establecimiento de genealogas en un sistema de pie de cra

PROYECTO SIP 2007-2161
ESTABLECIMIENTO DE GENEALOGÍAS EN UN SISTEMA DE PIE DE CRÍA
MANEJADO BAJO EMPADRE MÚLTIPLE
Resumen
La importancia de la ganadería bovina esta circunscrita en todos los aspectos
de la vida del campo nacional. Esto implica la necesidad de incrementar su
eficiencia. La genética como parte intrínseca de los animales tiene el potencial
de mejorar el déficit observado sobre todo en la ganadería de carne, mediante
estrategias de selección y reproducción ordenada y, sobre todo, organizada.
Una parte fundamental en esta organización es la formación de estructuras
genealógicas que ayuden a la estimación de parámetros y valores genéticos
útiles como criterios de selección de ejemplares sobresalientes. Sin embargo
las condiciones del manejo reproductivo en la mayoría de los sistemas
productores de carne son una limitante para tal fin. Este proyecto tuvo como
objetivo la estructuración de la genealogía de un hato de ganado Braford
destinado a pie de cría y manejado bajo empadre múltiple. La estructuración de
la genealogía se realizó utilizando un panel de marcadores microsatélites. El
estudio demostró que puede existir un gran margen de error en las
suposiciones de maternidad. Los resultados indicaron además que el uso de
cierto panel de marcadores debe responder a las características inherentes a
cada población analizada. Por otro lado, se encontró que el efecto de una
genealogía errónea podría representar una limitante para el progreso genético
por la sobreestimación de los parámetros y valores genéticos empelados como
criterios de selección.
Introducción
La ganadería bovina de carne tiene un valor socioeconómico muy importante.
Con una producción y consumo anual de 2.2 y 2.5 millones de toneladas
métricas, respectivamente (datos preliminares de 2007), existe un déficit que
conduce a la importación de una considerable cantidad, principalmente desde
los Estados Unidos (más de 400 mil de toneladas métricas en 2007; Datos del
USDA). Por otra parte, México exportan regularmente 1.5 millones de becerros
anualmente a los Estadios Unidos, lo que incrementa la demanda en el sistema
de producción.
En los últimos años el mejoramiento genético se ha considerado como una
medida para aumentar la productividad de los hatos ganaderos productores de
carne. Esta herramienta involucra principios biológicos, económicos y
matemáticos para encontrar la mejor estrategia de empleo de la varianza
genética en las poblaciones animales para maximizar su mérito.
Una vez establecido el objetivo del sistema de producción, uno de los aspectos
más importantes de un programa de mejora genética son las evaluaciones
genéticas, éstas tienen como finalidad el procesamiento de los datos
productivos, su descomposición en componentes genéticos y ambientales y
finalmente de la producción de valores genéticos que pueden ser utilizados en
la selección de los ejemplares sobresalientes.
Para el diseño correcto de las evaluaciones genéticas es fundamental contar
con la estructura de relaciones de parentesco (datos genealógicos) que
1
garanticen la estimación no sesgada de parámetros y valores genéticos que
son empleados como herramientas para la selección de los progenitores. Sin
embargo, el uso de prácticas reproductivas como el empadre múltiple, dificulta
la implementación de las evaluaciones genéticas. En muchos sistemas de
producción de condiciones extensivas, entre ellos los enfocados a producir pie
de cría para la producción de carne, el empadre múltiple es la forma de
reproducción mas frecuente lo cual hace necesario implementar estrategias
para definir la estructura genealógica del hato antes de realizar cualquier
programa de mejora genética.
El uso de marcadores moleculares microsatélites para la asignación y
verificación de la paternidad y en consecuencia la estructuración de la
genealogía ha demostrando su poder y versatilidad en diferentes sistemas de
producción en diferentes especies animales, su empleo ha permitido
estructurar genealogías en los sistemas productivos manejados bajo empadre
múltiple y ha sentado las bases para la estimación de parámetros genéticos
poblacionales ayudando a su vez a su mejoramiento genético.
