19. Identificación de algunos grupos funcionales orgánicos de

19. Identificación de algunos grupos funcionales
orgánicos de interés bioquímico
Conrado Moreno Vivián
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Campus Universitario de Rabanales,
Edificio Severo Ochoa, 14071-Córdoba
RESUMEN
Las propiedades bioquímicas y las reacciones características de las
diferentes biomoléculas dependen de los distintos grupos funcionales
que las constituyen. En esta práctica se explicarán los principales grupos
funcionales orgánicos que suelen formar parte de los compuestos
biológicos y se realizarán algunas reacciones químicas específicas que
permiten la identificación de dichos grupos.
Palabras clave: ácidos carboxílicos, alcoholes, aldehídos, cetonas, ésteres.
Abreviaturas empleadas: DNPH: 2,4-dinitrofenilhidrazina.
1. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS
La composición química de los seres vivos es muy diferente a la de la
materia inanimada, y aunque presenta diferencias muy significativas entre las
distintas especies, también muestra muchas semejanzas en todos los
organismos. De los 92 elementos químicos naturales, sólo 27 son esenciales
para los seres vivos, casi todos ellos de número atómico bajo. Estos elementos
químicos presentes en los seres vivos se denominan bioelementos, y se
suelen clasificar en macroelementos (C, H, O y N), cada uno de los cuales
aparece en una proporción superior al 5% del peso seco de la materia viva y en
total constituyen aproximadamente el 90% de la biomasa; microelementos
(Ca, P, K, S, Cl, Na y Mg), que varían entre el 0,3 y el 5% del peso seco y
suponen casi el 10% de la biomasa; y oligoelementos o trazas (B, F, Fe, Co,
Cu, Mn, Zn, Mo, I, entre otros), que están presentes en cantidades muy
pequeñas. Estos bioelementos suelen formar parte de moléculas, denominadas
biomoléculas, que pueden ser de naturaleza orgánica o inorgánica. Entre las
inorgánicas están el agua, aniones (cloruros, fosfatos, carbonatos, etc.),
cationes (sodio, potasio, calcio, amonio, etc.) y algunos gases como el O2 y el
CO2. Entre las biomoléculas orgánicas destacan los carbohidratos, los lípidos,
las proteínas y los ácidos nucleicos, y sus correspondientes constituyentes
básicos, y metabolitos como el piruvato, el 2-oxoglutarato, el malato, etc.
La química de los seres vivos se organiza en torno al carbono, que al igual
que el hidrógeno, oxígeno y nitrógeno, puede formar enlaces covalentes por
compartición de electrones. Para completar sus respectivos niveles
electrónicos externos, el H necesita un electrón, el O dos, el N tres y el C
cuatro, por lo que estos elementos pueden formar, respectivamente, uno, dos,
tres o cuatro enlaces covalentes, entre sí o con otros elementos. Además, el C
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puede formar enlaces simples (C-C), dobles (C=C) o triples (C≡C), según
compartan entre sí 1, 2 ó 3 pares de electrones. Un átomo de C puede ser
primario, secundario, terciario o cuaternario según se enlace con 1, 2, 3 ó 4
átomos de C distintos, independientemente del número de valencias (enlaces
simples o dobles) usadas en cada enlace. Estos átomos de C unidos
covalentemente entre sí pueden formar cadenas lineales, ramificadas o cíclicas
que dan lugar a una enorme diversidad de compuestos orgánicos. Por lo tanto,
la mayoría de las biomoléculas son un “esqueleto carbonado” al que se unen
distintos conjuntos de átomos formando los denominados grupos funcionales
orgánicos, de los que dependen las características, propiedades y reacciones
químicas propias y específicas de cada biomolécula. Además, las biomoléculas
suelen ser polifuncionales ya que poseen diferentes tipos de grupos
funcionales, cada uno con propiedades y reactividad propia. Así, un
aminoácido se comporta como un ácido carboxílico ya que posee un grupo
carboxilo (–COOH) y como una amina porque también posee un grupo amino
(–NH2). A partir de los grupos funcionales presentes en una biomolécula, se
puede predecir su comportamiento químico y sus posibles reacciones. Las
enzimas reconocen la presencia y la disposición específica de estos grupos
funcionales en las moléculas y catalizan las transformaciones químicas
características de estos grupos.
