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OFICINA ESPAÑOLA DE
PATENTES Y MARCAS
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2 200 696
kNúmero de solicitud: 200201437
kInt. Cl. : C12N 15/11
11 Número de publicación:
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ESPAÑA
C12N 15/40
A01H 5/00
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SOLICITUD DE PATENTE
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71 Solicitante/s: Consejo Superior de
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72 Inventor/es: Franco Redrejo, Maribel;
22 Fecha de presentación: 21.06.2002
A1
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Investigaciones Cientı́ficas
c/ Serrano, 117
28006 Madrid, ES
43 Fecha de publicación de la solicitud: 01.03.2004
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43 Fecha de publicación del folleto de la solicitud:
01.03.2004
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Aguilar Aguilar, Juan Manuel;
Fernández Marco, Cristina;
Dı́az Pendón, Juan;
Rodrı́guez Cerezo, Emilio y
Aranda Regules, Miguel Angel
74 Agente: No consta
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54 Tı́tulo: Método para generar resistencia frente al virus del amarilleo y enanismo de las cucurbitáceas
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(CYSDV) en plantas, construcciones genéticas usadas y plantas resistentes a CYSDV obtenidas mediante dicho método.
57 Resumen:
Método para generar resistencia frente al virus del
amarilleo y enanismo de las cucurbitáceas (CYSDV)
en plantas, construcciones genéticas usadas y plantas resistentes a CYSDV obtenidas mediante dicho
método.
Se describe una construcción de ácido nucleico que
comprende una primera secuencia de nucleótidos capaz de regular la transcripción en una planta de una
segunda secuencia de nucleótidos, comprendiendo dicha segunda secuencia de nucleótidos: (i) una secuencia de nucleótidos correspondiente a un fragmento del RNA1 del Virus del amarilleo y enanismo
de las cucurbitáceas (CYSDV), y (ii) una repetición
invertida de la totalidad o parte de dicha secuencia de
nucleótidos (i). Dicha construcción puede utilizarse
para generar resistencia frente a CYSDV en plantas
susceptibles a la infección por dicho virus.
Venta de fascı́culos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid
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DESCRIPCION
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Método para generar resistencia frente al virus del amarilleo y enanismo de las cucurbitáceas (CYSDV) en plantas, construcciones genéticas usadas y plantas resistentes a CYSDV obtenidas mediante
dicho método.
Campo de la invención
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La presente invención se refiere a un método para generar resistencia frente al Virus del amarilleo y
enanismo de las cucurbitáceas (Cucurbit yellow stunting disorder virus; CYSDV) en plantas susceptibles
a la infección por CYSDV. La invención también se refiere a las construcciones genéticas derivadas del
genoma del virus usadas en dicho método y a las plantas obtenidas mediante dicho método.
Antecedentes de la invención
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Las enfermedades de los amarilleos de las cucurbitáceas causadas por closterovirus transmitidos por
mosca blanca tienen una gran importancia económica en diversas áreas del mundo. En las epidemias
inicialmente descritas se observó que el agente inductor de estas enfermedades era el Virus del pseudoamarilleo de la remolacha (Beet pseudo yellows virus; BPYV), un closterovirus transmitido en la naturaleza por la mosca blanca Trialeurodes vaporariorum (Duffus, 1965; Coffin y Couts, 1995). Sin embargo,
en las epidemias que están ocurriendo más recientemente se está observando que los amarilleos están
inducidos por el Virus del amarilleo y enanismo de las cucurbitáceas (Cucurbit yellow stunting disorder
virus; CYSDV), un closterovirus que se transmite en la naturaleza por la mosca blanca Bemisia tabaci
(Célix y col., 1996). De hecho, se ha propuesto que CYSDV haya reemplazado a BPYV como consecuencia del desplazamiento de T. vaporariorum por B. tabaci que parece haber tenido lugar en, al menos,
algunas áreas geográficas (Wisler y col., 1998; Berdiales y col., 1999). En la actualidad, CYSDV ha sido
detectado y causa problemas graves en cultivos de cucurbitáceas de los Emiratos Arabes, España, Portugal, Marruecos, Lı́bano y Norte América (Célix y col., 1996; Wisler y col., 1998; Abou-Jawdah y col.,
2000; Desbiez y col., 2000; Kao y col., 2000; Louro y col., 2000). En España, los sı́ntomas de amarilleos
causados por CYSDV se observan con frecuencia en el 100 % de las plantas de los invernaderos afectados,
resultando en pérdidas económicas muy graves debido a las importantes reducciones ocasionadas en los
rendimientos de las cosechas.