Por lo tanto, el proyecto propuesto tuvo como objeto principal, el
establecimiento de la base genealógica en un sistema de producción bovina de
pie de cría manejado bajo empadre múltiple utilizando un panel de marcadores
microsatélites.
Métodos y materiales
El proyecto se dividió en dos fases, una de campo y otra de laboratorio.
Durante la fase de campo, se tomaron muestras de sangre a bovinos de raza
Braford, pertenecientes a un rancho productor de pie de cría ubicado en el
Municipio de San Juan de Sabinas Coahuila, a 28º 08’ 41” Latitud Norte, 101º
31’ 28” Longitud Oeste, y a una altitud de 472.44 msnm.
Se recolectaron 3 ml de sangre de la vena ó arteria coccígea de cada animal
con la ayuda de un adaptador y aguja Vaccutainer™ (0.8x38mm) y tubos
MONOJECT con EDTA K3 (15%) como agente anticoagulante, al terminar la
toma de muestras se almacenaron en frío para su traslado al Centro de
Biotecnología para la posterior extracción del ADN y procesamiento de cada
muestra.
La segunda fase, de laboratorio, se llevó a cabo en el Laboratorio de
Biotecnología Animal del CBG y consistió en la extracción y análisis de ADN de
las muestras de campo.
El aislamiento de ADN se realizó utilizando el estuche comercial de la
compañía Promega Wizard(R) (DNA Purification System) con la siguiente
metodología:
1.- Colocar 500 µl de sangre completa en un tubo eppendorf de 1.5 ml y
agregar 900 µl de solución Lisis I (solución preparada con 62 ml de NH4Cl 0.5
M, 4 ml de NaHCO3 0.5 y 40 µl de EDTA 0.5 M en 100 ml de agua destilada y
aforar a 200ml)
2.- Incubar las muestras en hielo (Sangre + Solución Lisis I) durante 10 min,
mezclando bien por inversión de manera suave.
3.- Centrifugar durante 5 min a 5000 rpm (microcentrífuga HERMLEZ 160M).
2
4.- Descartar sobrenadante y resuspender la pastilla de leucocitos obtenida, en
1ml de solución Lisis I, incubar 5 min en hielo y centrifugar como en el paso
anterior. Repetir la operación hasta obtener una pastilla limpia (blanca). El
último lavado se realiza con la solución de lisis del estuche Promega
Wizard(R).
5.-Lisis de núcleo. Agregar 500µl de solución de lisis de núcleo, mezclar por
inversión hasta disolver la pastilla y proseguir con vortex por 20 s (Mini Vortex
VWR3434).
6.- Precipitación de proteínas. Añadir 165 µl de solución de precipitación de
proteínas, y proceder al vortex por 20 s. Centrifugar a 13,000 por 30 s. (Paso 5
y 6 se realizan en el mismo tubo).
7.- Precipitación de ADN y rehidratación. Transferir el sobrenadante a un nuevo
tubo conteniendo 500 µl de Isopropanol, mezclar y centrifugar a 13,000 rpm por
3 min.
8.- Descartar el sobrenadante, adicionar etanol al 70% (mismo volumen que el
de Isopropanol) mezclar y centrifugar a 13,000 rpm por 20s. Aspirar el etanol y
secar la pastilla por aire seco (de 10 a 15 min). Rehidratar la pastilla de ADN
con el volumen apropiado de la solución de rehidratación de ADN (10Mm Tris,
1mM EDTA) por una hora a 65 ºC en el termomixer (Eppendorf Thermomixer) o
durante toda la noche a 4ºC.
La concentración del ADN extraído se cuantificó con el programa Gel-Image de
Kodak 1 Digital Science®, que consistió en lo siguiente: en un gel de agarosa
(1.5%) se depositó una mezcla de 1 µl de ADN de la muestra a cuantificar + 1
µl de buffer de corrimiento adicionado con Sybergold 1, en el primer y último
carril del gel se depositó 1 µl de marcador de densidad (Lambda ADN 500 µg
(0.55 µg/µl, GIBCO BRL®). Una vez obtenidos los patrones electroforéticos se
calculó la concentración de ADN de cada una de las muestras mediante el
programa y se formaron alícuotas de trabajo a una concentración de 50 ng/µl
en un volumen final de 50 µl.