Los principales grupos funcionales orgánicos de interés bioquímico son los
siguientes:
Hidroxilo (alcoholes): −OH
Carbonilo (aldehídos y cetonas): −COH (aldehído) y –CO− (cetona)
Carboxilo (ácidos carboxílicos): −COOH
Metilo: −CH3
Éster: −CO−O−
Éter: –O−
Amino (aminas): –NH2
Amido (amidas): −CO–NH2
Sulfhidrilo (tioles): −SH
Disulfuro: –S−S−
Fosforilo: −PO3H2
Nitrilo (cianhidrinas): −C≡N
Nitro (nitroderivados): −NO2
El objetivo de la práctica es familiarizar al alumno con los grupos funcionales
de interés bioquímico y con el reconocimiento y la identificación de dichos
grupos en compuestos orgánicos importantes. En concreto, se realizará la
identificación de alcoholes, aldehídos y cetonas, ácidos orgánicos y ésteres
mediante las reacciones específicas de estos grupos que se indican a
continuación. Para el estudio de las propiedades y características de los
principales grupos funcionales orgánicos se recomienda consultar la
bibliografía básica que aparece al final de este capítulo.
1.1. Identificación de alcoholes
Se realizará la identificación de alcoholes mediante la reacción con el cloruro
de acetilo, en la que se forma un éster y se libera HCl, lo que produce el
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calentamiento de la muestra y una acidificación que puede detectarse mediante
un papel indicador de pH.
ROH + CH3COCl → ROCOCH3 + HCl + calor
Además, es posible realizar la diferenciación entre alcoholes primarios
(RCH2OH), secundarios (R,R’CHOH) y terciarios (R,R’,R’’COH) mediante el
reactivo de Lucas (cloruro de Zn en HCl), que en el caso de alcoholes terciarios
produce rápidamente un cloruro apolar insoluble, lo que se manifiesta por un
aumento de la turbidez y la separación de una fase polar y otra apolar. Los
alcoholes secundarios reaccionan mucho más lentamente y los alcoholes
primarios no reaccionan.
1.2. Identificación de los grupos carbonílicos de aldehídos y cetonas
Estos compuestos se identificarán mediante el denominado test de Brady,
basado en la formación de 2,4-dinitrofenilhidrazonas tras la reacción de los
compuestos carbonílicos con la 2,4-dinitrofenilhidrazina (DNPH). Los
compuestos carbonílicos saturados producen un color amarillo, los insaturados
dan color naranja y los aldehídos o cetonas aromáticos forman un color rojo. La
diferenciación entre aldehído y cetona se puede realizar mediante el test de
Tollens, que en presencia de un aldehído produce un precipitado oscuro de
plata mientras que las cetonas no reaccionan.
1.3. Identificación de ácidos carboxílicos
Se realizará por el método del yodato-yoduro y una solución de almidón, un
ensayo que produce un color azul en presencia de ácidos orgánicos débiles.
1.4. Identificación de ésteres
La determinación de ésteres se realizará mediante la reacción con
hidroxilamina para formar ácidos hidroxámicos que producen una coloración
rojiza en presencia de iones férricos. Los ácidos carboxílicos y los fenoles
también reaccionan, por lo que la presencia de estos compuestos interfiere en
la determinación.
2. LISTADO DEL MATERIAL NECESARIO
Para la realización de esta práctica son necesarios los siguientes materiales
y productos:
2.1. Material
Tubos de ensayo.
Gradillas.
Pipetas automáticas o pipetas de diferentes volúmenes con propipetas.
Pinzas.
Papel indicador de pH.
Vasos de precipitado de 100 ml.
Baños de agua termostatizados.
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Viales eppendorf.
Bloque térmico.
Guantes.
Agitador Vortex.
Agitador magnético/calentador.
Campana de extracción de gases.
2.1. Reactivos y productos
Agua destilada.
Cloruro de acetilo.
Reactivo de Lucas (cloruro de Zn en HCl).
Reactivo de Brady (DNPH en ácido sulfúrico, agua y etanol).
Hidróxido sódico (NaOH) al 10%.
Nitrato de plata (AgNO3) al 5%.
Hidróxido amónico (NH4OH) 2 M.
Yoduro potásico (KI) al 2%.
Yodato potásico (KIO3) al 4%.
Hidrocloruro de hidroxilamina (NH2OH.HCl) 1N.
Disolución de hidróxido potásico (KOH) 2N en metanol.
Ácido clorhídrico (HCl) 2N.
Cloruro férrico (FeCl3) al 10%.
Disolución de almidón al 0,1%.
Muestras problema con los compuestos orgánicos que hay que identificar
(por ejemplo, glucosa, fructosa, etanol, acetaldehído, acetona, acetato,
piruvato, alanina, acetato de metilo, u otros compuestos elegidos por el
profesor).
Metanol.
Etanol.
Isopropanol.
Alcohol terbutílico.
Acetaldehído.
Acetona.
Ácido acético.
Acetato de metilo.
3. PROTOCOLO A REALIZAR
Cada grupo posee una serie de tubos con las 6 muestras problema que
contienen diferentes compuestos orgánicos. Se trata de identificar el grupo
funcional presente en cada una de ellas. Además, en cada una de las
determinaciones se realizarán controles con compuestos orgánicos conocidos.
