PLATELIA™ CANDIDA Ag - Bio-Rad

PLATELIA™ CANDIDA Ag
96 PRUEBAS
62798
PLATELIA™ CÁNDIDA AG ES UN ENSAYO
INMUNOENZIMÁTICO TIPO SANDWICH REALIZADO
EN MICROPLACA PARA LA DETECCIÓN DEL
ANTÍGENO MANANO DE CÁNDIDA EN SUERO.
1- USO PREVISTO
Platelia™ Cándida Ag es un ensayo inmunoenzimático tipo sandwich realizado
en microplaca para la detección del antígeno manano circulante de Cándida
en muestras de suero.
2- INDICACIONES DE USO
Platelia™ Cándida Ag (ref. 62798) es una prueba que, en combinación con
Platelia™ Cándida Ab/Ac/Ak (ref. 62799), permite un diagnóstico más
temprano y mejora la sensibilidad del diagnóstico de candidiasis invasiva
como parte de un método diagnóstico completo que integra datos clínicos
y micológicos además de la evaluación de los factores de riesgo
intrínsecos e iatrogénicos 12. Este uso combinado también forma parte de
un sistema de seguimiento clínico y en laboratorio del paciente como
ayuda a la toma de decisiones sobre el tratamiento.
3- RESUMEN Y EXPLICACIÓN
Las infecciones por Cándida son la forma más frecuente de infección
fúngica nosocomial 2. Las formas invasivas representan las infecciones más
graves, con tasas de mortalidad que varían entre el 30 % y el 70 % en los
individuos inmunodeprimidos 10. El diagnóstico de infecciones invasivas por
Cándida es difícil de establecer debido a que los síntomas clínicos son poco
específicos y a que los cultivos son poco sensibles, a pesar de los
importantes avances conseguidos recientemente en este campo. El
diagnóstico de candidiasis invasiva, que conduce al inicio del tratamiento
adecuado, suele basarse en una combinación de consideraciones clínicas,
micológicas y de factores de riesgo 7. En este contexto, el diagnóstico de la
candidiasis sistémica debe incluir siempre técnicas serológicas además de
estudios micológicos directos. La detección de antígenos circulantes en el
suero parece mejorar el diagnóstico de la infección por Cándida,
especialmente en individuos inmunodeprimidos. El manano, uno de los
diversos antígenos del género Cándida, es un polisacárido ligado en forma
no covalente a la pared celular de la levadura y representa más del 7 % del
peso en seco de la C. albicans 3. Este antígeno parece ser uno de los
principales marcadores de la candidiasis invasiva 6.
4- PRINCIPIO DEL PROCEDIMIENTO
Platelia™ Cándida Ag es un ensayo inmunoenzimático tipo sándwich realizado
en microplaca en una sola fase que permite la detección cuantitativa o
cualitativa del antígeno manano circulante en el suero humano. El ensayo usa
el anticuerpo monoclonal de rata EBCA 1, que se dirije contra los
α 1,5 oligomanósidos de la Cándida y se ha caracterizado en estudios
anteriores 1, 5, 11. El anticuerpo monoclonal se usa para :
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• recubrir los pocillos de la microplaca y unirse al antígeno manano
• detectar el antígeno unido a la microplaca sensibilizada (reactivo
conjugado: anticuerpo monoclonal unido a peroxidasa).
Las muestras de suero se someten a un tratamiento térmico en presencia de
EDTA para disociar los complejos inmunes y precipitar las proteínas séricas
que podrían interferir con la prueba.
Las muestras de suero tratadas y el conjugado se añaden a los pocillos
recubiertos con anticuerpo monoclonal y se incuban. Se forma un complejo
anticuerpo monoclonal– manano– anticuerpo monoclonal/ peroxidasa en
presencia del antígeno manano. Las tiras se lavan para eliminar todo el
material que no se haya ligado. A continuación se añade la solución de
sustrato, que reaccionará con los complejos ligados al pocillo y dará lugar a
una reacción de color azul. La reacción enzimática se para al añadir ácido,
que cambia el color de azul a amarillo. La absorbancia (densidad óptica) de
las muestras, controles y puntos de rango se determina con un
espectrofotómetro configurado a una longitud de onda de 450 y 620 nm.
La prueba puede realizarse según dos modos:
• Modo cuantitativo: estableciendo una curva de calibración a partir de
4 puntos de rango: 2,0, 1,0, 0,5 y 0,25 ng/mL. Los resultados de las
muestras se muestran en ng de manano por mL de suero.
• Modo cualitativo: sólo se usan los puntos de rango de 0,25 ng/mL y
0,5 ng/mL; la comparación entre la DO de las muestras analizadas y la DO
de los 2 puntos de rango permite expresar los resultados como suero
negativo, intermedio o positivo.
5- REACTIVOS
Platelia™ Cándida Ag: nº de producto 62798 (96 pruebas)
Almacene el kit entre +2ºC y +8ºC. Antes de usarlos, deje que todos los
reactivos alcancen la temperatura ambiente (entre +18ºC y +25ºC).
Después del uso, vuelva a poner todos los reactivos a una temperatura
entre +2ºC y +8ºC. Vuelva a poner las tiras o placas no usadas en la bolsa
y ciérrela. No saque el desecante. Las tiras deberían usarse en un plazo
de 5 semanas después de abrir y volver a cerrar la bolsa. Una vez diluida,
la solución de lavado puede guardarse durante 14 días entre
+2ºC y +8ºC. Los demás reactivos son estables hasta la fecha de
caducidad, incluso una vez abiertos. Se suministra suficiente cantidad de
reactivos para realizar 96 pruebas en un máximo de 6 tandas.