Para el análisis genético del ADN de todas las muestras (crías, toros y vacas),
se probó un panel de 19 marcadores microsatélites disponibles previamente
optimizados en el Laboratorio de Biotecnología Animal (CBG-IPN) y
recomendados por la FAO/ISAG para llevar a cabo pruebas de paternidad en
bovinos. De ellos solamente se seleccionaron aquellos que fueron más
informativos, es decir, con mayor rango alélico, contenido de información
polimórfica (PIC), así como el menor grado de dificultad técnica que
presentaron durante su amplificación. Los marcadores microsatélites
seleccionados estaban marcados con fluorescencia infrarroja (IRD800) lo que
permitió su posterior análisis en el equipo semiautomático marca LI-COR
(Modelo 42001G).
Los microsatélites se amplificaron mediante la Reacción en Cadena de la
Polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) en un termociclador programable
Perkin Elmer (PT 9700). Las reacciones se llevaron a cabo evaluando un
marcador por reacción bajo las condiciones de medio descritas en el Cuadro
A1. Todas las reacciones se hicieron en un volumen final de 10 μl.
3
Análisis de productos de PCR
Para analizar los tamaños alélicos, los productos de PCR se separaron en
geles de poliacrilamida-bisacrilamida desnaturalizante (6.5 %), de 25 cm de
longitud y 0.4 cm de grosor, empleando TBE 1X (90mM Tris base, 88 mM de
ácido bórico y 2.0 mM EDTA pH 8.0) como amortiguador de corrimiento en
cámaras de electroforesis vertical, por 1500 volts durante 1:30 h a 50 ºC. En
cada carril del gel se depositó 0.5 µl del producto de PCR (para cada marcador)
y un marcador de peso molecular (Marcador 50-350 pb, marca LI-COR), para la
determinación del tamaño de banda amplificada. Los productos de
amplificación fueron analizados en el secuenciador semiautomatizado LICOR
(Modelo 42001G; Kovak, 2001).Con el programa computacional SAGA GT se
obtuvo el tamaño y número de alelos.
Análisis de la diversidad genética
Para el estadístico de la diversidad genética se evaluaron, 1) El número de
alelos por locus en los 9 loci seleccionados y su valor medio, 2) Los valores de
Heterocigosidad esperada (He); la cual se definió como la probabilidad de que
un individuo sea heterocigoto para un locus en una población y
Heterocigosidad observada (Ho) en cada locus; la cual corresponde a la
proporción de heterocigotos observados en la muestra de la población y se
define como uno menos la frecuencia de los homocigotos, 3) El valor de
contenido de información polimórfica (PIC) en cada locus y su valor medio, 4)
La probabilidad de exclusión de paternidad con la ausencia del genotipo de uno
de los padres (PE1), 5) La probabilidad de exclusión de paternidad (PE2) para
cada locus: todos estos parámetros se calcularon para cada marcador
microsatélite utilizando el programa CERVUS, versión 3.0 (Kalinowski et al.,
2007), el cual evalúa la facilidad de asignar la paternidad al padre más
probable mediante módulo de simulación en el que se establecen los criterios
Delta; dependiendo de los valores de Delta obtenidos en la simulación, y
definiendo la proporción de falsos positivos en las asignaciones (nivel de
confianza = 80 como “estricto” e = 95% como de “alta astringencia”), y 6) La
probabilidad combinada de exclusión para los 9 loci (PEC2), utilizando la
ecuación propuesta por Jamienson y Taylor (1997):
P= 1-(1-P1)(1-P2)(1-P3)...(1-PK)
Donde:
P= probabilidad combinada de exclusión de paternidad del panel de loci
utilizados y K= número total de loci dentro del panel utilizado
Asignación y simulación de Paternidad/Maternidad
Para la asignación de paternidad y maternidad, se corrió un análisis de
simulación, asumiendo el 96% de loci tipificados y el 1% de error en la
Genotipificación, con los criterios estrictos de 95% de confianza.
