Práctica de laboratorio N° 3 Tinciones Diferenciales de Células Procariotas

Práctica de laboratorio N° 3
Tinciones Diferenciales de Células Procariotas
Docente: Maria Teresa Naranjo T.
Bacterióloga – Especialista en Salud Pública
Objetivos
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Emplear técnicas bacteriológicas simples.
Conocer el fundamento estructural de la coloración de Gram.
Utilizar colorantes y comprender su utilización.
Utilizar el microscopio con el objetivo de inmersión.
Observar células procariotas.
Utilizar todos los elementos de bioseguridad requeridos.
Introducción: Las tinciones son utilizadas para teñir las células y aumentar su contraste,
de modo que se puedan ver con facilidad al microscopio. Los colorantes son compuestos
orgánicos y cada colorante tiene una afinidad por materiales celulares específicos.
Muchos colorantes de uso común tienen carga positiva (el azul de metileno, cristal violeta
y safranina) y se combinan con los constituyentes celulares de carga negativa (ácidos
nucleicos y polisacáridos acídicos). Como por lo general las superficies celulares están
cargadas negativamente, estos colorantes se combinan con las estructuras de la
superficie celular.
En la microbiología es fundamental la observación de los microorganismos. Esta
observación se hace necesaria para su clasificación e identificación.
Para ello se usa el microscopio tanto óptico como electrónico, y en sus diversas variantes
(microscopio de rayos UV, electrónico de barrido, de contraste de fase, de campo oscuro).
Nosotros abordaremos únicamente el microscopio óptico compuesto de dos lentes
(condensador y objetivo).
Un microscopio suele tener cuatro objetivos, pero en microbiología se usa
preferentemente el objetivo de inmersión, aunque para visualizar una preparación siempre
se recomienda empezar por el objetivo de x10 y una vez localizada la muestra ir subiendo
poco a poco el nivel de aumentos.
Al microscopio óptico hay dos formas de ver las preparaciones:
preparaciones son muy difíciles de ver debido al poco contraste del medio que les rodea.
ias,
pero son más visibles y su contraste es superior y de mayor calidad
Materiales
Un vaso lavador, un asa de siembra, una gradilla con tubos de ensayo con el
microorganismo en medio sólido o en cajas de petri, parrilla para los restos de los
colorantes por los lavados, portaobjetos y cubreobjetos, colorantes de Gram (Violeta
Genciana, Safranina, Alcohol – Acetona, Lugol Bacteriológico), colorantes de Ziehl
Neelsen (Fuscina, Alcohol ácido, Azul de Metileno) Colorantes de Wirtz Conklin (Solución
de verde malaquita (5%), Solución de safranina (0,5%)), goteros, Microscopio, mecheros,
pinzas de madera, aceite de inmersión, extensión sanguínea seca, solución de colorante
de Giemsa, glicerina, PBS (buffer fosfato) 0,5x, metanol libre de acetona, jeringa de
insulina, papel filtro y agua destilada estéril. Cronometro para practicas cuando se vayan
a realizar coloraciones
Procedimiento
Examinar, reconocer, identificar morfología de colonias en el cultivo.
Color: Blanco, amarillo, negro, naranja
Superficie: Brillante, opaca
Tamaño: Diámetro en mm
Forma: Puntiforme, circular, filamentosa, irregular, rizoide, fusiforme.
Elevación: Plana, elevada, convexa, monticular, umbeliforme, umbilicada
Borde de la colonia: entero, ondulado, lobulado, aserrado, filamentoso, rizado
Consistencia: Viscosa, membranosa, quebradiza.
Seleccionar una colonia y efectuar la extensión o frotis de la colonia.
Realización del frotis
1. Se denomina frotis a la extensión que se realiza sobre un portaobjetos de una muestra
o cultivo con objeto de separar lo más posible los microorganismos, ya que si
aparecen agrupados en la preparación es muy difícil obtener una imagen clara y
nítida. Este frotis debe ser posteriormente fijado al vidrio del portaobjetos para poder
aplicar los métodos habituales de tinción que permiten la observación al microscopio
de las bacterias sin que la muestra sea arrastrada en los sucesivos lavados. La
fijación de una extensión bacteriana hace que las bacterias queden inactivadas y
adheridas al vidrio alterando lo menos posible la morfología y bacteriana y las posibles
agrupaciones de células que pudiera haber.
2. Colocar una pequeña gota de agua en el centro de un portaobjetos limpio. Es
necesaria muy poca cantidad de agua, por lo que se puede usar el asa de siembra, ya
que en el extremo curvo de su filamento queda retenida una mínima gota de agua,
que resulta suficiente.
3. Flamear el asa de siembra, tomar, en condiciones asépticas, una pequeña cantidad
del cultivo bacteriano en medio sólido y transferirlo a la gota de agua.
4. Remover la mezcla con el asa de siembra hasta formar una suspensión homogénea
que
quede
bastante
extendida
para
facilitar
su
secado.