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Componente
R1
R2
R3
Contenidos
Microwell
Strip
Plate
Placa de tiras de micropocillos :
- 96 pocillos (12 tiras de 8 pocillos cada una)
recubiertos con anticuerpo monoclonal
antimanano EBCA 1
Concentrated Solución de lavado concentrada (10x) :
Washing
- Tampón Tris-NaCl (pH 7,4)
Solution (10x) - 1 % Tween® 20
- Conservante: 0,01 % timerosal
Negative
Suero de control negativo :
Control
- Suero humano de control negativo para
Serum
manano, usado como control negativo y
diluyente para el suero estándar durante la
preparación de los puntos de rango 1,0, 0,5 y
0,25 ng/mL en la prueba cuantitativa y para la
preparación del suero calibrador en la prueba
cualitativa (véase el apartado 10,
“Procedimiento")
- Negativo en anticuerpos antiVIH-1, antiVIH-2
y antiVHC, así como en antígeno HBs
- Conservante: < 0,1 % azida sódica
Cantidad
1 placa/
12 x 8 pocillos
1 x 100 mL
1 x 10 mL
R4
Calibrator
Serum
Suero calibrador :
- Suero humano con 2,0 ng/mL de manano,
usado para la preparación de los puntos de
rango 1,0, 0,5 y 0,25 ng/mL en la prueba
cuantitativa y para la preparación del suero
calibrador en la prueba cualitativa (véase el
apartado 10, “Procedimiento”)
- Negativo en anticuerpos antiVIH-1, antiVIH-2
y antiVHC, así como en antígeno HBs
- Conservante: < 0,1 % azida sódica
2 x 2 mL
R5
Positive
Control
Serum
Suero de control positivo :
- Suero humano con entre 0,5 y 1,5 ng de
manano
- Negativo en anticuerpos antiVIH-1, antiVIH-2 y
antiVHC, así como en antígeno HBs
- Conservante: < 0,1 % azida sódica
1 x 2 mL
R6
Conjugate
Conjugado (listo para usar) :
- Anticuerpo monoclonal antimanano con
peroxidasa
- Conservante: 0,01 % timerosal
1 x 8 mL
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Componente
R7
Serum
Treatment
Solution
R8
TMB
Substrate
Buffer
R9
R10
Contenidos
Cantidad
Solución de tratamiento del suero (lista para
usar) :
- Solución ácida EDTA sin conservante
Tampón sustrato TMB (listo para usar) :
- Solución de ácido cítrico y acetato sódico con
pH 5,2
- 0,009 % de peróxido de hidrógeno
- 4 % de dimetilsulfóxido (DMSO)
1 x 10,5 mL
Chromogen: Solución cromógena de TMB (concentrada) :
TMB
- Solución al 90 % de dimetilsulfóxido (DMSO)
Solution
con 0,6 % de tetrametilbencidina (TMB)*
Stopping
Solution
Solución de interrupción (lista para usar) :
- Ácido sulfúrico (H2SO4) 1,5 N
Plate sealers Tapas para placa :
- Láminas adhesivas para microplacas
1 x 60 mL
1 x 1 mL
1 x 12 mL
1 x 4 láminas
* Nota: La TMB (tetrametilbencidina) es un cromógeno no carcinógeno y no
mutágeno para la peroxidasa
6- ADVERTENCIAS PARA EL USUARIO
1. Para uso diagnóstico in vitro.
2. Para uso profesional exclusivamente.
3. No se recomienda utilizar este kit con muestras que no sean de suero
humano.
4. Se ha analizado el material de origen humano utilizado en la preparación
de los reactivos y ha resultado negativo en anticuerpos antiVIH-1,
antiVIH-2 y antiVHC, así como en antígeno HBs. Sin embargo, dado que
ningún método puede garantizar por completo la ausencia de agentes
infecciosos, todos los reactivos y muestras de pacientes deberán
manipularse como si pudieran transmitir infecciones. Todas las pruebas
deberán realizarse tomando las precauciones recomendadas para
patógenos de transmisión sanguínea.
5. Utilice ropa protectora y guantes desechables cuando manipule
reactivos del kit y muestras de pacientes. Lávese las manos a
conciencia después de realizar la prueba.
6. No pipetee con la boca.
7. No fume, beba ni coma en zonas donde se manipulen muestras o
reactivos del kit.
8. Evite las salpicaduras de muestras o de soluciones que las contengan.
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9. Los derrames biológicos que no contengan ácido deberán limpiarse a
fondo con un desinfectante eficaz. Pueden usarse desinfectantes
como: solución de lejía al 10 % (solución al 0,5 % de hipoclorito
sódico), etanol al 70 % o Wescodyne™ al 0,5 % (lista no exhaustiva).
Los derrames que contengan ácido deberán limpiarse o neutralizarse
con bicarbonato sódico antes de limpiarlos con un desinfectante
químico. Los materiales usados para limpiar derrames deberán
desecharse como residuos biopeligrosos.
ATENCIÓN : No introduzca soluciones con lejía en el autoclave.
10. Deseche todas las muestras y materiales utilizados para realizar la
prueba como si tuvieran un agente infeccioso. Deberán cumplirse todos
los requisitos vigentes sobre desecho de residuos.