4
Análisis del efecto de la asignación de paternidad sobre los parámetros y
valores genéticos
Se diseñó una prueba para analizar el efecto de la paternidad incierta sobre los
parámetros genéticos: varianza genética directa (σ2), varianza ambiental (σ2e),
índice de herencia directa (h2d), proporción de la varianza ambiental con
respecto a la fenotípica (e2), así como sobre los valores genéticos [Diferencias
Esperadas de la Progenie (DEPs)] y sus exactitudes, en los sementales
asignados para paternidad.
Se ajustó un modelo animal univariado para la variable disponible, peso al
nacimiento (PN), para lo que se generaron dos bases de datos: en la primera
(PS) se simuló la paternidad de las crías, mientras que en la otra se incluyeron
los datos de paternidad obtenidos del análisis de asignación (PR). La
simulación de sementales se realizó de manera aleatoria entre los diferentes
padres candidatos utilizados durante el empadre múltiple. Para la estimación
de las DEPs se utilizó toda la información disponible de las familias analizadas
(fecha y peso al nacimiento).
El modelo animal univariado ajustado, incluyó el efecto fijo de sexo de la cría, el
efecto aleatorio del padre y el residual. La forma matricial del modelo fue:
y = Χb + Ζu + ε
Donde: y= variable de interés PN, X y Z= matrices conocidas de incidencia que
relacionan las observaciones con su respectivo efecto fijo y aleatorio, b= efecto
fijo de sexo de la cría, u= efecto aleatorio del padre, y ε= efecto residual.
Los componentes de varianza fueron estimados mediante el procedimiento de
máxima verosimilitud restringida usando el programa MTDFREML, el índice de
herencia fue estimado por el mismo programa, mediante las salidas de los
componentes de varianza (h2d=σ2d/σ2f, Donde: h2d = índice de herencia directa,
σ2d= varianza genética directa, σ2f= varianza fenotípica), las DEPs y
exactitudes fueron obtenidas de una de las subrutinas del subprograma
MTDFREML, incluida en el mismo programa. El criterio de convergencia del
modelo fue considerado en 1 x 10-9, y se realizaron tres reinicios en el análisis,
hasta que el cambio en el logaritmo de la función de verosimilitud fuera menor
a 1 x 10-4, para asegurar el mínimo global.
Resultados
La eficiencia del resultado en la prueba de paternidad en sistemas de
producción animal, no es dependiente del número de marcadores
microsatélites utilizado, sino del nivel informativo que estos marcadores
proporcionan. El nivel informativo de un microsatélite está determinado por el
valor del PIC, Heterocigosidad esperada He, Heterocigosidad observada Ho y
la Probabilidad de Exclusión de paternidad para cada locus PE2, estos valores
dependen del número de alelos y de la distribución de las frecuencias de estos
en la población bajo estudio.
5
En el proyecto, se analizaron 19 marcadores microsatélites sugeridos por
FAO/ISAG para la asignación de paternidad en ganado de carne. Lógicamente,
estos marcadores deberán mostrar variabilidad informativa en las diferentes
razas, puesto que estas son genéticamente diferentes. El primer paso en el
análisis de los microsatélites fue, determinar el nivel informativo que cada uno
de ellos arrojaba para el ganado Braford. Primeramente fueron eliminados
aquellos marcadores que no amplificaron con las muestras de ADN obtenidas,
quedando un total de sólo 9 marcadores útiles para esta raza.