CYSDV es un miembro del género Crinivirus (Familia Closteroviridae; Martelli y col., 2000) que, como
otros miembros de este género, invade el tejido floemático de las plantas infectadas y parece permanecer
restringido a éste. Su gama de huéspedes está limitada a especies de la familia de las cucurbitáceas (Célix
y col., 1996). Sus partı́culas tienen forma de varilla flexuosa y una longitud de 750 a 800 nm (Liu y col.,
2000). El genoma de CYSDV es de RNA monocatenario de sentido mensajero y bipartito, esto es, está
formado por dos moléculas de RNA que se han denominado RNA1 y RNA2 (Célix y col., 1996), y por
el momento ha sido sólo parcialmente secuenciado. Las secuencias de nucleótidos de genes de CYSDV
publicadas hasta ahora corresponden al RNA2 del genoma viral (Célix y col., 1996; Livieratos y col.,
1999; Livieratos y Coutts, 2002). La diversidad genética de aislados de CYSDV provenientes de diversas
áreas del mundo ha sido analizada para dos regiones genómicas del RNA2, el gen homólogo de la proteı́na
70 de respuesta a choque térmico (heat shock 70 homologue protein; HSP70h) y el gen de la proteı́na de
la cápsida del virus (capsid protein; CP). Los resultados de estos análisis sugieren que la diversidad de
CYSDV es inusualmente baja entre las especies de la familia Closteroviridae, aunque aun ası́ es posible
diferenciar dos grupos genéticos, las llamadas subpoblaciones oriental y occidental (Rubio y col., 1999;
Rubio y col., 2001).
Teniendo en cuenta la importancia económica de la enfermedad causada por CYSDV, es imprescindible el diseño de estrategias eficientes para el control de la enfermedad inducida por este virus. El control
de CYSDV se basa actualmente en el control de su vector B. tabaci y en el uso de estrategias sanitarias
preventivas, aunque estos métodos están teniendo unos resultados muy limitados. Indudablemente, la
mejor opción para el control de CYSDV serı́a el uso de cultivares portadores de resistencia genética al
virus. Sin embargo, por el momento sólo se ha descrito una posible fuente de resistencia natural a CYSDV
(López-Sesé y Gómez-Guillamón, 2000) y ésta es en melón. Serı́a muy deseable contar con otras fuentes
de resistencia, y no sólo en melón, sino también en otras cucurbitáceas de importancia económica y que
estén afectadas por CYSDV. Por lo tanto, el objetivo de la presente invención es proporcionar un método
para generar resistencia genética frente a CYSDV en plantas susceptibles a este virus.
Dada la existencia de un número muy limitado de posibles donadores de resistencia natural a CYSDV (López-Sesé y Gómez-Guillamón, 2000) es conveniente plantear la generación de resistencia al virus
mediante la transformación de plantas con genes foráneos (transgenes) capaces de conferir este carácter.
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Existen numerosos Ejemplos de resistencias a virus conseguidas mediante la introducción de transgenes
en el genoma de especies de plantas previamente susceptibles (revisado en Wilson, 1993; Beachy, 1997).
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Los diversos métodos utilizados para obtener resistencias en plantas a través de la introducción de
transgenes están basados en el uso de genes originales de plantas (ej. Whitham y col., 1996), en el uso de
genes o secuencias derivados del patógeno viral (resistencia “derivada del patógeno” [Wilson, 1993]) ó en
el uso de genes de otros orı́genes (ej. Dickman y col., 2001). Algunos ejemplos de secuencias ó genes de
virus de RNA que han sido utilizados con éxito para generar resistencia derivada del patógeno en plantas
(revisado en Beachy, 1997) incluyen: 1) genes de proteı́nas de cápsidas, 2) genes de polimerasas de RNA
dependientes de RNA, 3) genes de proteı́nas del movimiento y 4) genes de nucleoproteı́nas de tospovirus.