Si la muestra se toma de un cultivo en medio líquido, no es necesario realizar los dos
primeros pasos ya que basta con colocar y extender una gota de la suspensión
bacteriana, que se toma con el asa de siembra, directamente sobre el portaobjetos
5. Esperar hasta que el líquido se evapore o acelerar su evaporación acercando el porta
a la llama del mechero. En este caso hay que tener mucha precaución de no calentar
demasiado el porta pues las células pueden deformarse o romperse.
Fijación de las bacterias al portaobjetos
6. Por calor: Pasar tres veces el portaobjetos por la llama durante unos segundos, sin
dejar hervir. Dejar enfriar el porta entre los pases.
7. Con metanol (para bacterias procedentes de medio líquido). Añadir unas gotas de
metanol sobre la extensión completamente seca. Golpear el portaobjetos por su canto
con cuidado contra la mesa de trabajo para retirar de inmediato el exceso de metanol.
Esperar a que el metanol se evapore completamente.
8. Una vez realizado el frotis y fijadas las bacterias, las preparaciones pueden ser
observadas al microscopio, aunque carecen de contraste. Anotar en su cuaderno lo
que se observa en 40x. Continuar con el proceso de tinción.
Recomendaciones para la tinción del frotis bacteriano
9. Cubrir el frotis con 1 gota de colorante de tal manera que cubra la muestra y dejarlo
actuar durante el tiempo que indique el protocolo de cada tinción concreta. Suele
oscilar entre 1 y 5 minutos. En ocasiones el colorante tiñe sólo en caliente, por lo que
el tiempo que dure su actuación se deberá sostener el portaobjetos con unas pinzas
sobre la llama del mechero para que humee el colorante, pero teniendo mucho
cuidado de que no llegue a hervir ya que se produciría la destrucción de las células
10. Lavar la preparación con agua para eliminar el colorante. Esta operación se realiza
inclinando el portaobjetos y aplicando el chorro de agua en su parte superior de
manera que resbale sobre el frotis, pero sin que vaya dirigido directamente sobre él,
pues podría arrastrar parte del frotis consigo. Eliminar la máxima cantidad de agua de
los portaobjetos golpeándolos por su borde con cuidado contra la superficie de la
mesa de trabajo.
11. Secar el porta presionando entre dos papeles de filtro, pero en ningún caso se debe
frotar el porta.
12. Observar la preparación al microscopio llegando hasta el máximo aumento. Si se
quiere montar de forma definitiva no se debe usar ahora el aceite de inmersión.
Coloración de Gram
Debe su nombre al Bacteriólogo Danés Christian Gram que la desarrolló en 1844. Es una
tinción diferencial, clasificando a las bacterias en Gram + y Gram -, de acuerdo a las
propiedades de su pared celular:
Los pasos a seguir para realizar la tinción son los siguientes:
 Fijamos la muestra mediante calor.
 1 gota de Violeta cristal que cubra toda la muestra (Tiñe todas las bacterias, gram
- y gram +): 1 minuto.
 Lavar suavemente colocando a un chorro delgado de agua, para evitar que el agua
arrastre la muestra.
 Fijamos con 1 gota de Lugol que cubra toda la muestra : 1minuto
 Lavar suavemente colocando a un chorro delgado de agua, para evitar que el agua
arrastre la muestra.
 Decoloremos con 1 gota de mezcla alcohol-cetona que cubra completamente la
muestra (los gram - se decoloran) aproximadamente 45 segundos, rotando
suavemente la placa hasta que elimine el exceso de colorante.
 Lavar suavemente colocando a un chorro delgado de agua, para evitar que el agua
arrastre la muestra.
 Añadir 1 gota de Safranina (colorante de contraste, tiñe a los gram -), 1 minuto.
 Lavar suavemente colocando a un chorro delgado de agua, para evitar que el agua
arrastre la muestra.
 Dejar secar al ambiente
 Los tiempos para aplicar cada colorante es orientativo.
 En la tinción se observarán de color azul-violeta las gram + y de color rosa las
gram -.
Resultados:
Observar formas bacterianas e identificarlas en su morfología característica
Observar morfología células sanguíneas (Placas ya listas coloreadas con Giemsa).
Observar con aceite de inmersión 100x.
Observar morfología típica de Staphylococo, Escherichia Coli. (Placas selectivas de
cultivo puro, ya coloreadas con Gram). Observar con aceite de inmersión 100x
Observar gota de caldo de tioglicolato mezclada con 1 gota de azul de metileno en
fresco y colocar laminilla cubreobjetos. Observar en 10x y 40x.
En todos los pasos dibujar lo que se observa.
Limpiar y esterilizar el campo de trabajo al iniciar y al terminar
Preguntas
1. Cite tres ejemplos de las características fenotípicas, analíticas y genotípicas utilizadas en la
clasificación de las bacterias.
2. Describa la morfología microscópica (p. ej., características de la tinción de Gram, forma del
microorganismo) de las siguientes bacterias:
Staphylococcus , Escherichia , Neissería, Clostrídium, Pseudomonas.
3. ¿Cuál de los siguientes microorganismos posee ácidos micólicos en su pared celular:
Staphylococcus , Nocardia , Mycobacteríum o Klebsiella?