11. Algunos reactivos contienen azida sódica como conservante. La azida
sódica puede formar azidas de plomo o cúpricas en las cañerías del
laboratorio. Estas azidas son explosivas. Para evitar la acumulación de
azidas, aclare abundantemente las cañerías con agua cuando deseche
por el desagüe soluciones que contengan azida, previa inactivación de
éstas.
12. ATENCIÓN :
Ácido sulfúrico (H2SO4) 1,5 N y DMSO (dimetilsulfóxido) al
90 %
R36/38: Irrita los ojos y la piel.
Xi-irritante S2-26-30: Manténgase fuera del alcance de los niños. En
caso de contacto con los ojos, lávense inmediata y
abundantemente con agua y acúdase a un médico. No añadir
nunca agua a este producto
13. Evite el contacto del tampón sustrato TMB, la solución cromógena de
TMB y la solución de interrupción con los ojos, la piel y las mucosas
(riesgo de intoxicación, irritación y quemaduras).
14. Ficha de seguridad del material disponible previa petición.
7- PRECAUCIONES PARA EL USUARIO
1. LAS MUESTRAS DE SUERO CONGELADAS QUE HAYAN ESTADO
ALMACENADAS EN CONDICIONES DESCONOCIDAS PUEDEN OFRECER
RESULTADOS POSITIVOS FALSOS DEBIDO A LA CONTAMINACIÓN CON
HONGOS O BACTERIAS.
2. No use el kit ni ninguno de sus reactivos después de la fecha de
caducidad indicada.
3. Con la excepción de la solución de lavado concentrada (R2) y de la
solución de interrupción (R10), no mezcle reactivos de otros kits que
tengan números de lote distintos.
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4. Antes de usar los reactivos, deje que se ajusten a la temperatura
ambiente durante 15 minutos.
5. Mezcle bien mientras reconstituye los reactivos, con cuidado de evitar
la contaminación microbiana.
6. No lleve a cabo la prueba en presencia de vapores reactivos (ácidos,
álcalis, aldehídos) o polvo, que podrían alterar la actividad enzimática
del conjugado.
7. Utilice recipientes de polipropileno limpios y desechables para preparar
la solución sustrato cromógena de reacción. Si tuvieran que usarse
artículos de vidrio, éstos deberán lavarse primero en ácido clorhídrico
1 N, aclararse con agua destilada y secarse.
8. Para el pipeteado manual de controles y muestras, utilice puntas de
pipeta individuales para evitar arrastrar las muestras.
9. Para asegurarse de que los pocillos se han lavado bien, respete el
número recomendado de ciclos de lavado y asegúrese de que los
pocillos se llenen y vacíen completamente. No deberá hacerse el lavado
manualmente con un bote blando.
10. No permita que la microplaca se seque entre el final del ciclo de lavado
y la adición de los reactivos.
11. No utilice el mismo envase para las soluciones de conjugado y de
sustrato.
12. No permita que la solución de conjugado o la solución sustrato
cromógena de reacción entren en contacto con metal o con iones
metálicos.
13. Evite la exposición de la solución cromógena de TMB o de la solución
sustrato cromógena de reacción a una luz fuerte durante el
almacenamiento o la incubación. No permita que las soluciones
cromógenas entren en contacto con un agente oxidante.
14. Evite el contacto de la solución de interrupción con todo agente
oxidante. No permita que la solución de interrupción entre en contacto
con metal o con iones metálicos.
15. Limite la exposición de las soluciones (sueros, solución de tratamiento
del suero, conjugado) o de los recipientes abiertos (placas, tubos,
pipetas) al aire.
16. No devuelva el conjugado no usado a su recipiente original.
17. La solución sustrato cromógena de reacción debe ser incolora. La
aparición del color azul después de la dilución indica que el reactivo
está contaminado y no debe usarse. Deséchelo y prepare un reactivo
nuevo.
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8- PREPARACIÓN Y ALMACENAMIENTO DE LOS REACTIVOS
Placa de tiras de micropocillos (R1)
Una vez abierta la bolsa de la placa, las tiras de micropocillos son
estables durante 5 semanas si se almacenan entre +2ºC y +8ºC en su
bolsa original cuidadosamente cerrada y con el desecante dentro.
Solución de lavado (R2)
Prepare la solución de lavado funcional según sea necesario añadiendo
una parte de solución de lavado concentrada a 9 partes de agua estéril
desionizada o destilada. Prepare una cantidad suficiente de solución de
lavado funcional para completar la prueba (80 mL para una tira = 8 mL de
R2 + 72 mL de agua destilada).
La solución de lavado funcional puede almacenarse entre +2ºC y +8ºC
durante 14 días. Una vez abierta, la solución de lavado concentrada es
estable hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta si se
almacena entre +2ºC y +25ºC y no se produce contaminación.
Solución sustrato cromógena de reacción (R8+R9)
Prepare la solución sustrato cromógena de reacción añadiendo una parte
de solución cromógena de TMB (R9) a 50 partes de tampón sustrato TMB
(R8). Prepare 2 mL de solución sustrato cromógena de reacción por tira:
40 µL de R9 + 2 mL de R8.
La solución es estable durante 6 horas si se almacena en un lugar oscuro
y a temperatura ambiente (entre +18ºC y +25ºC). Una vez abiertos, los
reactivos R8 y R9 son estables hasta la fecha de caducidad indicada en la
etiqueta si se almacenan entre +2ºC y +8ºC y no se produce
contaminación.
