC-B se caracterizaron por una puntuación < 3 (Tabla XII). 35 Tabla XII. Aplicación del sistema de puntuación en LLC-B y otros SLPC-B. Score LLC-B Otros SLPC-B (n= 59) (n=40) 5 1,7 % 0% 4 23,7% 2,5% 3 54,2% 0% 2 16,9% 22,5% 1 3,4% 40% 0 0% 32,5% Atipías inmunofenotípicas en SLPC-B La frecuencia total de atipías inmunofenotípicas en los 110 pacientes con SLPC-B fue de 13 %. En 9/59 (15 %) pacientes con LLC-B no se detectó expresión de CD5 (Figura 29), mientras que en un paciente hubo expresión de FMC-7. En todos estos casos, hubo expresión de marcadores pan-B. En 1/8 (12 %) paciente con TC se detectó un inmunofenotipo variante caracterizado por ausencia de expresión de CD25 con expresión de CD103 y CD11c. Figura 29. Histograma que muestra la ausencia de CD5 en un caso de LLC-B. Por último, en 3/4 (75 %) pacientes con LF se detectó débil expresión de CD10 asociada con fuerte expresión de marcadores pan-B. Características inmunofenotípicas de los SLPC-T/NK Los casos de SLPC-T/NK incluyeron a: LPL-T (7), MF/SS (1), LLGG-T (1) y LLGG-NK (1). La Tabla XIII muestra la expresión de marcadores de superficie en éstos casos. Las células neoplásicas de origen T evidenciaron positividad para CD3 y CD5. 36 Tabla XIII. Perfil inmunofenotípico de linfomas de células T/NK maduras. Marcadores CD5 LPL-T (n:7) 7 MF/SS (n:1) 1 LLGG-T (n:1) 1 LLGG-NK (n:1) ND CD7 7 0 0 0 CD3 7 1 1 0 CD16 1 ND 1 1 CD2 ND 0 ND 1 CD56 0 0 0 1 CD4+/CD8- 0 1 0 0 CD4-/CD8+ 2 0 1 0 CD4+/CD8+ 5 0 0 0 CD4-/CD8- 0 0 0 1 ND: no determinado Las LPL-T evidenciaron un fenotipo de células T CD8+ o con doble positividad para CD4 y CD8. Este último aspecto fue considerado como evidencia de clonalidad. La Figura 30 muestra las características morfológicas de los prolinfocitos de un caso de LPL-T. Figura 30. Prolinfocitos en sangre Periférica de un paciente con LPL-T. El inmunofenotipo de la MF/SS se caracterizó por la expresión de CD3 y CD5 con pérdida de CD7 y un fenotipo de células colaboradores (CD4+/CD8-) (Figura 31). 37 A B C D Figura 31. Histogramas que muestran la ausencia de CD25 (A), la expresión de CD5 (B), coexpresión CD4/CD3 (C) y ausencia de CD2 y CD7 en el paciente con MF. En la LLGG-T, las células neoplásicas expresaron CD3 junto con el antígeno de linfocitos grandes granulares, CD16. Además, éstas células fueron CD4/CD8+. Con respecto al caso de LLGG-NK, las células se caracterizaron por expresar CD16 y CD56 (Figura 32). Los otros marcadores utilizados en el primer panel (CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD19, CD20 y CD23) fueron negativos. A B Figura 32. Histogramas que muestran la expresión de CD56 (A) y CD16 (B) en el caso del LLGG-NK. DISCUSIÓN 38 9. DISCUSIÓN La inmunofenotipificación a través de la citometría de flujo ha demostrado ser de gran utilidad en oncohematología para la identificación de las células neoplásicas, la definición de las células leucémicas o linfomatosas y la subclasificación de las diversas enfermedades en base a la línea celular que les diera origen. Por ello, la citometría de flujo desde el punto de vista de su utilización diagnóstica, constituye un criterio objetivo que integrado con parámetros clínicos, biológicos y morfológicos permite arribar a un diagnóstico final. A este respecto, la inmunofenotipificación asumió un rol importante en el diagnóstico correcto de los SLPC debido a que la diferenciación entre alguno de éstos síndromes puede complicarse por la similitud clínica y los rasgos morfológicos que manifiestan. Además, la inmunofenotipificación ha permitido la identificación de leucemias crónicas NK, de células T y de células vellosas B, así como también de algunos linfomas leucemizados. Por ello, en este Trabajo Final se determinó