Como norma general, no se debe emplear la misma pipeta o la misma punta de
pipeta automática para tomar reactivos o muestras diferentes. Además, es
obligatorio el uso de bata de laboratorio y se recomienda la utilización de
guantes durante la realización de la práctica. La utilización de algunos reactivos
se realizará en la campana de extracción.
3.1. Identificación de alcoholes
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Se procederá a la realización del ensayo con cloruro de acetilo en las
muestras problema para determinar cuales de ellas poseen grupos hidroxilos, y
en los que se obtenga un resultado positivo, se realizará el test de Lucas para
comprobar si el alcohol es primario, secundario o terciario. Estos ensayos
también se realizarán en controles con etanol (alcohol primario), isopropanol
(alcohol secundario) y alcohol terbutílico (alcohol terciario).
3.1.1. Ensayo con cloruro de acetilo para la detección de alcoholes
En 6 tubos de ensayo (numerados del 1 al 6) se colocan 0,5 ml de cada una
de las 6 muestras problema. En otros 3 tubos control (marcados con los las
letras Et, Ip y Tb) se añaden 0,5 ml de etanol, isopropanol y alcohol terbutílico,
respectivamente. A todos los tubos se les añaden 0,3 ml de cloruro de acetilo,
gota a gota con una pipeta automática, empleando guantes y en una campana
de extracción.
La reacción positiva de los alcoholes se manifiesta por un ligero
calentamiento de la mezcla de reacción y sobre todo por la acidificación debida
a la producción de HCl en la reacción, lo que se puede apreciar al aplicar una
gota de la mezcla sobre el papel indicador de pH. Esta reacción debe ocurrir en
los 3 tubos control (Et, Ip y Tb) y en las muestras problema que contengan
compuestos orgánicos con grupos alcohólicos.
3.1.2. Test de Lucas para la distinción de alcoholes primarios, secundarios y
terciarios
Preparación del reactivo de Lucas (para la práctica, se suministra ya
preparado por el profesor): Se añaden 68 g de ZnCl2 a 45 ml de HCl
concentrado, manteniendo fría la disolución.
En tubos de ensayo marcados con los números en los que se observó
reacción positiva en la determinación anterior se añaden 0,5 ml de las
correspondientes muestras problema y en 3 tubos control marcados con Et, Ip,
y Tb se añaden 0,5 ml de etanol, isopropanol y alcohol terbutílico,
respectivamente. A todos los tubos se les adicionan 3 ml del reactivo de Lucas
y se agitan durante 15 segundos. Si la solución se enturbia rápidamente por la
formación de un cloruro apolar insoluble en la reacción, se trata de un alcohol
terciario (alcohol terbutílico); si se enturbia muy lentamente, el compuesto es un
alcohol secundario (isopropanol); y si no hay reacción y la mezcla permanece
clara, el alcohol es de tipo primario (etanol).
3.2. Identificación de aldehídos y cetonas
Se realizará el test de Brady (reacción con DNPH) en las muestras problema
para identificar cuales de ellas poseen grupos carbonilos. A las muestras que
den reacción positiva se les realizará el test de Tollens con un reactivo de plata
para la distinción entre aldehído y cetona. Estos ensayos también se realizarán
en controles con acetaldehído y acetona.
3.2.1. Test de Brady (formación de 2,4-dinitrofenilhidrazonas)
Preparación del reactivo de Brady (para la práctica se suministra ya
preparado por el profesor): Se disuelve 1 g de 2,4-dinitrofenilhidrazina (DNPH)
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en 5 ml de H2SO4 concentrado y se añaden lentamente a una mezcla de 7 ml
de agua y 25 ml de etanol. Se filtra la mezcla para eliminar las partículas en
suspensión.
En 6 tubos de ensayo (numerados del 1 al 6) se colocan 0,5 ml de metanol y
en cada uno se añaden 50 µl de las correspondientes muestras problema. En
otros 2 tubos control (marcados con los las letras Al y Ce) se añaden 0,5 ml de
metanol y 50 µl de un aldehído (acetaldehído) o una cetona (acetona),
respectivamente (utilizar la campana de extracción). Se añade 1 ml del reactivo
de Brady a todos los tubos y se agita vigorosamente. La reacción positiva de
los compuestos con grupos carbonilos da lugar a una coloración amarilla,
naranja o roja, y debe ocurrir en los 2 tubos control (Al y Ce) y en las muestras
problema que contengan compuestos carbonílicos.
3.2.2. Test de Tollens para la distinción de aldehídos y cetonas
Preparación del reactivo de Tollens (para la práctica, se suministra ya
preparado por el profesor, pero debe utilizarse recién preparado): Se añaden
150 µl de NaOH al 10% a 10 ml de una disolución acuosa de AgNO3 al 5%.