Suero de control negativo (R3), suero calibrador (R4), suero de
control positivo (R5), conjugado (R6), solución de tratamiento del
suero (R7) y solución de interrupción (R10)
Una vez abiertos, los reactivos R3, R4, R5, R6 y R10 son estables hasta la
fecha de caducidad indicada en la etiqueta si se almacenan entre +2ºC y
+8ºC y no se produce contaminación.
9- RECOGIDA DE MUESTRAS
Extraiga las muestras de sangre según los procedimientos estándar de
laboratorio. La prueba se realiza al suero. Las muestras de suero no
deberán estar contaminadas por esporas fúngicas ni bacterias. Transporte
y almacene las muestras en tubos sellados y sin contacto con el aire. Las
muestras pueden almacenarse entre +2ºC y +8ºC durante 24 horas antes
de realizar la prueba. Para un almacenamiento más prolongado, almacene
el suero a -70ºC.
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Las muestras de suero pueden someterse como máximo a 3 ciclos de
congelación y descongelación. Las muestras previamente congeladas
deben mezclarse bien después de la descongelación y antes de la prueba.
Las muestras con 90 g/L de albúmina o 200 mg/L de bilirrubina, las
muestras lipémicas con el equivalente de 360 g/L de trioleina (triglicérido)
y las muestras hemolizadas con 200 g/L de hemoglobina no afectan a los
resultados.
No descomplemente los sueros.
10- PROCEDIMIENTO
Materiales suministrados
Véase el apartado REACTIVOS.
Materiales necesarios pero no suministrados
1. Agua estéril destilada o desionizada para diluir la solución de lavado
concentrada.
2. Papel absorbente.
3. Guantes desechables.
4. Gafas protectoras.
5. Hipoclorito sódico (lejía) y bicarbonato sódico.
6. Pipetas o multipipetas, ajustables o fijas, para medir y dispensar
50 µL, 100 µL, 300 µL y 1000 µL.
7. Tubos de polipropileno de 1,5 mL para microcentrifugadora con
tapones herméticos y capacidad para soportar calentamiento a
120ºC (termobloque) o 100ºC (baño María):
• Tubos con tapón de rosca: tubos cónicos de 1,5 mL (ref. Bio-Rad:
224-0010) o equivalentes.
O BIEN
• Tubos con tapón a presión: microtubos de ensayo EZ de 1,5 mL
(ref. Bio-Rad: 223-9480) o equivalentes.
• Fiadores de tapón de microtubos: ref. VWR: 6054001 o equivalentes.
Estos fiadores sellan de forma segura los tubos con tapón a presión,
impidiendo que se abran durante los cambios de temperatura y
presión, y permiten sacar fácilmente los tubos del termobloque o del
baño María.
8. Centrifugadora de laboratorio para tubos de polipropileno de 1,5 mL
capaz de centrifugar a 10 000 g.
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9. Si se usa un termobloque para el tratamiento de los sueros:
• Termobloque. Se recomiendan los siguientes modelos de termobloque:
- Modelo de 1 bloque: ref. Grant: QBD1 (ref. VWR: 460-0074)
- Modelo de 2 bloques: ref. Grant: QBD2 (ref. VWR: 460-0076)
• Bloque para termobloque: ambos termobloques (QBD1 y QBD2)
deben usarse con bloques QB-E1 de Grant (ref. VWR: 460-8517)
Si se usa el baño María para el tratamiento de los sueros:
10.
11.
12.
13.
14.
• Rack de microcentrifugadora redondo y flotante válido para vaso de
precipitados de 1 L.
• Baño María a 100ºC
Agitador vórtex.
Incubadora para microplacas a 3 ºC ± 1ºC
Lavadora para microplacas semiautomática o automática.
Lector de microplacas equipado con filtros de 450 nm y 620 nm.
Recipiente para residuos contaminados.
Comentarios sobre el procedimiento
Para validar los resultados de la prueba, deberán analizarse los controles
negativos y positivos y los puntos de rango con cada ejecución.
Preparación de los puntos de rango
Modo cuantitativo :
Para 1 serie
Para 6 series (*)
R3
Suero de
control
negativo
R4
Suero
calibrador
con 2 ng/mL
R3
Suero de
control
negativo
R4
Suero
calibrador
con 2 ng/mL
Punto de 2 ng/mL
-
300 µL
-
2000 µL
Punto de 1 ng/mL
150 µL
150 µL
1000 µL
1000 µL
225 µL
75 µL
1500 µL
500 µL
262,5 µL
37,5 µL
1750 µL
250 µL
Punto de 0,5 ng/mL
Punto de 0,25 ng/mL
(*) Puede prepararse por adelantado cantidad de reactivo suficiente para
6 series: por cada punto de rango, divida el reactivo en porciones de 300 µL y
guárdelo a -20ºC.
Antes de usarlos, deje que los reactivos alcancen la temperatura ambiente
(entre 18ºC y +25ºC).
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Modo cualitativo :
Prepare los puntos de rango de 0,5 ng/mL (suero calibrador) y 0,25 ng/mL
según se indicaba en la tabla anterior.
Tratamiento de los sueros
Todos los sueros de control: negativo (R3), positivo (R5) y los puntos de
rango de 2,0, 1,0, 0,5 y 0,25 ng/mL deben procesarse a la vez que las
muestras :
1. Pipetee 300 µL de cada suero, control y punto de rango a tubos
distintos de polipropileno de 1,5 mL.
