Caracterización Morfológica de la Apoptosis (Suicidio Celular) en el

Caracterización Morfológica de la Apoptosis (Suicidio Celular) en el Cáncer de
Mama con Adyuvancia Quimioterápica Prequirúrgica
Gorodner, Ofelia Z. de - Avalos Rojas, Vertinaldo R. - San José, Claudio F.
García, Enrique O. - Galarza, Adriana C. - Imfeld, María V. - Benítez, José J.
Cátedra II Histología y Embriología - Facultad de Medicina - U.N.N.E.
Sargento Cabral 2001 - (3400) Corrientes - Argentina
Tel./Fax: +54 (03783) 422737 - E-mail: [email protected]
ANTECEDENTES
El suicidio celular se produce cuando una célula bajo determinados estímulos desencadena mecanismos que
determinan su propia muerte.
Existen tres mecanismos que explican el suicidio celular: 1 - Liberación intracelular de enzimas lisosómicas
(autólisis). 2 -Aumento de radicales libres y/o fallas en la detoxificación celular (oxidación). 3 - Proceso de
muerte genéticamente codificado : apoptosis .
A diferencia de la necrosis, la apoptosis consiste en una muerte celular genéticamente programada, que se
activa cuando la célula no es necesaria por más tiempo ( apoptosis fisiológica ), o cuando ha sido lesionada en
forma severa ( apoptosis patológica ).
Apoptosis fisiológica ocurre como parte del proceso del desarrollo y el mantenimiento de los tejidos. La
apoptosis patológica ocurre en aquellas células que han sufrido una lesión o infección, evitándose así la
difusión de la enfermedad. También puede activarse de forma inapropiada en enfermedades
neurodegenerativas como el mal de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, SIDA, neoplasias, infarto agudo
de miocardio, entre otras.
En el ámbito molecular, existen factores y genes que estimulan la muerte celular, tales como el Ced-3, ced-4,
TNF alfa , citoquinas del Linfocito T Citotóxico, el gen Reaper y otros como el Ced-9, el gen Crm-A que
actúan inhibiéndola . El mecanismo íntimo del cual se valen los genes para activar la muerte celular, consiste
en codificar y expresar una proteína que se denomina Enzima Convertidora de la Interleuquina 1 beta (ICE),
una endonucleasa que fragmenta al DNA. Este mecanismo de activador puede ser controlado en un primer
nivel, por el gen Crm-A, que actúa como un barrendero de proteasa, y en un segundo nivel, por inhibición de
los genes Ced-3 y Ced-4 por parte del gen Ced-9, lográndose la no codificación de la proteína ICE.
Es importante saber que el gen Ced-9 puede ser inhibido por una proteína viral llamada “p53”, motivo por el
cual los genes Ced-3 y Ced-4 quedan liberados, y en respuesta a una señal determinada, codifican y sintetizan
la proteína ICE, la que desencadena la muerte celular.
Todo lo expuesto hasta aquí, influye en la homeostasis o equilibrio tisular, ya que el equilibrio de los tejidos
que conforman el cuerpo humano depende de tres procesos celosamente regulados como lo son: la
supervivencia celular, proliferación celular y muerte celular, y una vez que el desarrollo embriológico de los
distintos tejidos está completo, la viabilidad de los mismos, depende del mantenimiento y renovación de sus
células. El proceso de proliferación de alguna forma debe ser controlado, y existen sustancias que se oponen a
la proliferación celular descontrolada, como los genes supresores de tumores, dentro de los cuales se cita al
p53, que evita la proliferación celular inhibiendo la actividad de los proto-oncogenes, desencadenando así la
muerte celular por apoptosis. En este caso el proceso de apoptosis se activa para eliminar las células que se
producen en exceso, o bien las que se han desarrollado de manera incorrecta, y/o aquellas que presenten un
daño genético constante y sostenido.
En cuanto a la supervivencia tisular, en la mayoría de los tejidos, ésta depende del aporte de señales de
supervivencia entre las mismas células que conforman un determinado tejido y de la matriz extracelular.
Existen enfermedades en las que el proceso apoptótico se encuentra aumentado, como el SIDA, y otras en las
que las células son incapaces de poner en marcha el proceso apoptótico, es decir, enfermedades que se asocian
a una inhibición de la apoptosis, como es el caso del cáncer.
En él, existe una pérdida de control sobre los factores de crecimiento, o bien ausencia de los distintos
mecanismos que pueden destruir sus células a través de la apoptosis. Algunos cánceres se caracterizan por
tener una incapacidad de iniciar el proceso apoptótico ante estímulos fisiológicos, característica que le es
propia principalmente a las metástasis y se relaciona con la expresión y sobreexpresión del gen Bcl-2. Esto
tiene mucha importancia también para el posterior tratamiento quimioterápico de la enfermedad, ya que el
mecanismo por el cual actúan algunos agentes quimioterápicos es induciendo la muerte celular a través de la
alteración de su fisiología desencadenándose el proceso de apoptosis.