En un número elevado de estos casos se ha observado que el fenotipo de resistencia al virus está asociado
con el silenciamiento génico post-transcripcional (PTGS) del transgén (Beachy, 1997) de tal manera que
el PTGS parece tener como diana no sólo al transgén sino también a los genes homólogos de un posible
virus invasor (English y col., 1996; Marathe y col., 2000). Por otra parte, se ha demostrado recientemente
que la transformación de plantas con construcciones genéticas portadoras de secuencias de nucleótidos
con una repetición invertida capaces de dar lugar a RNAs bicatenarios (dsRNAs) está asociada con el
PTGS de genes con secuencias homólogas a esos dsRNAs (Waterhouse y col., 1998). Los genes silenciados
mediante la transformación de plantas con repeticiones invertidas pueden ser del genoma de un posible
virus invasor y, por tanto, el fenotipo esperable con respecto a la infección viral en las plantas transgénicas
es de resistencia al virus (Waterhouse y col., 1998).
Compendio de la invención
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El objetivo de la presente invención consiste en proporcionar un método para generar resistencia
genética frente a CYSDV en plantas previamente susceptibles al virus mediante la transformación de las
plantas con transgenes portadores de una secuencia con una repetición invertida derivada del genoma
viral.
En un aspecto, la invención se refiere a una construcción de ácido nucleico que comprende una primera secuencia de nucleótidos capaz de regular la transcripción en una planta de una segunda secuencia
de nucleótidos, comprendiendo dicha segunda secuencia de nucleótidos: (i) una secuencia de nucleótidos
correspondiente a un fragmento del RNA1 de CYSDV, y (ii) una repetición invertida de la totalidad o
parte de dicha secuencia de nucleótidos (i).
En otro aspecto, la invención se relaciona con un vector que comprende dicha construcción de ácido
nucleico.
En otro aspecto, la invención se relaciona con una célula vegetal transformada con dicha construcción
de ácido nucleico o con dicho vector.
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En otro aspecto, la invención se relaciona con una célula vegetal transgénica que comprende, integrada
en su genoma, dicha construcción de ácido nucleico. Las plantas transgénicas que comprenden, al menos,
una de dichas células transgénicas también constituyen un aspecto de la presente invención.
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En otro aspecto, la invención se relaciona con una planta transformada con dicha construcción de
ácido nucleico o con dicho vector.
En otro aspecto, la invención se relaciona con una planta que es un clon o un descendiente de dicha
planta transgénica o transformada.
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En otro aspecto, la invención se relaciona con una planta hı́brida con resistencia mejorada frente a
CYSDV, preparada por cruce de dicha planta transgénica, o transformada, o de un clon o descendiente
de las mismas, con una segunda planta susceptible a la infección por CYSDV.
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En otro aspecto, la invención se relaciona con un propágulo, tal como una semilla, de cualquiera de
dichas plantas transgénicas, transformadas o hı́bridas.
En otro aspecto, la invención se relaciona con una semilla de una planta que comprende dicha segunda
secuencia de nucleótidos que comprende (i) una secuencia de nucleótidos correspondiente a un fragmento
del RNA1 de CYSDV, y (ii) una repetición invertida de la totalidad o parte de dicha secuencia de nucleótidos (i).
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En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para generar resistencia frente al virus del
amarilleo y enanismo de las cucurbitáceas (CYSDV) en plantas susceptibles a la infección por CYSDV,
que comprende transformar una célula vegetal de una planta susceptible a la infección por CYSDV con
dicha construcción de ácido nucleico y regenerar la planta a partir de dicha célula vegetal transformada.
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En otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de dicha construcción de ácido nucleico en la
producción de una planta transgénica con resistencia mejorada a la infección por CYSDV.