2. Añada 100 µL de solución de tratamiento del suero (R7) a cada tubo.
3. Mezcle bien el contenido de los tubos agitándolos vigorosamente o con
un vórtex. Cierre herméticamente el tubo para evitar que se abra
durante el calentamiento. No perfore el tapón.
4. Con termobloque :
Caliente los tubos durante 6 minutos en un termobloque a 120ºC. Los
tubos deben colocarse en el bloque sólo cuando se haya alcanzado la
temperatura indicada (*)
O BIEN
Al baño María: :
Si se usa el baño María, caliente los tubos durante 3 minutos a 100ºC.
Los tubos deben ponerse al baño María sólo cuando se haya alcanzado
la temperatura indicada (*)
5. Saque con cuidado los tubos calientes del bloque o del baño María y
métalos en una centrifugadora. Centrifugue los tubos a 10 000 x g
durante 10 minutos. El sobrenadante se usa para detectar el antígeno
manano.
6. Analice los sobrenadantes usando el siguiente procedimiento. Una vez
aplicado el tratamiento del suero, deberá realizarse la prueba lo antes
posible. Si el análisis de los resultados indica que es necesario volver a
realizar el análisis, deberá tratarse para ello otra porción de suero.
(*) Para el éxito de la prueba es fundamental cumplir de manera estricta la
temperatura y los tiempos indicados, así como el uso de los materiales
recomendados. No confíe en la temperatura mostrada por el aparato:
compruebe que la temperatura cumple con las especificaciones. Para ello,
use un termómetro calibrado introducido en un tubo con aceite mineral.
Dentro del tubo se alcanzará una temperatura de 120ºC en el termobloque
y de 100ºC en el baño María.
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Nota :
- Todas las muestras de suero tratadas siguiendo este procedimiento
pueden usarse para realizar la prueba Platelia™ Aspergillus EIA, ya que
el procedimiento de tratamiento del suero es idéntico para ambas
pruebas.
- No guarde los sueros (controles, puntos de rango y muestras) después
del tratamiento.
Procedimiento de ensayo inmunoenzimático
Siga estrictamente el protocolo propuesto.
Cumpla las buenas prácticas de laboratorio.
1. Antes de usar los reactivos, deje que se ajusten a la temperatura
ambiente (entre +18ºC y +25ºC) durante 15 minutos.
2. Prepare la solución de lavado funcional, la solución sustrato cromógena
de reacción, los controles negativo y positivo y los puntos de rango.
3. Prepare un diagrama para la identificación de los sueros, controles y
puntos de rango en la microplaca.
Modo cuantitativo :
Los sueros de control y los puntos de rango (0,25, 0,50, 1,0 y 2,0 ng/mL)
pueden colocarse según este plan :
• A1: suero de control negativo (R3)
• B1: punto de rango de 0,25 ng/mL
• C1: punto de rango de 0,50 ng/mL
• D1: punto de rango de 1,0 ng/mL
• E1: punto de rango de 2,0 ng/mL (R4)
• F1: suero de control positivo (R5)
• G1: suero de control positivo (R5)
Modo cualitativo :
Los sueros de control y los puntos de rango de 0,50 y 0,25 ng/mL pueden
colocarse según este plan :
• A1: suero de control negativo (R3)
• B1: punto de rango de 0,25 ng/mL
• C1: punto de rango de 0,5 ng/mL (suero calibrador)
• D1: punto de rango de 0,5 ng/mL (suero calibrador)
• E1: suero de control positivo (R5)
4. Saque el soporte de placas y las tiras de micropocillos (R1) de la bolsa
de la placa. Vuelva a meter las tiras que no vayan a usarse en la bolsa
con el desecante y cierre la bolsa.
5. Mezcle el contenido del frasco de conjugado (R6) poniéndolo boca
abajo antes de usarlo. Añada 50 µL de conjugado a cada pocillo.
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A continuación, añada 50 µL de sobrenadante de suero tratado a cada
pocillo, de la forma indicada anteriormente. No añada las muestras de
suero a los pocillos antes que el conjugado.
6. Cubra la placa con una tapa para placas (o de alguna otra forma que
impida la evaporación) asegurándose de que toda la superficie quede
cubierta y hermética.
7. Incube la microplaca en una incubadora para microplacas en seco
durante 90 ± 5 minutos a 37ºC (±1ºC).
8. Quite la tapa para placas. Aspire el contenido de todos los pocillos a un
contenedor para residuos que contenga hipoclorito sódico. Lave la
placa 5 veces usando al menos 370 µL de solución de lavado funcional.
Después del último lavado, ponga la microplaca boca abajo y golpéela
suavemente sobre papel absorbente para eliminar el líquido restante.
9. Añada rápidamente 200 µL de solución sustrato cromógena de
reacción (R8+R9) a cada pocillo, evitando la exposición a la luz fuerte.
10. Incube la microplaca en la oscuridad durante 30 ± 5 minutos a
temperatura ambiente (entre +18ºC y +30ºC). No utilice película
adhesiva durante esta fase de incubación.
11. Añada 100 µL de solución de interrupción (R10) a cada pocillo,
siguiendo el mismo orden que cuando añadió la solución sustrato
cromógena de reacción. Mezcle bien.
12. Seque completamente la base de cada placa.
13. Lea la densidad óptica de cada pocillo a 450 nm (filtro de referencia de
620/630 nm). Las microplacas deberán leerse en un plazo de
30 minutos después de añadir la solución de interrupción.
