01/11 RBMEGS07 REALPURE SPIN VIRAL DNA/RNA KIT Ref. RBMEGS07 100 Test 1. INTRODUCCIÓN 1. INTRODUCTION REALPURE Spin Viral DNA/RNA Kit is designed for the rapid simultaneous purification of viral DNA and RNA from cell –free samples such as serum, plasma and cerebrospinal fluid. REALPURE Spin Viral DNA/RNA Kit está designado para una rápida purificación simultánea de ADN y ARN viral a partir de muestras libres de células, como suero, plasma y fluido cerebroespinal. Viruses, when lysed by detergent and Proteinase K, release total viral nucleic acids. Then, in the presence of a chaotropic salt, viral nucleid acids bound selectively to glass fiber membrane in a special centrifuge tube. The nucleic acids remain bound while a series of a rapid wash and spin steps removes contaminating cellular components. Finally, low salt elution removes the viral nucleic acids from the glass fiber membrane. The process does not require nucleid acids precipitation, organic solvent extractions, or extensive handling of the nucleid acids. Los virus cuando son lisados con un detergente y proteinasa K, liberan los ácidos nucleicos virales. Luego, en presencia de sales caotrópicas, los ácidos nucleicos virales se unen selectivamente a una membrana de sílica en una spin columna. Los ácidos nucleicos permanecen unidos mientras que una serie de lavados y pasos de centrifugación eliminarán los componentes celulares contaminantes. Finalmente, con un tampón de elución los ácidos nucleicos virales serán eluidos de la membrana. Este proceso no requiere precipitaciones alcohólicas, extracciones con disolventes orgánicos, o extensivos manejos de ácidos nucleicos. The REALPURE Spin Viral DNA/RNA Kit can be used for the isolation of viral RNA and DNA from a broad range of RNA and DNA viruses. However, performance cannot be guaranteed for every virus species and must be validated by the costumer. El REALPURE Spin Viral DNA/RNA Kit puede ser utilizado para la extracción de ADN y ARN viral a partir de un amplio rango de virus de ADN y ARN. No obstante, el éxito no se puede garantizar para todas las especies de virus y deberá ser validada por el usuario Sistema de producción certificado bajo norma ISO Production system certified under ISO 1/5 REAL es una marca registrada por Durviz, s.l. 2. COMPONENTES DEL KIT KIT COMPONENTS Tampón de Lisis Viral Viral Lysis Buffer Tampón de Lavado Viral 1* Viral Wash Buffer 1* Tampón de Lavado Viral 2* Viral Wash Buffer2* Tampón de Elución Elution Buffer Proteinasa K * Proteinase K* RNA Carrier * Viral Spin Columnas Viral Spin Columns Tubos de Recogida Collection Tubes Ref. Ref. RBMEGS07 100 preps Tª REA01V 25 ml RT REA03V 36 ml RT REA04V 20ml RT REA05 15 ml RT REA02 40 mg 4ºC REA11 620 µg -20ºC RSCV01 100 unid. RT R30 200 unid. RT (*) (*) Estas soluciones deben ser preparadas como se indica en el apartado de preparaciones preliminares. These solutions must be prepared as indicated in the Preliminary Preparations section of the protocol. Equipos y reactivos necesarios no incluidos en el kit: Equipment and additional reagents required * 100 % Ethanol * 1.5 ml microtubes * Microcentrifuge. * Etanol 100 %. * Microtubos de 1.5 ml * Microcentrifuga. 3. PROTOCOLO GENERAL GENERAL PROCEDURE 3.1 Consideraciones preliminares 3.1 Preliminary conditions • • El tampón de Lisis Viral (REA01V) y el Tampón de Lavado Viral 1 (REA03V) contienen guanidine hydrochloride, el cual puede formar componentes reactivos cuan se combinan con lejía. Ambos tampones son agentes irritantes, por esta razón recomendamos el uso de guantes y gafas para su manipulación. en caso de contacto con la piel o ojos ,lavar con abundante agua. 2/5 Viral Lysis Buffer (REA01V) and Viral Wash Buffer 1 (REA03V) contain guanidine hydrochloride, which can form highly reactive compounds when combined with bleach. Both are irritant agents, for this reason we recommend to use gloves and glasses for its manipulation. REAL es una marca registrada por Durviz, s.l. 01/11 RBMEGS07 3.2 Preparaciones preliminares 3.2 Preliminary Preparations • • • • • • • Disolver la proteinasa K en 2 ml de agua libre de nucleasas y