Resúmenes de Tesis Doctorales Tesis nº: 0682 Area

b
Doctorado en Ciencias Naturales
Facultad de Ciencias Naturales y Museo
Universidad Nacional de La Plata – Argentina
Resúmenes de Tesis Doctorales
Tesis nº: 0682
Area: Zoología
Cunningham, Mónica Liliana. Transporte de lípidos en arácnidos. Lipoproteínas plasmáticas de
Polybetes pythagoricus [Holmberg, 1874] y Latrodectus mirabilis [Holmberg, 1876]
Director(es): Pollero, Ricardo José; Gonzalez, Alda
La Plata: Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Naturales y Museo, 1997.
Los estudios llevados a cabo hasta el momento en diversos grupos animales, indican
claramente la existencia de sistemas de circulación plasmática de lípidos mediante
lipoproteínas. Estos sistemas, responsables también del transporte de otros compuestos
lipofílicos, como vitaminas, pigmentos, etc., posibilitan la circulación de estos compuestos
hidrófobos en un medio acuoso, y son la base de numerosos mecanismos metabólicos
fundamentales.
Dentro de los invertebrados, los grupos más intensamente estudiados con respecto a los
mecanismos de circulación de lípidos, han sido los artrópodos principalmente insectos y
crustáceos. La información sobre la circulación de lípidos plasmáticos en moluscos es
comparativamente menos conocida, aunque ya ha sido estudiada en bivalvos, cefalópodos y
gasterópodos.
Con respecto a los arácnidos la información que existe referida al transporte de los lípidos
plasmáticos, está restringida, incluyendo los resultados de este trabajo, a sólo tres especies de
arañas. El objetivo de este trabajo de tesis, se focalizó en cubrir esta falta de información sobre
este grupo biológico tomando como modelo principal a la araña Polybetes pythagoricus
(Holmberg, 1874), y posteriormente a la araña Latrodectus mirabilis (Holmberg, 1876) con el fin
de hacer comparaciones e intentar una posible generalización. Nos propusimos detectar la
presencia de lipoproteínas plasmáticas en ambas especies e intentar aislarlas y caracterizarlas.
Otro objetivo de importancia fue conocer el papel del pigmento respiratorio hemocianina en una
hipotética función transportadora de los lípidos hemolinfático, basada en la baja densidad
observada en las fracciones que contenían esta proteína.
Se investigó la presencia de lipoproteínas mediante ultracentrifugaciones del plasma en
gradientes de densidad y construcción de perfiles proteicos. Esto permitió la detección de
fracciones lipoproteicas en los gradientes. Se procedió a su aislamiento, purificación y
caracterización. La porción lípida fue analizada mediante combinación de técnicas
cromatográficas; se identificó y cuantificó cada una de las clases de lípidos presentes. Las
apoproteínas fueron aisladas y purificadas por cromatografía líquida de alta presión (HPLC),
determinándose su peso molecular y el de sus subunidades por medio de técnicas
electroforéticas. Los métodos empleados para estudiar la capacidad de la hemocianina para
Biblioteca Florentino Ameghino
Facultad de Ciencias Naturales y Museo - Universidad Nacional de La Plata
Paseo del Bosque s/n (B1900FWA) La Plata - Buenos Aires - Argentina
http://www.fcnym.unlp.edu.ar/biblioteca/
[email protected]
1
unir lípidos serán descriptos someramente más adelante.
Fue posible detectar en el plasma de Polybetes pythagoricus tres fracciones lipoproteicas, dos
de alta densidad (HDL1 y HDL2) y una de muy alta densidad (VHDL).
La HDL1 tiene una densidad de 1.13 g/ml y transporta el 26% de los lípidos totales
hemolinfáticos. Con respecto a su composición lipídica los fosfoglicéridos son los mayoritarios
(61.3%) y los triacilglicéridos (16.4%) predominan netamente sobre los diacilglicéridos (2.4%).
En esto se diferencia significativamente de las lipoforinas de insectos y de la de Eurypelma
californicum (tarántula). La composición apoproteica reveló dos bandas principales de 250 y 76
kDa (similares a las apolipoforinas), y algunos otros péptidos de menor peso molecular. Estas
diferencias cuali – cuantitativas tanto en los lípidos como en las proteínas sugieren diferencias
estructurales entre las partículas lipoproteicas de organismos taxonómicamente próximos.
La HDL1con una densidad de 1.18 – 1.20 g/ml y la VHDL con una densidad de 1.21 – 1.24 g/ml
son las dos fracciones lipoproteicas que contienen alta proporción del pigmento respiratorio
hemocianina. Debido a que estas fracciones tienen una densidad muy inferior a la esperada
para una proteína pura se pensó desde un principio que se trataba de proteínas ligadas a una
considerable cantidad de lípidos. De allí que, además de analizar la composición lípida y
apoproteica de las mismas, se analizó también la de las subfracciones de la VHDL obtenidas
mediante HPLC y posteriormente se realizó un estudio in vitro de interacción lípido –
hemocianina. En conjunto, la HDL2 y la VHDL transportan el 70 % de los lípidos totales
hemolinfáticos, siendo la VHDL la principal fracción transportadora. La composición lipídica de
ambas fracciones muestran que los fosfoglicéridos son los lípidos predominates; los ácidos
grasos libres y los triacilgliceroles son también cuantitativamente importantes, mientras que el
colesterol y los diacilgliceroles se encuentran en baja proporción. La composición apoproteica
mostró en las dos fracciones una banda principal en común de 70 kDa aproximadamente,
identificada como el monómero de hemocianina; especialmente en la VHDL se observaron
cantidades menores de dos cadenas polipeptídicas adicionales de 105 y 120 kDa.