el perfil inmunofenotípico en una serie de SLPC con expresión hemoperiférica. La clonalidad de las células neoplásicas es la característica más importante para distinguir entre un proceso neoplásico y un proceso reactivo (50,51). La clonalidad de las células B puede ser determinada de manera directa por la expresión de las cadenas livianas de Ig a nivel citoplasmático o en la superficie (k o ) en la población de células patológicas (52). Sin embargo, en algunas proliferaciones neoplásicas de células B puede faltar la Ig. Una evidencia indirecta de clonalidad de las células B puede incluir la coexpresión de antígenos de diferenciación o de activación. Esto supone que solamente una proliferación monoclonal de células puede condicionar un inmunofenotipo atípico. La LLC-B fue la patología más frecuente (54 %) entre los SLPC-B incluidos en este Trabajo. Esta neoplasia se manifestó en adultos mayores como lo descripto previamente (53). En sangre periférica se observaron linfocitos pequeños, con núcleo redondo y cromatina condensada. Estas características correspondieron a la forma clásica de la LLC. El estudio inmunofenotípico de éstas células permitió caracterizarlas como linfocitos B maduros que expresaron los antígenos pan-B: CD19 y CD20. También, expresaron CD23 sin FMC7 como 39 lo informado previamente (50). Una característica particular de los linfocitos de la LLC-B es la expresión del antígeno CD5, un marcador de células T que es expresado en un sub-grupo de células B. La coexpresión CD5/CD19 permitió la diferenciación de la LLC y LM (CD5 +) de otros SLPC-B, como la LPL-B o TC (CD5 – o de baja intensidad) (54). Numerosas atipias en el inmunofenotipo han sido descriptas en la LLC, tales como: sobreexpresión o pérdida de antígenos, expresión asincrónica de antígenos o alteraciones en el patrón de dispersión de la luz (55). En este trabajo, el 15 % de los casos de LLC-B fueron atípicos y se caracterizaron principalmente por la ausencia de CD5. Las formas atípicas de LLC-B tienen un fenotipo menos característico ya que la expresión de CD20, CD22 y FMC-7 es más intensa y la de CD23 es más débil (35). La LPL-B tuvo una frecuencia del 10 % de los SLPC-B incluidos en este trabajo y la edad media de los pacientes fue de 77 años como lo informado previamente (56). La evaluación citomorfológica evidenció las características típicas de los prolinfocitos. El inmunofenotipo de estas células leucémicas fue CD19+, CD20+ y CD22+. Sin embargo, a diferencia de la LLC-B, los prolinfocitos expresaron con intensidad el FMC-7 con ausencia o baja expresión de CD5 y de CD23. También los prolinfocitos fueron negativos para CD10, CD11c y CD103. Por ello, el perfil inmunofenotípico de CD5- con fuerte expresión de CD22 permitió el diagnóstico diferencial entre LLC-B y LPL-B. El perfil inmunofenotípico de las LPL-B incluidas en este trabajo sugiere una enfermedad de novo ya que en la transformación prolinfocítica de una LLC, las células expresan CD5 e Ig de baja intensidad (57). En el MM, la cuantificación de células plasmáticas en la médula ósea mediante evaluación citomorfológica convencional es una prueba mandataria para el diagnóstico y evaluación de la respuesta a la terapia. Sin embargo, el grado de infiltración medular por las células plasmáticas puede variar significativamente no solo entre pacientes sino en el mismo paciente. Esto ha sido atribuido al patrón heterogéneo de la infiltración medular de células plasmáticas en el MM (58). Por ello, se ha determinado que la cuantificación de células plasmáticas en la médula ósea por citometría de flujo multiparamétrica tiene una correlación significativa con la evaluación citomorfológica pero, adicionalmente, constituye un factor pronóstico independiente para la sobrevida de los pacientes (59). 