conservar a –20ºC. Se recomienda realizar varias alícuotas para evitar demasiados ciclos de descongelado-congelado. A esta temperatura es estable durante 1 año. Añadir 20 ml Ethanol 100 % al Viral Wash Buffer 1 (REA03V) .Mantener el envase bien cerrado para evitar la evaporación del etanol. Añadir 80 ml Ethanol 100 % al Viral Wash Buffer 2 (REA04). Mantener el envase bien cerrado para evitar la evaporación del etanol. Carrier RNA: El protocolo de purificación recomendado utiliza 5.6 µg carrier RNA por muestra. Si usted desea utilizar menos carrier RNA por muestra, es necesario validar la cantidad de carrier RNA necesario para cada tipo de muestra y aplicaciones posteriores. Los eluidos que se obtienen con este kit contienen tanto ácidos nucleicos virales como carrier RNA, y las cantidades de carrier RNA pueden exceder las cantidades de ácidos nucleicos virales. Los cálculos de cuanta cantidad de eluido deberá ser añadido a las aplicaciones posteriores deberá basarse en las cantidades de carrier RNA añadido. Para obtener niveles altos de sensibilidad en reacciones de amplificación, puede ser necesario ajustar la cantidad de carrier RNA añadida al Viral Lysis Buffer. Protocolo de preparación de Carrier RNA , 5.6 µg de carrier RNA por muestra: 1. Añadir 620 µl de Agua libre de nucleasas a los 620 µg de carrier RNA suministrado en un microtubo del kit para obtener una solución stock de 1 µg/ µl 2. Mezclar y alicuotar, conservar a -20ºC. Evitar repetidos ciclos de calentamientoenfriamiento. 3. Calcular el volumen de la mezcla Viral Lysis Buffer/carrier RNA requerido para procesar todas las muestras a analizar simultáneamente. Por ejemplo, para preparar Viral Lysis Buffer conteniendo carrier RNA para procesar 10 muestras, mezclar 58.8 µl carrier RNA stock solution con 2.1 ml Viral Lysis Buffer. 4. Descongelar la cantidad requerida de la solución stock de carrier a 1 µg/ µl 5. En un tubo estéril añadir el volumen de la solución stock al volumen de Viral Lysis Buffer requerido. Mezclar suavemente con pipeta. 6. Conservar a 4ºC hasta su uso. Utilizar este tampón así preparado antes de 1 hora • • • • • 3/5 Dissolve the proteinase K in 2 ml of nucleasefree water and store at –20ºC. It is recommended to do several aliquots to avoid too many thaw/freeze cycles. At this temperature it is stable for 1 year. Add 20 ml Ethanol 100 % to the Viral Wash Buffer (REA03V). Keep the container closed to avoid the ethanol evaporation Add 80 ml Ethanol 100 % to the Viral Wash Buffer 2 (REA04). Keep the container closed to avoid the ethanol evaporation. Carrier RNA: The recommended purification protocol uses 5.6 µg carrier RNA per sample. If you wish to use less carrier RNA per sample, you need to validate the amount of carrier RNA needed for each sample type and downstream applications. Eluates from this kit contain both viral nucleic acids and carrier RNA, and amounts of carrier RNA will greatly exceed amounts of viral nucleic acids, calculations of how much eluate to add to downstream amplifications should therefore be based on the amount of carrier RNA added. To obtain highest levels of sensitivity in amplification reactions, it may be necessary to adjust the amount of carrier RNA added to Viral Lysis Buffer. To prepare Carrier RNA 5.6 µg carrier RNA per sample: 1. Add 620 µl RNase free-water to 620 µg carrier RNA supplied in a tube with the kit, to obtain 1 µg/ µl carrier RNA stock solution. 2. Mix thoroughly and aliquot at -20ºC.Avoid repeated freezing and thawing. 3. Calculate the volume Viral Lysis Buffer/carrier RNA mix required to process the desired number of samples simultaneously. For example to prepare Viral Lysis Buffer containing carrier RNA for processing 10 samples, mix 58.8 µl carrier RNA stock solution with 2.1 ml Viral Lysis Buffer. 4. Thaw the required amount of 1 µg/ µl carrier RNA stock solution 5. In a sterile tube, add the volume of carrier RNA stock solution to the volume Viral Lysis Buffer. Mix gently by pipetting up and down. 6. Store at 4ºC until use. Use the buffer within 1 hour. REAL es una marca registrada por Durviz, s.l. 3.3 Protocolo para la extracción de ADN y ARN viral a partir de suero, plasma y fluidos biológicos Pipetear 25 µl Proteinasa K en un microtubo de centrifuga estéril. 