Breve descripción de las figuras
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La Figura 1 muestra la secuencia completa del RNA1 de CYSDV. La secuencia de nucleótidos aparece
numerada. Bajo la secuencia de nucleótidos aparece su traducción probable a aminoácidos. El marco de
lectura que probablemente se traduce aparece indicado a la izquierda de cada lı́nea de la secuencia de
aminoácidos.
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La Figura 2 es un diagrama que representa la posible organización génica del RNA1 de CYSDV.
Los rectángulos abiertos representan ORFs. En el ORF 1a, el área señalada por un rombo negro tiene
homologı́a de secuencia con dominios metil transferasa (Rozanov y col., 1992) y el área señalada por una
estrella negra con dominios helicasa (Gorbalenya y Koonin, 1993). En el ORF 1b, el área señalada por un
cuadrado negro tiene homologı́a de secuencia con dominios polimerasa de RNA (Koonin y Dolja, 1993).
Los segmentos negros horizontales corresponden a los clones de cDNA utilizados en la secuenciación
completa del RNA1 Los segmentos sombreados horizontales representan clones de cDNA inicialmente
obtenidos y utilizados para diseñar oligonucleótidos para preparar los clones antes mencionados. Las
flechas indican los oligonucleótidos utilizados en la sı́ntesis de la primera cadena de cDNAs y/o en su
amplificación por PCR.
La Figura 3 muestra el alineamiento de las secuencias de nucleótidos de CYSDV y de LIYV correspondientes a las regiones 5’-UTR (A) y 3’-UTR (B) de sus RNAs 1. Sobre fondo negro aparecen los
nucleótidos idénticos entre ambas secuencias.
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La Figura 4 muestra el alineamiento de las secuencias de aminoácidos de CYSDV y de LIYV correspondientes a los dominios metiltransferasa (A; Rozanov y col., 1992), helicasa (B; Gorbalenya y Koonin,
1993) y RNA polimerasa (C; Koonin y Dolja, 1993) posiblemente codificados por sus RNAs 1. Sobre
fondo negro aparecen los aminoácidos idénticos entre ambas secuencias. Sobre fondo gris, los aminoácidos
similares.
La Figura 5 muestra el alineamiento de secuencias de CYSDV y de BYV en la región del RNA1 en la
que un cambio (+1) de la fase de lectura puede dar lugar a la expresión de la proteı́na 1b.
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La Figura 6 muestra la organización del módulo de resistencia y selección que porta la construcción
genética introducida en las plantas transgénicas. El esquema corresponde a la región comprendida entre
los bordes derecho (RB) e izquierdo (LB) del plásmido Ti de Agrobacterium. Aparecen indicados desde
RB a LB: el promotor 35S del Virus del mosaico de la coliflor (CaMV), el transgén viral formado por
la secuencia de nucleótidos comprendida entre los nucleótidos 6.116 a 6.827 de la secuencia del RNA1 de
CYSDV (numeración como en la Figura 1) y una repetición invertida de dicha secuencia (nts complementarios a 6.827 a 6.116 del RNA1 de CYSDV; numeración como Fig. 1), el terminador poly(A) de CaMV,
el promotor del gen nopalin-sintetasa (NOS), el gen de la neomicin-fosfotransferasa II y el terminador
poly(A) del gen NOS.
La Figura 7 es un esquema representativo del proceso seguido y de las construcciones intermedias
usadas para la preparación de la construcción genética utilizada en esta invención para transformar plantas. En esta figura (A) es: Clonación en pGEM-T Easy del fragmento de 862pb amplificado por PCR
con los oligonucleótidos MA160-MA161. (B) es: Clonación en pGEM-T Easy del fragmento de 712pb
amplificado por PCR con los oligonucleótidos MA160-MA174. (C) es: Digestión con SmaI. (D): Digestión
con EcoRI y purificación del fragmento de 730pb, seguido de tratamiento con Klenow. (E): Ligación.