La heterocigosidad observada (Ho) y esperada (He), son medidas de la
información proporcionada por un locus (un valor de 0.5 o menos significa que
el locus es poco útil), así mismo, el contenido de información polimórfica (PIC)
es una medida de la información relacionada a la heterocigosidad esperada la
cual asume el equilibrio de Hardy-Weinberg, la probabilidad de exclusión (PE2)
refleja el poder de cada loci para excluir un padre candidato seleccionado al
azar, dado sólo el genotipo del padre de la descendencia; mientras que la
Probabilidad de Exclusión Combinada (PEC2), muestra el poder combinado del
panel de loci para excluir un padre candidato seleccionado al azar, dado el
genotipo de la descendencia, cabe mencionar que entre mayor sea la
heterocigosidad mayor es la variabilidad y por consiguiente, mayor el grado de
informatividad. El nivel informativo obtenido de los marcadores microsatélites
utilizados para asignar la paternidad en este estudio se muestran en el cuadro
A3.
Dentro del panel de marcadores microsatélites estudiado, el marcador BM6444
mostró el menor PIC (0.6109) y por consiguiente la menor PE2 (0.2463), siendo
el marcador menos polimórfico, ya que sólo fue capaz de detectar ocho alelos,
de los cuales el alelo 149 se encontró en 41 individuos con una frecuencia de
0.4615, compartiendo el fenotipo heterocigoto con el alelo 151 el cual se
encontró en 31 individuos con una frecuencia de 0.2424. Contrariamente, el
marcador INRA040 fue el que mostró un mayor PIC (0.7621), y mayores
valores de Ho y He (0.8652 y 0.9388 respectivamente), detectando 22 alelos de
los cuales el alelo 170 fue detectado en 17 individuos con una frecuencia de
0.0992, el alelo 172 en 16 individuos con la misma frecuencia y el 178 en 16
individuos con una frecuencia de 0.0931, convirtiéndolo en el marcador con
mayor nivel de PE2 (0.7665).
El marcador INRA23 arrojó una Ho y He de 0.8000 y 0.8534, respectivamente,
un PIC de 0.8323 con una PE2 de 0.5300. El marcador D15 mostró un PIC de
0.8690. Los resultados del análisis, mostraron un PIC de 0.7999 y una PE2 de
0.4838 para el marcador D2S26. Para el caso del marcador TGLA126 con el
cual se obtuvo en este estudio, un PIC de 0.8081 y una PE2 de 0.4941. El
marcador TGLA53 mostró en este estudio, un PIC de 0.8159 y una PE2 de
0.5102. En el caso de INRA37 se encontró un PIC de 0.7939 y una PE2 de
4733. Finalmente para el marcador HEL5 se obtuvo un PIC de 0.8225 y una
PE2 de 0.5252, con 11 alelos detectados entre los rangos 155-179pb y una Ho
de 0.6087.
Al termino del estudio de diversidad genética se procedió a calcular la
probabilidad combinada de exclusión para los 9 loci (PEC2). El cuadro A4
6
muestra la probabilidad combinada de exclusión para el panel de marcadores
microsatélites empleados en el presente estudio.
Verificación de maternidad
Para realizar la verificación de maternidad se tomó como verdadera la
información proporcionada por el ganadero en cuanto a la relación de las
madres con las crías y se realizó la verificación de las madres tomando en
cuenta que no se conocía el genotipo de uno de los padres (madre), dicha
verificación mostró que sólo el 9.09% (3 de 33 madres) de las madres estaban
asignadas correctamente, teniendo un error de asignación de maternidad de
90.91%, evidenciando que la madre asignada por el ganadero a la cría, no
corresponden a la verdadera madre.
Dicho error puede ser causado por el tipo de manejo que se da dentro del
hato, en especificó, al momento de identificar a las madres de las crías, el cual
consiste en agrupar dentro de un corral de manejo la totalidad de vientres y
crías que se encuentran en determinada pasta, dentro de este se capturan las
crías para marcarlas bajo el arete en turno, al momento de la captura de la cría
se le asigna la madre, la cual es apoyada en la proximidad de la cría y
cualquier vientre. De esta manera, se logra caer en errores graves al momento
del registro de la maternidad dentro del hato poniendo en duda la veracidad de
los datos otorgados por el productor, repercutiendo de manera directa en el
verdadero valor genético de la cría.