De esto se deduce que la sobreexpresión del gen Bcl-2 que inhibe el proceso apoptótico, junto con otros genes
ya nombrados, puede provocar una resistencia al tratamiento del cáncer.También se han observado resistencia
de tumores a la quimioterapia y radioterapia por una deficiencia del gen p53, ya que algunos quimioterápicos
se valen de este gen para dar inicio a la apoptosis tumoral. El Grupo Universitario Napolitano I (GUN I),
determinó que la poca respuesta del tumor mamario al tratamiento quimioterápico se debe a una alteración en
la estructura quimica de la proteina p53 y una sobreexpresión del gen Bcl-2. En el Hospital Privado de la
Comunidad (Mar del Plata), estudiaron la expresión del Bcl-2 como evento temprano en la carcinogénesis y
que es reemplazado por la mutación del gen codificador de la p53 al progresar la neoplasia, coincidiendo
tambien con la falta de respuesta a la quimioterapia.
El propósito de este trabajo es objetivar las alteraciones morfológicas que tienen lugar en las distintas fases de
la apoptosis con metodología disponible, en una patología neoplásica de alta prevalencia modificada por los
efectos de esquemas terapéuticos empleados actualmente en el medio.
MATERIALES Y MÉTODOS
Se revisaron 30 piezas de resección quirúrgica de tumores malignos mamarios pertenecientes al archivo del
Servicio de Patología y Citodiagnóstico del Hospital “José Ramón Vidal” de Corrientes durante el período
1997-1999.
Se seleccionaron 4 casos en estadío clínico y de grado histológico semejantes, según la clasificación de
Bloom y Richardson, que habían recibido quimioterapia previa a la cirugía, con diferentes esquemas
terapéuticos y tiempos de administración.
Todas las piezas fueron fijadas en formol buffer al 10% y procesadas por el método de inclusión en parafina;
los cortes fueron sometidos a coloración con hematoxilina y eosina, montaje final y observados bajo
microscopía óptica en seco e inmersión.
Se revisaron múltiples campos microscópicos, determinando los cambios relacionados con apoptosis,
agrupándolos en las distintas fases de la misma y correlacionándolos con la respuesta clínica a la terapéutica
administrada, obtenida de las historias clínicas.
DISCUSIÓN DE RESULTADOS
De los 30 casos revisados, 25 (83,33 %) corresponden a carcinoma ductal y 5 (16,6%) a carcinoma lobulillar.
En los 30 casos (100 %) se observaron imágenes compatibles con muerte celular.
Para calificar los cambios relacionados con la apoptosis y de los conocimientos existentes en la literatura
acerca de las alteraciones fisiopatológicas , hemos podido establecer cuatro fases algorítmicas. Ellas son:
1 ) Fase de precondensación: Consiste en la codificación y activación de los genes responsables de la
producción de enzimas y proteínas necesarias para la apoptosis.
2 ) Fase de condensación: A nivel nuclear: Contracción nuclear. Fenómeno de marginación: consiste en la
condensación y agrupamiento de la cromatina alrededor de la membrana nuclear, dando imágenes de
mediaslunas.
A nivel citoplasmático: Contracción citoplasmática con una disminución del volumen celular de hasta el 30%,
dándole un aspecto condensado pero con organelas normales, las cuales no degeneran. El citoesqueleto es
degradado por proteasas calcio-dependientes como la “Calpaína”, la cual provoca el colapso celular.
Formación de ampollas a nivel de la membrana plasmática: producto de la contracción citoplasmática, la
membrana adopta un aspecto fruncido con la aparición de ampollas, proceso denominado “Zeiosis”.
Como consecuencia de los cambios que se producen en esta fase, la célula apoptótica pierde el contacto y la
capacidad de relacionarse con células vecinas.
3 ) Fase de fragmentación celular: A nivel nuclear: Clivaje del DNA: se produce cuando una endonucleasa
calcio-dependiente rompe el DNA formándose oligonucleosomas con 180 a 200 pares de bases, mostrando un
patrón en escalera en la electroforesis. Fragmentación nuclear o cariorrexis: responde a la destrucción del
DNA. Los fragmentos del DNA son envueltos por membrana nuclear, originando “esferas densas nucleares”.
A nivel citoplasmático: A partir de la formación de ampollas, vistas en la fase de condensación, el citoplasma
celular se fragmenta originando pequeñas piezas denominadas “cuerpos apoptóticos” rodeados y sellados por
membrana plasmática. Estas estructuras varían en tamaño y composición, algunas presentan en su interior
organelas citoplasmáticas bien preservadas, acompañadas de esferas densas nucleares, mientras que otras
carecen del componente nuclear.
4) Fase de fagocitosis: Los cuerpos apoptóticos son fagocitados y degradados por las enzimas lisosomales de
las células vecinas. La presencia de membrana plasmática en la estructura de dichos cuerpos evita que el
contenido celular sea volcado al espacio extracelular, explicándose de esta manera la ausencia de la respuesta
inflamatoria en la apoptosis.