2. Añadir 200 µl de plasma o suero en el microtubo. Si usted procesa muestras menores de 200 µl, ajustar el volumen final a 200 µl utilizando PBS o 0.9% NaCl. 3. Añadir 200 µl de Tampón de Lisis Viral (conteniendo 5.6 µg carrier RNA). Cerrar el microtubo y vortex vigorosamente durante 20 segundos. 4. Incubar a 56ºC durante 20 minutos. 5. Centrifugar brevemente el microtubo para recoger las gotas de la tapa. 6. Añadir 250 µl etanol 100% a la muestra. Agitar mediante vortex durante 15 segundos. 7. Incubar el lisado por 5 minutos temperatura ambiente. 8. Añadir el lisado a la Viral Spin Column con un tubo de recolección.. 9. Centrifugar la columna a 8.000-10.000 rpm por 1 min. Eliminar el tubo de recolección. Colocar la spin columna en un nuevo tubo de recolección. 10. Lavar la columna con 500 µl de Tampón de Lavado Viral 1 con etanol. 1. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. Centrifugar la columna a 8.000-10.000 rpm por 1 min. Lavar la columna con 500 µl de Tampón de Lavado Viral 2 con etanol. Centrifugar la columna a 10.000-12.000 rpm por 1 min. Volver a lavar la columna con 500 µl de Tampón de Lavado Viral 2 con etanol. Centrifugar la columna a 10.000-12.000 rpm por 1 min. Centrifugar la spin columna a máxima velocidad durante 2 minutos para eliminar el etanol residual. Eluir con 30-50 µl de Tampón de Elución añadido al centro de la membrana de la columna. Incubar a temperatura ambiente por 1 minuto. Centrifugar la spin columna a máxima velocidad durante 1 minuto. El microtubo ahora contiene los ácidos nucleicos virales. eliminar la spin columna. Conservar el ADN/ARN viral a -80ºC o utilizarlo en las aplicaciones posteriores inmediatamente. 3.3 Protocol for Viral Nucleid Acids from plasma,serum and cell free body fluids Pipet 25 µl Proteinase K into a sterile microcentrifuge tube. 2. Add 200 µl of plasma or serum into the microcentrifuge tube. If you are processing less than 200 µ l of sample, adjust final volume to 200 µl using PBS or 0.9% NaCl. 3. Add 200 µl Viral Lysis Buffer (containing 5.6 µg carrier RNA). Close the tube lid and mix by vortexing for 20 seconds. 4. Incubate at 56ºC for 20 minutes. 5. Briefly centrifuge the 1.5 ml tube to remove drops from the inside of the lid. 6. Add 250 µl ethanol 100% to the sample. Vortex for 15 seconds . 7. Incubate the lysate for 5 minutes at room temperature. 8. Add the lysate to the Viral Spin Column in a collection tube. 9. Centrifuge the column at 8.000-10.000 rpm for 1 min. Discard the collection tube. Place the spin column in a new collection tube. 10. Wash the column with 500 µl Viral Wash 1. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 4/5 Buffer 1 with ethanol. Centrifuge the column at 8.000-10.000 rpm for 1 min. Wash the column with 500 µl Viral Wash Buffer 2 with ethanol. Centrifuge the column at 10.000-12.000 rpm for 1 min. Wash the column again with 500 µl Viral Wash Buffer 2 with ethanol. Centrifuge the column at 10.000-12.000 rpm for 1 min. Centrifuge the spin column at maximum speed for 2 minutes to remove any residual Wash Buffer. Elute with 30-50 µl Elution Buffer adding to the centre of the cartridge. Incubate at room temperature for 1 minute. Centrifuge at maximum speed for 1 minute. The recovery tube contains purified viral nucleic acids. Discard the spin column. Store purified viral DNA/RNA at -80ºC or use RNA/DNA for the desired downstream application REAL es una marca registrada por Durviz, s.l. 01/11 RBMEGS07 4. GUIA DE PROBLEMAS Y POSIBLES SOLUCIONES TROUBLESHOOTING We recommend contacting REAL’s laboratory technical services at Durviz s.l. for any additional question about work protocols or any problem that may appear while you are working. Recomendamos que no duden en ponerse en contacto con el servicio técnico del laboratorio REAL en Durviz s.l. para cualquier consulta adicional respecto a los protocolos de trabajo o problemas que puedan surgir durante el trabajo. 5/5 REAL es una marca registrada por Durviz, s.l.