(F): Digestión con EcoRI y purificación del fragmento de 1.6Kb, seguido de clonación en el sito EcoRI de
pExSem-2. (G): Digestión con HindIII y purificación del fragmento de 2.1 Kb seguido de clonación en el
sitio HindIIII de svs297.
Descripción detallada de la invención
1) Secuencia de nucleótidos del RNA1 de CYSDV
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Como paso previo a la preparación de las construcciones genéticas proporcionadas por esta invención
para transformar plantas con secuencias de genes virales, se procedió a secuenciar completamente el
RNA1 del genoma de CYSDV. La secuencia de nucleótidos del RNA1 de CYSDV se obtuvo tal como se
describe en el Ejemplo 1. El RNA1 de CYSDV tiene 9.123 nucleótidos (nt) (SEQ. ID. N◦ : 1) (Figura
1). Una búsqueda en las bases de datos (programa BLASTN; GCG Software Package, Madison, WI,
USA) ha puesto de manifiesto que la máxima homologı́a de secuencia la tiene con el Virus del amarilleo
infeccioso de la lechuga (LIYV), que es el miembro tipo del género Crinivirus, Familia Closteroviridae
(Martelli y col., 2000). Un análisis de la capacidad codificadora de este RNA (programa FRAMES; GCG
Software Package, Madison, WI, USA) ha revelado que posiblemente contenga 5 marcos abiertos de lectura (ORFs) flanqueados por dos secuencias no codificantes (UTRs) (Figura 2). La UTR situada en el
extremo 5’ del RNA1 consiste en 94 nt hasta el codón de iniciación del ORF 1a. La UTR situada en el
extremo 3’ del RNA1 consiste en 221 nt desde el codón de terminación del ORF 4 hasta el último nt del
RNA1. Ambas UTRs tienen una similitud significativa con las correspondientes regiones del RNA1 de
LIYV (Figura 3). El primer codón AUG de iniciación de traducción se encuentra en la posición 95 aguas
abajo del extremo 5’. Los dos primeros ORFs están organizados de forma similar a como lo están en
LIYV (Klaasen y col., 1995). El primer ORF (ORF la) comprende los nucleótidos 95 a 6.028 y se puede
traducir en una proteı́na de 1.976 aminoácidos con un peso molecular calculado de 227 kDa. En esta
proteı́na se pueden identificar dos motivos conservados en proteı́nas asociadas con la replicación de virus.
Entre los aminoácidos 514 y 871 existe un motivo metiltransferasa (MET; Rozanov y col., 1992); además,
esta secuencia tiene una similitud elevada con el dominio homólogo en LIYV (42,6 % de aminoácidos
idénticos en un alineamiento de 357 residuos; Figura 4A). En la región carboxi-terminal (aminoácidos
1678 a 1941) existe un dominio helicasa (HEL; Gorbalenya y Kooning, 1993); el dominio homólogo en
LIYV tiene una elevada similitud con esta región (42,02 % de aminoácidos idénticos en un alineamiento
de 264 residuos; Figura 4B). La región de la proteı́na codificada por el ORF la que se encuentra entre
los motivos MET y HEL no muestra similitud significativa con ninguna proteı́na cuya secuencia esté
disponible en las bases de datos. El producto codificado por el ORF 1b contiene los motivos conservados
tı́picos de RNA polimerasas dependientes de RNA (RdRp; Koonin y Dolja, 1993) y está estrechamente
relacionado con la supuesta RdRp de LIYV (55,9 % de aminoácidos idénticos en un alineamiento de 474
residuos; Figura 4C). El ORF 1b se encuentra en un marco de lectura distinto del ORF 1a, concretamente
desplazado un nucleótido aguas abajo (+1). Se ha propuesto para el Virus del amarilleo de la remolacha
(BYV), miembro tipo del género Closterovirus, que el producto homólogo al codificado por el ORF 1b
de CYSDV se exprese vı́a cambio de fase (+1) del ribosoma durante la traducción (Agranovsky y col.,
1994). La comparación directa de las secuencias de nucleótidos en la zona de solape de los ORFs 1a
y 1b de BYV y CYSDV muestra una similitud significativa entre éstas (Figura 5) y permite predecir
que el posible cambio de fase pueda ocurrir en el residuo U-6.026 de la secuencia del RNA1 de CYSDV.