Tras agitar, se añade gota a gota y con agitación, NH4OH 2 N hasta que se
disuelve el precipitado de AgOH formado previamente. Es conveniente tirar los
restos sobrantes de la disolución y lavar bien los tubos utilizados, a ser posible
con ácido nítrico diluido.
En tubos de ensayo limpios, en los que previamente se ha hervido NaOH al
10% (ya se suministran limpios y tratados con NaOH) y marcados con los
números de las muestras que dieron reacción positiva en la determinación
anterior, se añaden 0,5 ml de las correspondientes muestras problema. En
otros 2 tubos limpios, que se utilizarán como controles y se marcarán con las
letras Al y Ce, se añaden 0,5 ml de acetaldehído o de acetona,
respectivamente, en lugar de las muestras problema. A todos los tubos se les
adicionan 2,5 ml del reactivo de Tollens recién preparado y tras agitar se
espera 10 minutos. Si no se observa reacción, se calientan los tubos en un
baño de agua a 60 ºC durante 5 minutos. Si se forma un precipitado oscuro o
un tono de plata en las paredes del tubo, el compuesto presente es un
aldehído.
3.3. Identificación de ácidos carboxílicos
Se empleará el método del yodato-yoduro para la detección de ácidos
orgánicos. En viales eppendorf marcados del 1 al 6 se añaden 25 µl de las
muestras, 25 µl de una solución acuosa de KI al 2% y otros 25 µl de una
solución de KIO3 al 4% en agua. Como control, en otro vial marcado con Ac se
añaden 25 µl de ácido acético (u otro ácido orgánico) e idénticas cantidades de
las soluciones de yoduro y de yodato. Se tapan todos los viales y se introducen
en un bloque térmico a 100 ºC durante 1 minuto. Se enfrían los viales y se
añaden otros 25 µl de una solución reciente de almidón al 0,1%. En el vial
control y en las muestras que sean ácidos orgánicos la reacción producirá un
color azul.
3.4. Identificación de ésteres
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Se realizará una determinación con hidroxilamina que produce un complejo
de color púrpura o rojo en presencia de Fe(III). En tubos de ensayo limpios
numerados del 1 al 6 se añaden 0,5 ml de una solución de clorhidrato de
hidroxilamina 1 N en etanol y 50 µl de las correspondientes muestras a valorar.
En un tubo control marcado con Am se colocan los 0,5 ml de la solución de
hidroxilamina y 50 µl de acetato de metilo. A cada tubo se le añade, gota a
gota, una solución de KOH 2 N en metanol hasta que la mezcla tenga un pH de
9-10 (utilizar el papel indicador de pH) y se completan con otras 4 gotas
adicionales de la misma solución de KOH 2 N. Se calientan los tubos hasta
iniciar la ebullición colocándolos en un vaso de precipitado con agua en un
agitador/calentador. Se enfrían y se añade gota a gota HCl 2 N hasta un pH
aproximado de 3 (usar papel indicador de pH). Finalmente, se añade una gota
(unos 15 µl) de una solución de FeCl3 al 10%. En el control y en las muestras
con ésteres se produce una coloración roja. Hay que tener en cuenta que los
ácidos orgánicos detectados en la determinación anterior (apartado 3.3)
también producirán reacción en este ensayo, por lo que para concluir que la
muestra a valorar es un éster debe dar positivo sólo en este ensayo y no en el
anterior.
4. RESULTADOS ESPERADOS
Los resultados obtenidos en las diferentes determinaciones son sólo
cualitativos (reacción positiva o negativa) ya que se trata de identificar la
sustancia en cuestión y no se pretende cuantificar la concentración a la que se
encuentra en la muestra. Se debe completar la Tabla 1 (con signos +/-) para
las 6 muestras desconocidas y los respectivos controles en cada una de las
determinaciones realizadas y concluir qué grupo funcional está presente en las
sustancias de dichas muestras.
Tabla 1. Resultado de la identificación de grupos funcionales en las
diferentes muestras.
Alcoholes
Grupos carbonilos Ácidos Ésteres
Grupo
Muestra
(aldehído/cetona)
funcional
o
presente
control
Test de Test de
Test
Cloruro
Brady
Tollens
de
de
Lucas
acetilo
1
2
3
4
5
6
Et
Ip
Tb
Al
Ce
Ac
Am
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5. DISCUSIÓN Y COMENTARIOS
El alumno debe realizar una memoria de prácticas personal en la que se
presenten los resultados obtenidos y se discutan y comenten los mismos con la
ayuda de la información contenida en este protocolo experimental, la
bibliografía básica recomendada y las explicaciones impartidas durante la
práctica.
6. BIBLIOGRAFÍA
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Orgánica Experimental. Editorial Alambra.
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