Los 4 casos seleccionados (13,3 %) para este estudio que recibieron quimioterapia previa, pertenecen al grupo
de carcinoma ductal. Tras la observación de los mismos a la microscopía óptica se detectó:
A - Células retraídas de citoplasma intensamente acidófilo, con marcada reducción de su volumen, que
muestran un núcleo básofilo intenso,con condensación de la cromatina y que se corresponden con la fase de
condensación de la apoptosis.
B - Células retraídas rodeadas por espacios claros, que también muestran condensación nuclear , pero que
observadas a mayor aumento muestran pequeñas estructuras esféricas, basófilas, distribuidas en el citoplasma,
que corresponden a fragmentos nucleares en el inicio de la fase de fragmentación nuclear.
C - Células que como característica importante muestran el núcleo dividido en varios fragmentos intensamente
basófilos dentro de una escasa masa citoplasmática . A mayor aumento se observan con mayor definición a los
fragmentos nucleares denominados cuerpos densos nucleares, imágenes compatibles con una etapa mas
avanzada de la fase de fragmentación nuclear .
D - Presencia de estructuras eosinófilas homogéneas de diferentes tamaños, esféricas, de contornos lisos, que
corresponden a fragmentos citoplasmáticos de una o varias células apoptóticas. Dichos fragmentos reciben el
nombre de “cuerpos apoptóticos”.
Los puntos C y D corresponden a la fase de fragmentación celular del proceso apoptótico. ( Figura 1 )
a. Fase de condensación nuclear
b. Fase de fragmentación nuclear
c. Cuerpos apoptóticos
Figura 1. Células carcinomatosas en distintas fases del proceso de apoptosis. H-E 1000 X.
De los 4 casos tratados previamente con quimioterapia: FAC (fluoruracilo, adriamicina, ciclofosfamida), CMF
(ciclofosfamida, metotrexato, fuoruracilo), MMM (mitomicina, metotrexato, minoxantona); 3 han respondido
favorablemente al tratamiento, presentando signos histopatológicos reveladores de apoptosis; lo que sugiere la
presencia del gen P 53, de fundamental importancia para gatillar dicho proceso.
El 4° caso presentó una escasa respuesta al tratamiento quimioterápico, mostrando pocas áreas aisladas con
signos de apoptosis, lo que se infiere puede obedecer a la presencia de una proteína p53 anómala.
CONCLUSIONES
1 - Si bien los estudios de biología molecular son los más específicos y sensibles para detectar las alteraciones
genéticas que determinan la apoptosis, es posible e importante objetivar los cambios histopatológicos
evidenciables a nivel de microscopía óptica, los que pueden brindar datos correlacionables con la respuesta
clínica al tratamiento en tumores malignos y aportes importantes en los aspectos del pronóstico y tratamiento.
2 - Profundizar los conocimientos acerca del comportamiento biológico de los tumores malignos abre las
puertas hacia nuevas alternativas terapéuticas, especialmente la terapia transgénica en aras de hallar una
posible solución genética de la enfermedad.
BIBLIOGRAFÍA
1 - Stanley J. Korsmeyer. Trends in Genetic. Vol. 11, n° 3. Pág. 101-105. Marzo 1995.2 - Seamus, J.; Martin Douglas, R. Green . Cell. Vol. 82, n° 3. Pág. 349-352. Agosto 1995.3 - Zarco P., Bases Moleculares de la Cardiología Clínica. España. Pág. 231. 1996.4 - Muñoz Negrete, Rebollida Fernandez, Gutierrez Ortiz. Apoptosis y Neuroprotección. Internet. 1999.5 - Monserrat, A.J. Boletin de la Sociedad Argentina de Patología. Argentina. Pág. 8, 9. 1998.6 - Steller, H. Science. Pag. 1445-1449. Vol. 267. 1995.7 - Nagata, S; Golstein, P. Science. Pag. 1449-1456. Vol. 267. 1995.8 - Thompson, C.B. Science. Pag. 1456-1462. Vol. 267. 1995.9 - Xia, Z; Dickens, M;Raingeaud, J et al. Science. Pag.1326-1331. Vol. 270. 1995.10 - Newell, M. K. et. al. Nature. Pág. 286. Vol. 347. 1990.11 - Gougeon, M.L.; Montagnier, L. Sciencie. Pág. 1269. Vol. 260. 1993.12 - Cohen, J.J. Hosp. Pract. Pág. 35-43. Vol. 28. 1993.13 - García, I.; Martinou, I.; Tsujimoto, Y.; Martinou, J.C. Sciencie. Pág. 302-304. Vol. 258. 1992.14 - Carlomagno, C.; Perrone, F.; Gallo, C.; De Laurentiis, M.; Pettinato, G.; D’Antonio, A.; De Placido, S.
Journal of Clinical Oncology. Pag. 2702-2708. Octubre 1996.15 - Suwiwat, S.; Oda, H.;Schimuzu, Y; Ischikawa, T. International Journal of Cancer. Pag 23-26. Julio 1997.16 - Sundblad, A. S.; Chumbita, R.L.; Zoppi, J.A. Medicina, Bs. As. Pag 662-666. Vol. 57. 1997.