40 En este trabajo, la evaluación citomorfológica de aspirados de médula ósea permitió caracterizar y cuantificar a las células plasmáticas. Cuando se realizó la inmunofenotipificación de éstas células, se determinó la falta de expresión de numerosos antígenos de linaje B (CD19, CD20, CD22, CD24, HLA-DR) pero la expresión de los antígenos CD38 y CD138 fue intensa y la expresión de CD45 fue débil. La falta de antígenos de linaje B es debido a su pérdida durante la maduración de los linfocitos a células plasmáticas. La clonalidad de las células plasmáticas puede ser determinada con el análisis de CD45/CD38/cadenas livianas o . La débil expresión de CD45 con fuerte expresión de CD38 y restricción de cadenas livianas evidencia la monoclonalidad. Cao W et al (60) informaron que los antígenos CD38 y CD138 se mantuvieron estables durante un seguimiento de 2 a 38 meses del perfil inmunofenotípico de las células plasmáticas en médula ósea. Sin embargo, durante este período de seguimiento hubo cambios en la expresión de CD56, CD20 y CD52. Algunos trabajos han informado distinta frecuencia en la expresión de CD20 y CD52 (61,62). La expresión de éstos antígenos, al igual que CD56 y CD117, han sido considerados como fenotipos aberrantes (63). En este trabajo, se detectó que las células plasmáticas expresaron CD56. El LZM representó el 9 % de los SLPC-B. La evaluación citomorfológica permitió determinar que todos los casos de LZM incluidos en este trabajo fueron sin linfocitos vellosos. El inmunofenotipo de las células linfoides se caracterizó por expresar CD11c+, CD19, CD20 y CD22 con ausencia de CD5,CD10 y CD23. La TC tuvo un frecuencia de 7 % entre los pacientes con SLPC-B. Esta entidad se caracterizó por la presencia, en sangre periférica, de una población monomórfica de células pequeñas a medianas con finas proyecciones citoplasmáticas. Las células de la TC se caracterizaron por expresar intensamente tres antígenos pan-B: CD19, CD20 y CD22. Estas características inmunofenotípicas han permitido catalogar a los tricoleucocitos como células B activadas (64). Además, estas células expresaron intensamente CD25, FMC-7, CD11c y CD103, siendo los últimos dos antígenos muy específicos para tricoleucocitos. La coexpresión de CD11c, CD25 y CD103 fue consistente con tricoleucocitos, que junto con la elevada intensidad de CD22 y la falta de CD5 y de CD23 permitieron realizar el diagnóstico deferencial con la LLC-B. Aunque no hay un único marcador específico para distinguir a la TC de otros SLPC-B, los 41 antígenos CD11c, CD25 y CD103 con característicamente expresados en tricoleucocitos (45). El inmunofenotipo de la TC ha evidenciado su importancia respecto al curso clínico y a la respuesta al tratamiento. En la serie de TC analizadas hubo un caso de TC variante en una paciente de 88 años y caracterizada por la falta de expresión de CD25. Previamente, se ha informado que la forma variante de TC (definida como CD11c positiva, CD25 negativo, CD103 positivo) está asociada con mala respuesta al tratamiento (65,66). En el LM, las células neoplásicas expresaron CD5, CD19, CD20, CD22 y FMC-7 con ausencia de CD10 y CD23, lo que permitió diferenciarla de la LLC-B. Numerosos estudios han sugerido que el CD23 y el FMC-7 pueden ser buenos discriminadores entre LLC-B y LM, siendo el LM CD23– y FMC7+ y la LLC-B CD23+ y FMC-7(-) (67,68). Otros marcadores utilizados para discriminar entre estas dos patologías han sido el CD20 y la expresión de la Ig de superficie. El LM muestra una fuerte intensidad de CD20 con moderada a intensa expresión de Ig de superficie mientras que en la LLC-B la expresión de CD20 y