11- CONTROL DE CALIDAD (CRITERIOS DE VALIDEZ)
Modo cuantitativo
Use los sueros de control y los puntos de rango en cada microplaca y en
cada prueba. Deberán cumplirse los siguientes criterios para validar el
procedimiento de la prueba:
• Valor de densidad óptica:
0,300 < DO del punto de rango de 0,5 ng/mL < 1,100
• Relaciones:
DO (punto de rango de 2,0 ng/mL) / DO (punto de rango de 0,5 ng/mL) > 2,1
DO (punto de rango de 1,0 ng/mL) / DO (punto de rango de 0,5 ng/mL) > 1,25
DO (punto de rango de 0,25 ng/mL) / DO (punto de rango de 0,5 ng/mL) < 0,85
DO (R3) / DO (punto de rango de 0,25 ng/mL) ≤ 0,80
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• Concentración de manano :
Concentración de R5 igual a la concentración indicada en el vial ± 20%.
Modo cualitativo
• Cálculo de los valores de corte (CO)
Sume los valores de DO obtenidos en cada pocillo con el punto de
rango de 0,5 ng/mL y divida entre 2.
• Criterios de validez
0,300 < CO < 1,100
DO R5 > CO
DO R3 < 0,7 CO
DO del punto de rango de 0,25 ng/mL < 0,85 CO
12- INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
MODO CUANTITATIVO
Establecimiento de la curva estándar
La curva estándar se representa con 4 puntos de rango (2,0, 1,0, 0,5 y
0,25 ng/mL) preparados a partir del suero calibrador R4. Los controles
positivo (R5) y negativo (R3) no se incluyen en la curva. Para lograr mayor
precisión, trace una curva sigmoidea con extrapolación representando la
concentración de manano en ng/mL en el eje x (escala logarítmica) y la
densidad óptica en el eje y (escala lineal).
Si el lector de placas no permite este tipo de representación, trace una
curva que conecte los distintos puntos de rango.
Determinación de la concentración de manano en los sueros
analizados
Puede usarse la curva de calibración para determinar la concentración de
antígeno manano (en ng/mL) para cada muestra analizada.
Interpretación de los resultados
• Los sueros con una concentración de manano inferior a 0,25 ng/mL
(C < 0,25) se consideran “negativos” en presencia de antígeno manano.
• Los sueros con una concentración de manano entre 0,25 y 0,5 ng/mL
(0,25 ≤ C < 0,5) se consideran “intermedios” en presencia de antígeno
manano.
• Los sueros con una concentración de manano igual o superior a
0,5 ng/mL (C ≥ 0,5) se consideran “positivos” en presencia de antígeno
manano.
54
• Los puntos de rango usados para trazar la curva de calibración no
permiten determinar de forma precisa las concentraciones superiores a
2,5 ng/mL. La prueba deberá repetirse después de diluir el suero a 1/5
en suero negativo (R3) para obtener una determinación más precisa de
la concentración de los sueros fuertemente positivos.
Nota : Platelia™ Cándida Ag está pensado para ser usado como ayuda en el
diagnóstico de la candidiasis invasiva. Los resultados positivos obtenidos
con Platelia™ Cándida Ag deberán tomarse en consideración junto a otros
procedimientos diagnósticos, tales como cultivos microbiológicos, examen
histológico de muestras para biopsia y pruebas radiográficas.
Se recomienda realizar pruebas diagnósticas regulares a pacientes de alto
riesgo para aumentar la sensibilidad y la positividad temprana de la
prueba.
MODO CUALITATIVO
Interpretación de los resultados
Interpretación de los resultados
• DO de la muestra < DO del punto de rango de 0,25 ng/mL: los sueros
se consideran “negativos” en presencia de antígeno manano.
• DO del punto de rango de 0,25 ng/mL ≤ DO de la muestra < CO: los
sueros se consideran “intermedios” en presencia de antígeno
manano.
• DO de la muestra ≥ CO: los sueros se consideran “positivos” en
presencia de antígeno manano.
Nota : Platelia™ Cándida Ag está pensado para ser usado como ayuda en
el diagnóstico de la candidiasis invasiva. Los resultados positivos
obtenidos con Platelia™ Cándida Ag deberán tomarse en consideración
junto a otros procedimientos diagnósticos, tales como cultivos
microbiológicos, examen histológico de muestras para biopsia y pruebas
radiográficas.
Se recomienda realizar pruebas diagnósticas regulares a pacientes de alto
riesgo para aumentar la sensibilidad y la positividad temprana de la
prueba.
Nota :
Es posible calcular un índice (I) para determinar la intensidad de los
resultados positivos:
I= DO del suero positivo / CO
Este índice permite expresar los resultados en modo semicuantitativo.
55
13- LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO
1. Una prueba negativa no descarta el diagnóstico de candidiasis
invasiva dada la bajísima concentración y la rápida eliminación del
manano durante la infección.
2. Una prueba negativa en antígeno manano deberá interpretarse también
junto con los resultados de pruebas de detección de anticuerpos
antimanano: incluso en el caso de la candidiasis invasiva, es más difícil
detectar el antígeno en pacientes que han dado positivo en anticuerpos
antimanano (véase el apartado 14, “Características específicas de
rendimiento”).
3. El rendimiento en la detección del antígeno manano en suero está
relacionado con la frecuencia de las pruebas realizadas al paciente 4. Se
recomienda realizar un seguimiento de los pacientes de alto riesgo y
pruebas diagnósticas de anticuerpos antimanano para aumentar la
sensibilidad y la positividad temprana de la prueba.