Asignación de paternidad
Para la asignación de paternidad se formaron 2 grupos de individuos de
acuerdo a la clasificación simulada.
Grupo 1: se formó de 16 crías (con proporción 11/16 de raza
Herford/Brahman), y 7 posibles padres de raza Herford.
Grupo 2: se formó de 17 crías (con proporción 5/8 de raza Brahman/Herford), y
5 posibles padres de raza Brahman.
La asignación de paternidad para las crías de ambos grupos se muestra en el
cuadro A5 .
Como se aprecia en el cuadro 5 el macho del grupo 1 que muestra dominancia
reproductiva frente a los demás es el número 431, al cual se le asignó la
paternidad de 8 crías, en segundo lugar se encuentra el macho 447 con 4 crías
asignadas, y a los machos 453 y 917 se les asignó la paternidad de una cría
respectivamente. Para el caso de machos del grupo 2, el semental 064 fue el
que mostró dominancia reproductiva con la asignación de 7 crías, mientras que
al macho 168 sólo le fue asignada una cría.
Mediante la verificación de maternidad y asignación de paternidad del hato de
raza Braford utilizado para la realización de este estudio, se logró la
estructuración de sólo tres familias (madre, cría y padre, ver cuadro A6); para el
caso de asignación de paternidad se tuvo éxito del 100% utilizando los criterios
de restricción estricto de 95% de confianza, asumiendo un 96% de loci
tipificados y un 1% de error en la genotipificación. Mostrando la eficiencia del
7
panel de marcadores microsatélite utilizado en dicho estudio, bajo las
circunstancias previamente descritas
Para la estimación de las DEPs se utilizó toda la información disponible de las
familias analizadas (fecha y peso al nacimiento). Se generaron dos bases de
datos:
Paternidad simulada de las crías (PS), se realizó de manera aleatoria, entre los
diferentes padres candidatos utilizados durante el empadre múltiple, se obtuvo
la siguiente información:
Probabilidad del logaritmo de verosimilitud -2 log L = 155.6394
Varianza genética directa σ2d = 1.5609
Varianza ambiental σ2e= 20.6779
Varianza fenotípica σ2f = 22.2388
Índice de herencia directa h2d = 0.07
Paternidad real de las crías (PR), en la que se incluyeron los datos de
paternidad obtenidos del análisis de asignación:
Probabilidad del logaritmo de verosimilitud -2 log L = 127.3615
Varianza genética directa σ2d = 2.7740
Varianza ambiental σ2e= 17.3512
Varianza fenotípica σ2f = 20.1252
Índice de herencia directa h2d = 0.14
Donde la varianza genética directa o aditiva (σ2d ) muestra la proporción del
valor genético que el semental transmite a sus crías, la varianza ambiental (σ2e)
corresponde a toda la variación explicada por el grupo contemporáneo (año,
época de nacimiento, sexo, etc.), pero para dicho análisis solo se incluyo el
efecto del sexo, y por último, la varianza fenotípica (σ2f ), la cual es la varianza
del indicador productivo incluidas en ella la varianza aditiva y ambiental. En
consecuencia, el índice de herencia directa o heredabilidad directa (h2d ) es la
proporción de la varianza fenotípica que es explicada por el efecto de los genes
que son transmitidos a la cría por su padre (varianza genética aditiva directa)
Se pueden observar diferencias en las varianzas estimadas y
consecuentemente en los parámetros genéticos estimados a partir de las dos
bases de datos (PR y PS); en general, se puede apreciar que al simular una
paternidad al azar se crea una subestimación del índice de herencia y de la
varianza genética directa, así como un incremento en las varianzas fenotípica y
ambiental. Estos resultados son consecuencia de varios efectos bajo los cuales
se realizó el estudio, entre los que podemos mencionar el reducido número de
observaciones por semental y la poca información acerca de los datos
productivos de los sementales, madres y crías.