de Ig son leves (69). En la serie de casos de LM estudiados no se detectaron formas variantes. Sin embargo, han sido informados LM con falta de CD23 y/o positividad de FMC-7 o negatividad para CD5 y positividad para CD10) (70,71). En el LF la leucemización no es tan frecuente como en la LLC y cuando se produce esta es escasa. En este trabajo, las células linfoides de los pacientes con LF expresaron CD19, CD20 y CD22 con ausencia de CD5, CD10 y CD23. En este tipo de linfoma debe tenerse presente el tipo de muestra que se analiza para la correcta interpretación del fenotipo. En condiciones fisiológicas existen en ciertos tejidos, como la médula ósea, linfocitos B que expresan CD10. La valoración de la infiltración medular en pacientes con LF, sobre todo si esta es escasa, debe realizarse con un estudio multiantigénico que permita diferenciar los precursores B normales de los linfocitos linfomatosos y demostrar la clonalidad de las células B (72). A este respecto, el uso de CD38 en combinación con CD19, CD20 y CD10 permite la identificación de todos los casos de LF, y los marcadores CD19, CD20 y CD10 sólos o en combinación no permiten la identificación en un porcentaje significativo de los casos de LF. Esto indica la utilidad de la inclusión de CD38 en el panel de anticuerpos para la evaluación de poblaciones de células B centro 42 foliculares y la importancia de evaluaciones multiparamétricas para el diagnóstico de esta neoplasia (73). Con respecto a los SLPC-T/NK, la demostración de clonalidad es más dificultoso que para las células B debido a que no hay una analogía entre expresión del RCT y la expresión de cadenas livianas k o (50). La característica más específica que indica proliferación clonal T es la ausencia de uno o más de los cuatro marcadores pan T (CD2, CD3, CD5, CD7) que puede impartir un fenotipo nulo y dificultar la asignación del linaje celular. Comúnmente es la ausencia de CD7, seguida por CD5 y CD2 y menos frecuentemente, pérdida de CD3. Otra aberración es la alteración en la intensidad de la marcación, como por ejemplo: coloración débil de CD3 o CD5 en células T, coloración débil de CD2, CD7, CD56 y CD57 para células NK o una expresión brillante y uniforme de CD8 y CD16 para células NK. También la perdida de expresión de CD45RA y la coexpresión de CD4 y CD8 puede indicar clonalidad T. Por último, un marcado incremento o una marcada disminución de la relación CD4/CD8 (> 10:1 o < 1:10) de los linfocitos T circulantes, puede ser sugestivo de un desorden linfoproliferativo T. Pero la evaluación de la relación CD4/CD8 deber ser relacionada con el inmunofenotipo de las células, el número de leucocitos circulantes y los datos clínicos. Las neoplasias de células T/NK maduras son relativamente poco comunes. En un amplio estudio internacional, estas neoplasias sólo representaron el 12% de todos los LNH (74). En este trabajo los SLPC-T/NK representaron el 8 % de todos los SLPC estudiados. Las LPL-T incluidas en este trabajo expresaron los marcadores CD2, CD5 y CD7. Se ha determinado que la expresión de CD3 puede ser débil o aún ausente lo que indica que estas células se encuentran en un estadio de diferenciación intermedio entre células T tímicas y postímicas (75). El 60 % de los pacientes tiene células que expresan CD4 pero no CD8, un 25 % coexpresan CD4 y CD8, un 15 % expresa CD8 pero no CD4 (76,77). En este trabajo, el 29 % de los casos expresó CD8 pero no CD4 y el 71 % coexpresó CD4/CD8. El diagnóstico de la LPL-T debe ser confirmado, además de la morfología y el inmunofenotipo, con las características clínicas y la demostración de la inv(14)(q11;q32) o la traslocación t(14;14)(q11;q32) (78). 