Para su posterior purificación, utilizando columnas de exclusión molecular, de ambas
lipoproteínas se obtuvieron tres subfracciones, las que se analizaron en cuanto a sus
composiciones lipídicas y proteicas. La composición proteica reveló bajo condiciones nativas
una banda de 500 kDa en la subfracción I correspondiente al heptámero de la hemocianina,
una de 420 kDa en la subfracción II correspondiente al hexámero de la hemocianina y una de
70 kDa en la subfracción III correspondiente al monómero de la hemocianina. Mientras que
bajo condiciones disociantes una proteína de 70 kDa, el monómero de hemocianina, estuvo
presente en las tres subfracciones, con el agregado de dos bandas de 105 y 120 kDa en la
subfracción II.
La composición lipídca se determinó en las subfracciones de la VHDL, a través de métodos
cromatográficos (TLC–FID), mostrando un predominio de ácidos grasos libres y
fosfatidiletanolamina en la subfracción I, de fosfatidilcolina y triacilglicéridos en la subfraccción II
y de triacliglicéridos y ácidos grasos libres en la subfracción III. De esta manera quedó
demostrado que, además de cumplir sus funciones como pigmento respiratorio, la hemocianina
de este arácnido desempeña un rol como apolipoproteína.
Biblioteca Florentino Ameghino
Facultad de Ciencias Naturales y Museo - Universidad Nacional de La Plata
Paseo del Bosque s/n (B1900FWA) La Plata - Buenos Aires - Argentina
http://www.fcnym.unlp.edu.ar/biblioteca/
[email protected]
2
En el plasma de Latrodectus mirabilis se detectaron con los mismos métodos que se utilizaron
par Polybetes pythagoricus, dos fracciones lipoproteicas de alta densidad (HDL1 y HDL2). La
HDL1 flota a una densidad e 1.13 g/ml, transportando el 80.4% de los lípidos plasmáticos
totales. Con respecto a la composición lipídica, los fosfoglicéridos (34.7%) y los ácidos grasos
libres (33%) son los lípidos predominantes, mientras que los triacilglicéridos son también
cuantitativamente importantes (24.1%). La composición apoproteica reveló dos bandas
principales de 95 y 85 kDa.
La HDL2 tiene una densidad de 1.19 – 1.20 g/ml, transportando el 19.6%de los lípidos
plasmáticos totales. Los fosfoglicéridos (29.1%) y los ácidos grasos libres (28.4%) son los
lipidos predominantes. El colesterol y los hidrocarburos también representan una fracción
lipídica cuantitativamente importante, mientras que los triacilgliceroles aparecen
comparativamente en una menor proporción y los diacilgliceroles prácticamente ausentes. Esta
lipoproteína contiene hemocianina como apoproteína principal. Analizada en columnas de
exclusión molecular se separó en tres subfracciones, las cuales, analizadas
electroforéticamente bajo condiciones disociantes, presentaron formas monoméricas de la
hemocianina.
Debido a la alta concentración en el plasma de la VHDL, y siendo la principal transportadora de
lípidos en P. pythagoricus, fue utilizada para realizar estudios de la capacidad de la
hemocianina para ligar in vitro diferentes lípidos. Para tal fin se deslipidizó la hemocianina con
detergentes y se la incubó con diferentes lípidos marcados (prestando especial atención a los
que transporta mayoritariamente in vivo), logrando así la reconstitución de partículas
lipoproteicas. Se llevó a cabo la separación de subfracciones de la hemocianina ligada a los
diferentes lípidos, utilizando HPLC conectado a un radiómetro para detectar la presencia de los
lípidos marcados pegados ala proteína. Mediante los datos así obtenidos, tomando como
variable independiente la relación molar lípido/proteína incubada y como variable dependiente
la relación molar (lípido unido a proteína luego de la incubación)/(proteína), pudiendo calcularse
los siguientes parámetros : Rm (relación molar máxima de lípido unido a la proteína/proteina)
que fue 8.0 para fosfatidilcolina, 5.8 para colesterol y 34.1 para el ácido palmítico, Kd
(constante de disociación relativa lípido-proteína) que fue 42.2 para fosfatidilcolina, 59.5 para
colesterol y 1992 para el ácido palmítico. Y0(rendimiento máximo inicial de unión lípido –
proteína fue 0.2, 0.1 y 0.02 respectivamente. Se determinó así, la afinidad de cada lípido por la
hemocianina y la capacidad máxima teórica de ésta para ligarlos. Comparando los valores de
las relaciones molares in vivo con los valores teóricos obtenidos a partir de los experimentos in
vitro, se observó que estos últimos son mayores, sugiriendo que el pigmento respiratorio tiene
una muy superior capacidad teórica de una muy superior capacidad teórica de unión de lípidos
de la que une y transporta in vivo.
Biblioteca Florentino Ameghino
Facultad de Ciencias Naturales y Museo - Universidad Nacional de La Plata
Paseo del Bosque s/n (B1900FWA) La Plata - Buenos Aires - Argentina
http://www.fcnym.unlp.edu.ar/biblioteca/
[email protected]
3