Sin duda, el resultado que muestra mayor relevancia es la diferencia que se
observa en los valores genéticos medidos en las evaluaciones genéticas de los
grupos de PS y PR, reflejados en las DEPs, y por consecuencia en la
jerarquización de los sementales. En el cuadro A7 se muestran las diferencias
8
en la predicción de los valores genéticos y las exactitudes dadas la paternidad
simulada (PS) y real (PR), cabe mencionar que, de los nueve padres reales de
los dos grupos de crías sólo se contaba con los pesos al nacimiento de 5 de
ellos.
Impacto
El proyecto logro, de manera satisfactoria, estructurar la genealogía de este
sistema de producción de pié de cría, con ello se logro identificar que aunque el
productor tiene la “certeza” de identificación de los progenitores en sus hatos
existe un porcentaje de error que puede ser identificada por medio de la
asignación de maternidad y paternidad.
Por ejemplo, aproximadamente el 90% de las madres pueden estar asignadas
de manera errónea, esto es un resultado de impacto fundamental para los
sistemas de producción para carne, y más en los que el registro o pedigrí es
fundamento o sinónimo de mejoramiento genético.
Por otro lado, el proyecto logró identificar la necesidad de tomar en cuenta
paneles de microsatélites particulares para cada grupo de animales que se
quiera analizar, debido a que algunos aspectos cobran relevancia en este
contexto, como por ejemplo, el manejo reproductivo de los animales.
Finalmente, al estimar el efecto que tiene la falta de certeza en las estructuras
genealógicas, se encontró que puede existir una subestimación de los
parámetros genéticos y por lo tanto de los valores genéticos que son usados
como criterios de selección, lo que implica una disminución en el progreso
genético. Esto podría conducir a la disminución del valor económico de los
progenitores, tomando como superiores a sementales que en realidad fueron
sobreestimados debido a la falta de estructura genealógica verificada.
9
ANEXOS
10
Cuadro A1. Condiciones del medio de amplificación de cada marcador microsatélite seleccionado.
ADN
Buffer
MgCl2 25mM
dNTPs10mM
Iniciador 5´
Iniciador 3´
Taq
Programa*
BM6444
50ng/µl
1X
2mM
0.4mM
0.02 µM
0.1 µM
0.125 U
TD60
INRA040
50ng/µl
1X
2.5mM
0.4mM
0.02 µM
0.1 µM
0.125 U
TD60
INRA23
50ng/µl
1X
3mM
0.4mM
0.02 µM
0.1 µM
0.125U
TDTG
INRA37
50ng/µl
1X
3mM
0.4mM
0.015 µM
0.075µM
0.125U
TDTG
D15
50ng/µl
1X
2.5mM
0.4mM
0.015 µM
0.075 µM
0.125 U
D55
D2S26
50ng/µl
1x
3mM
0.4mM
0.01 µM
0.05 µM
O.125U
D55
TGLA126
50ng/µl
1x
2mM
0.4mM
0.072 µM
0.36 µM
0.125 U
TDTG
TGLA53
50ng/µl
1x
2mM
0.4mM
0.025 µM
0.125 µM
0.125U
TDTG
HEL5
50ng/µl
1X
1mM
0.4mM
0.015 µM
0.075µM
0.125U
TDTG
ng/µl: nanogramos por microlitro, mM: mili molar, µM: micro molar, U: unidades, Programa*: programa de amplificación dentro del método Touchdown
(Cuadro A2).
Cuadro A2. Programas de amplificación por PCR incluidos en el programa Touchdown del termociclador Perkin Elmer
(PT 9700).