4. Deben seguirse el procedimiento de Platelia ™ Cándida Ag y su
interpretación de resultados cuando se analice la presencia de antígeno
manano en muestras. Se recomienda al usuario del kit que lea el
prospecto atentamente antes de realizar la prueba. En especial, deberá
seguirse el procedimiento de la prueba atentamente en lo referente al
pipeteado de muestras y reactivos, el lavado de placas y los tiempos de
las fases de incubación.
5. De no añadirse las muestras o reactivos según se especifica en el
procedimiento podría obtenerse un resultado negativo falso. Deberían
considerarse la posibilidad de repetir las pruebas con muestras
adicionales cuando exista sospecha clínica de candidiasis invasiva o
de un error de procedimiento.
6. Es posible que los pocillos con muestras de pacientes negativas se
contaminen con pocillos con muestras de pacientes positivas si el
contenido de un pocillo pasa a otro debido a una manipulación brusca
de la microplaca o a una mala técnica de pipeteado al añadir los
reactivos.
7. Se ha informado de una reacción cruzada en pacientes que han
recibido una transfusión de ciertos lotes de expansores del plasma con
hidroxietil almidón (como Hesteril 6 %), usados en el tratamiento de
insuficiencia circulatoria: hipovolemia, shock hemorrágico, shock
séptico.
56
14- CARACTERÍSTICAS ESPECÍFICAS DE RENDIMIENTO
14.1 MODO CUANTITATIVO
A) Estudios de reproducibilidad
• Variabilidad intraensayo :
Se analizaron cuatro sueros (uno negativo, uno intermedio a 0,48 ng/mL y
dos sueros positivos con concentraciones de 0,69 ng/mL y 1,39 ng/mL)
en 30 repeticiones. Los coeficientes de variación fueron del 3,1%, 6,9%,
9,1% y 7,0%, respectivamente.
• Variabilidad interensayo :
Se analizaron ocho sueros negativos y cuatro sueros positivos en cinco
series realizadas en un periodo de cinco semanas. Los coeficientes de
variación fueron inferiores al 20 % para las concentraciones de sueros
positivos e inferiores al 13 % para la DO de los sueros negativos.
B) Pruebas clínicas
ESPECIFICIDAD
Los resultados de especificidad se resumen en la siguiente tabla :
Concentración (ng/mL)
C < 0,25
0,25 ≤ C < 0,5
No hospitalizado
Número de
pacientes
(nº de sueros)
184 (184)
183 (99,5%)
1 (0,5%)
Hospitalizado, no
colonizado, con :
151 (200)
140 (92,8%)
7 (4,6%)
Categoría de
paciente
C ≥ 0,5
4 (2,6%)
- enfermedad de
Crohn
52 (52)
49 (98,1%)
3 (1,9%)
- colitis ulcerosa
43 (43)
41 (95,4%)
1 (2,3%)
1 (2,3%)
- aspergilosis
26 (35)
23 (88,5%)
1 (3,8%)
2 (7,7%)
- neumocistosis
4 (4)
4 (100%)
- criptococosis
13 (13)
12 (92,3%)
Hospitalizado,
colonizado por
Candida
41 (160)
35 (85,3%)
1 (7,7%)
4 (9,8%)
2 (4,9%)
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SENSIBILIDAD
Se realizaron pruebas clínicas en tres hospitales universitarios de Francia
para evaluar la sensibilidad de Platelia™ Cándida Ag. El estudio se realizó de
manera retrospectiva usando un total de 366 muestras de suero extraídas a
106 pacientes de distintas unidades del hospital: quirófano, hematología,
cuidados intensivos, quemados... Se aislaron levaduras de Cándida de
cultivos de sangre o muestras profundas de estos pacientes 8, 9.
En esta población de pacientes, la sensibilidad general de Platelia™ Cándida
Ag fue del 51,5 % (excepto en el 6,6 % de los pacientes, cuyos sueros tenían
una concentración de antígeno manano entre 0,25 y 0,5 ng/mL y se
consideran intermedios en presencia de antígeno manano) :
Sensibilidad
Número de
pacientes
(nº de sueros)
C ≥ 0,5
C ≥ 0,5 y
0,25 ≤ C < 0,5
C. tropicalis
10 (72)
70,0 %
70,0 %
C. glabrata
12 (31)
58,3 %
58,3 %
C. albicans
64 (208)
52,5 %
60,3 %
2 (5)
50,0 %
50,0 %
C. parapsilosis
10 (29)
37,5 %
57,5 %
C. krusei
8 (21)
20,0 %
20,0 %
Especie de
Cándida aislada
C. kefyr
La sensibilidad depende del número y la frecuencia de las muestras 13.
Estos estudios clínicos demostraron también la utilidad de combinar la
detección del antígeno manano con Platelia ™ Cándida Ag y de los
anticuerpos antimanano con Platelia™ Cándida Ab/Ac/Ak.
Los pacientes pueden clasificarse en 2 poblaciones considerablemente
distintas entre sí (prueba de chi cuadrado, p < 0,0005), como indican los
resultados de la siguiente tabla :
• Pacientes negativos en anticuerpos antimanano: la sensibilidad de
Platelia ™ Cándida Ag es del 78,8 % en casos de infección por
C. albicans y del 66,6 % en casos de infección por varias especies de
Cándida.
• Pacientes positivos en anticuerpos antimanano: es más difícil detectar
el antígeno manano.