43 La mayoría de los casos de MF/SS provienen de células T CD4+ que evidencian pérdida de CD7 y bajos niveles de marcadores de activación, tales como CD25 y CD30. El SS corresponde a la fase leucémica de la MF, neoplasia que compromete a la piel. Estas neoplasias se caracterizan por la pérdida de uno o más antígenos pan T (CD2, CD3, CD5, CD7) y/o CD26, siendo la pérdida de CD7 la más común (79). Recientemente se ha determinado que la MF es una neoplasia de células T de memoria efectoras residente de la piel mientras que el SS es una neoplasia de células T de memoria centrales (80). En este trabajo, el caso de MF/SS fue en una mujer de 66 años con manifestaciones en piel. El inmunofenotipo de las células linfoides de sangre periférica correspondió a una población CD3+/CD4+/CD8-. La enfermedad linfoproliferativa de LGG es una linfocitosis clonal atípica relativamente rara que involucra a un fenotipo CD3+ o CD3- (81). Por ello, las proliferaciones clonales de estas células han sido denominadas LLGG-T y LLGGNK, respectivamente. La demostración de clonalidad de los LGG es necesaria para establecer el diagnóstico (82). Para ello, se puede utilizar el análisis del rearreglo de genes del RCT por reacción en cadena de la polimerasa o Southern blot (83). El rol de la citometría de flujo para demostrar presencia de una población de LGG neoplásicos no ha sido aún totalmente establecido. La característica de la LLGG-T es la expansion clonal de linfocitos CD8+ citolíticos en la sangre periférica y que presentan baja intensidad de coloración para CD5 o CD7 (84). El paciente incluido en este trabajo presentó el fenotipo CD4-/CD8+ con ausencia de CD7. La expansión monoclonal de LGG-T CD4+ ha sido informada en raras ocasiones (85). En esta neoplasia, la expresión de CD56 es variable y se ha asociado con un curso clínico más agresivo (86). Además, se detecta la expresión de proteínas asociadas a gránulos citotóxicos, granzima B y perforina (87). El diagnóstico de una población de células NK neoplásicas requiere la integración de la clínica, la morfología, el inmunofenotipo y el genotipo. Desde el punto de vista del inmunofenotipo, para el diagnóstico es necesaria: la expresión de al menos un marcador de célula NK (CD16, CD56 o CD57), la falta de expresión de CD3 de superficie, de antígenos B (CD19 y CD20) y de otros marcadores de linaje y el gen del RCT en configuración de línea germinal (88,89). CONCLUSIÓN 44 En este trabajo, la paciente con LLGG-NK se detectó el expresión de CD16 y CD56 con ausencia de CD3 y marcadores pan B. 10. CONCLUSIÓN La combinación de las características clínicas, la morfología y el inmunofenotipo de las células neoplásicas permite arribar a un diagnóstico correcto. En base a los hallazgos realizados a través del estudio inmunofenotípico de la serie de SLPC incluidos en este trabajo, se puede concluir que las siguientes expresiones o ausencia de antígenos orientan hacia el tipo de SPLC-B: 1) LLC: CD5+/CD23+/FMC-7(-), CD222) LPL: CD5-/+/CD22+/FMC-7+/3) LM: CD5+/CD23-/CD10-/+ 4) LF: CD5-/CD10+ 5) LZM: CD5-/CD10-/CD23Respecto a los SLPC-T/NK, la diferenciación entre una población benigna de células T/NK y una neoplasia T/NK resulta más dificultoso que para las proliferaciones de células B. Esto es consecuencia de la variabilidad en la expresión antigénica de estas células y a la falta de un fenotipo clonal totalmente asociado a estas neoplasias. Por ello, la combinación de la citometría de flujo y técnicas moleculares junto con las características clínicas y hallazgos citomorfológicos permite alcanzar un diagnóstico más exacto y definitivo para los pacientes. 45 11. Bibliografía 1. CortésFunés H, Diaz-Rubio E, et al. Oncología Médica. 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