TDTG
TD55
TD60
Tiempo Temp. ºC No. Ciclos
Temp. ºC
No. Ciclos
Temp. ºC
No. Ciclos
95
1
95
1
95
1
5 min
95
95
95
45 s
58 – 2 cada
62 – 2 cada ciclo
65 – 2 cada ciclo
45 s
ciclo
72
5
72
5
72
5
45 s
95
95
95
45 s
50
55
60
45 s
72
30
72
30
72
25
45 s
72
1
72
1
72
1
10 min
TD65
Temp. ºC No. Ciclos
95
1
95
68 – 2 cada
ciclo
72
5
95
65
72
25
72
1
Cuadro A3.- Nivel informativo de los marcadores microsatélites utilizados en la asignación de paternidad.
Marcador
Microsatélite
BM6444
INRAO40
INRA23
D15
D2S26
TGLA126
TGLA53
INRA37
HEL5
No de
alelos
8
22
10
11
14
11
13
12
11
Rango alélico (pb)
Ho
He
PIC
PE2
145-159
120-204
195-213
235-257
114-149
114-139
149-175
120-146
155-179
0.5604
0.8556
0.8000
0.8022
0.6098
0.8315
0.4205
0.6932
0.6087
0.6661
0.9401
0.8534
0.8855
0.8245
0.8324
0.8399
0.8186
0.8485
0.6109
0.9310
0.8323
0.8690
0.7999
0.8074
0.8159
0.7939
0.8252
0.2463
0.7665
0.5373
0.6104
0.4838
0.4931
0.5102
0.4733
0.5252
Cuadro A4.- Probabilidad de Exclusión Combinada del panel de locus utilizado para la asignación de
paternidad
Marcador
1*
Microsatélite
0.2463
BM6444
INRAO40
INRA23
D15
D2S26
TGLA126
TGLA53
INRA37
HEL5
0.2463
PEC2**
2*
3*
4*
5*
6*
7*
8*
9*
0.2463
0.7665
0.2463
0.7665
0.5373
0.2463
0.7665
0.5373
0.6104
0.2463
0.7665
0.5373
0.6104
0.4838
0.2463
0.7665
0.5373
0.6104
0.4838
0.4931
0.2463
0.7665
0.5373
0.6104
0.4838
0.4931
0.5102
0.2463
0.7665
0.5373
0.6104
0.4838
0.4931
0.5102
0.4733
0.8240
0.9185
0.9682
0.9836
0.9916
0.9959
0.9978
0.2463
0.7665
0.5373
0.6104
0.4838
0.4931
0.5102
0.4733
0.5252
0.9989
*: Número de marcadores , PEC2 **: Probabilidad de Exclusión Combinada.
Cuadro A5.- Asignación de paternidad a las crías del grupo 1 y 2.
Grupo de Crías
Grupo 1
Grupo 2
No. De Padre asignado
431
953
447
453
917
188279
01/8
064
168
Número de Cría
188, 150, 147, 195, 190, 186,
157, 156H
143, 158
177, 156M, 161, 197,
159M
155
171, 175, 169
154, 179, 183, 178, 164,
184, 174, 165, 163, 185, 173,
168
159H
H: hembra, M: macho
Cuadro A6.- Estructuración de las familias completas dentro del hato de raza
Braford bajo estudio.
No. de Madre
338/1
436/3
638/4
No. de Cría
143
154
195
No. de Padre
953
01/8
431
Cuadro A7.- Diferencias en la predicción de los valores genéticos y las
exactitudes dada la paternidad simulada (PS) y real (PR).
No.
Semental
447
227
431
917
409
453
953
168
01/8
53
64
188279
Paternidad Simulada
*DEPs/PN
Exactitud
-0.2601
0.2400
0.6664
-0.0551
-0.6304
0.0554
0.0968
0.3686
-0.4741
-0.1927
0.3356
-0.0373
0.17
0.28
0.27
0.30
0.31
0.31
0.32
0.25
0.22
0.13
0.20
0.20
No.
Semental
447
431
917
453
953
Paternidad Real
DEPs/PN
Exactitud
0.5791
-0.1363
-0.2410
0.1335
-0.3353
*DEPs/PN: Diferencias Esperadas de la Progenie para peso al nacimiento
0.30
0.34
0.18
0.23
0.17