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Sensibilidad de Platelia™ Candida Ag
Especie infecciosa
(nº de pacientes)
Pacientes
negativos en
anticuerpos
antimanano
Pacientes
positivos en
anticuerpos
antimanano
Todos los
pacientes
Varias especies de Cándida (106)
66,6 %
17,5 %
51,5 %
C. albicans (64)
78,8 %
16,1 %
52,5 %
La interpretación de las pruebas realizadas con Platelia™ Cándida Ag debe
por tanto incluir información sobre la situación inmune del paciente
respecto al manano de la Cándida.
La detección serológica combinada del antígeno manano y de los
anticuerpos antimanano demuestra una sensibilidad del 84,8 %
(exceptuando el 6,6 % de los pacientes con una concentración intermedia
de antígeno manano).
Sin embargo, algunos pacientes muestran una respuesta positiva a ambos
marcadores en distintos momentos durante el mismo episodio o
infección. La prognosis de la infección puede estar relacionada con el
equilibrio entre mananemia y la respuesta del anticuerpo antimanano 13.
14.2 MODO CUALITATIVO
A) Estudios de reproducibilidad
• Variabilidad intraensayo :
Se analizaron cuatro sueros (uno negativo, uno intermedio índice = 0,95 y
dos sueros positivos índice = 1,24 y 2,00) en 30 repeticiones. Los
coeficientes de variación porcentuales (%CV) fueron de 3,1 %, 7,2 %,
5,9 % y 5,9 %.
• Variabilidad interensayo :
Se analizaron diez sueros positivos y cuatro sueros intermedios en seis
series. Los coeficientes de variación porcentuales (%CV) fueron < 15 %
para las concentraciones de sueros positivos e intermedios.
B) Pruebas clínicas
ESPECIFICIDAD - SENSIBILIDAD
Teniendo en cuenta que en el modo cuantitativo las concentraciones
iguales o superiores a 0,5 ng/mL corresponden a los sueros positivos y las
inferiores a 0,25 ng/mL corresponden a los sueros negativos, las
características de rendimiento de la prueba en modo cualitativo son
equivalentes a las descritas en el apartado “Modo cuantitativo”.
59
15- CONTROL DE CALIDAD DEL FABRICANTE
Todos los reactivos que fabricamos se preparan siguiendo nuestro
sistema de calidad, que comienza en el momento de la recepción de la
materia prima y va hasta la comercialización final del producto.
Cada lote es sometido a un control de calidad y únicamente sale al
mercado si cumple con los criterios de aceptación.
En nuestra compañía se mantienen los registros relacionados con la
producción y control de todos y cada uno de los lotes.
60
16- BIBLIOGRAPHY
1. FAILLE, C., D. W. MACKENZIE, J. C. MICHALSKI, and D. POULAIN.
1992. Evaluation of an enzyme immunoassay using neoglycolipids
constructed from Candida albicans oligomannosides to define the
specificity of anti- mannan antibodies. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis.
11: p. 438-46.
2. FRIDKIN, S. K. and W. R. JARVIS. 1996. Epidemiology of nosocomial
fungal infections. Clin. Microbiol. Rev. 9: p. 499-511.
3. FUKAZAWA, Y. 1989. Antigenic structure of Candida albicans.
Immunochemical basis of the serologic specificity of the mannans in
yeasts. Immunol. Ser. 47: p. 37-62.
4. HERENT, P., D. STYNEN, F. HERNANDO, J. FRUIT, and D. POULAIN.
1992. Retrospective evaluation of two latex agglutination tests for
detection of circulating antigens during invasive candidosis. J. Clin.
Microbiol. 30: p. 2158-64.
5. JACQUINOT, P. M., Y. PLANCKE, B. SENDID, G. STRECKER, and
D. POULAIN. 1998. Nature of Candida albicans-derived carbohydrate
antigen recognized by a monoclonal antibody in patient sera and
distribution over Candida species. FEMS Microbiol. Lett. 169: p. 131-8.
6. PONTON, J., M. MORAGUES, and G. QUINDOS. 2002. Non-CultureBased Diagnostics, p. 395-425. In R. Calderone (ed.), Candida and
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patients with hematologic disease and cancer - review of the literature.
Eur. J. Med. Res. 7: p. 227-235.
8. SENDID, B., J. L. POIROT, M. TABOURET, A. BONNIN, D. CAILLOT,
D. CAMUS, and D. POULAIN. 2002. Combined detection of
mannanaemia and antimannan antibodies as a strategy for the
diagnosis of systemic infection caused by pathogenic Candida species.
J. Med. Microbiol. 51: p. 433-442.
9. SENDID, B., M. TABOURET, J. L. POIROT, D. MATHIEU, J. FRUIT, and
D. POULAIN. 1999. New enzyme immunoassays for sensitive detection
of circulating Candida albicans mannan and antimannan antibodies:
useful combined test for diagnosis of systemic candidiasis. J. Clin.
Microbiol. 37: p. 1510-1517.
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10. TIRABOSCHI, I. N., J. E. BENNETT, C. A. KAUFFMAN, J. H. REX, C.
GIRMENIA, J. D. SOBEL, and F. MENICHETTI. 2000. Deep Candida
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11. TRINEL, P. A., C. FAILLE, P. M. JACQUINOT, J. C. CAILLIEZ, and D.
POULAIN. 1992. Mapping of Candida albicans oligomannosidic
epitopes by using monoclonal antibodies. Infect. Immun. 60: p. 384551.
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diagnosis of systemic candidiasis. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 20:
p. 864-870.
20
102
103
Bio-Rad
3, boulevard Raymond Poincaré
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