Los ORFs 2 (nts 7.554-7.690), 3 (nts 7.704-8.342) y 4 (nts 8.389-9002) tienen capacidad para codificar
proteı́nas de 48, 212 y 192 aminoácidos, respectivamente, con pesos moleculares calculados de 5, 25 y 22
kDa, respectivamente. Las proteı́nas potencialmente codificadas por los ORFs 2, 3 y 4 no muestran similitud significativa con ninguna proteı́na cuya secuencia esté disponible en las bases de datos, ni tampoco
se ha encontrado ningún motivo conservado en sus correspondientes secuencias.
2) Construcción genética utilizada para la transformación de plantas
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En un aspecto, la invención proporciona una construcción de ácido nucleico, en adelante construcción
de la invención, que comprende:
una primera secuencia de nucleótidos capaz de regular la transcripción en una planta de una segunda
secuencia de nucleótidos, comprendiendo dicha segunda secuencia de nucleótidos:
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(i) una secuencia de nucleótidos correspondiente a un fragmento del RNA1 del CYSDV, y
(ii) una repetición invertida de la totalidad o parte de dicha secuencia de nucleótidos (i).
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En principio, dicha secuencia de nucleótidos (i) puede contener cualquier secuencia de nucleótidos
del RNA1 del CYSDV. Asimismo, la longitud de dicha secuencia (i) puede variar dentro de un amplio
intervalo, tı́picamente entre 25 y 4.000 nt. No obstante, en una realización particular, dicha secuencia
de nucleótidos (i) comprende una secuencia de nucleótidos ORF 1b del RNA1 del CYSDV, tal como la
secuencia de nucleótidos comprendida entre los nucleótidos 6.116 y 6.827 de la secuencia de nucleótidos
del RNA1 de CYSDV (SEQ. ID. N◦ : 2).
La repetición invertida [secuencia (ii)] presente en la construcción de la invención se refiere a una
secuencia de nucleótidos que comprende la totalidad o parte de dicha secuencia de nucleótidos (i), en
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dirección sentido o antisentido con respecto a dicha secuencia (i), de manera que pueda formar un dsRNA
cuando la repetición se transcribe. La longitud de la repetición invertida puede variar dentro de un amplio
intervalo, tı́picamente entre 25 y 4.000 nt. No obstante, en una realización particular, dicha secuencia de
nucleótidos (ii) comprende la repetición invertida de la secuencia de nucleótidos comprendida entre los
nucleótidos 6.116 y 6.827 de la secuencia de nucleótidos del RNA1 de CYSDV.
La construcción de la invención puede contener, opcionalmente, una secuencia espaciadora (iii) entre
dichas secuencias (i) y (ii). La longitud de dicha secuencia espaciadora (iii) puede variar dentro de un
amplio intervalo, tı́picamente entre 10 y 500 nt. No obstante, en una realización particular, dicha secuencia espaciadora (iii) comprende la secuencia de nucleótidos comprendida entre los nucleótidos 6.828
y 6.974 de la secuencia de nucleótidos del RNA1 de CYSDV (SEQ. ID. N◦ : 3).
La primera secuencia de nucleótidos de la construcción de la invención comprende un promotor funcional en plantas. Dicho promotor funcional en plantas puede ser un promotor constitutivo, inducible
o especı́fico de tejido. En principio, cualquier promotor funcional en plantas puede ser utilizado en la
preparación de la construcción de la invención, por ejemplo, el promotor 35S del virus del mosaico de
la coliflor (CaMV), el promotor del gen nopalin sintetasa (pNOS), el promotor del gen polyubiquitinal
(pub1), el promotor de Agrobacterium rhizogenes rolC (especı́fico de floema), o el promotor de Phaseolus
vulgaris p12 (especı́fico de epidermis). En una realización particular, dicho promotor funcional en plantas
es el promotor 35S del CaMV.
La construcción de la invención puede contener, además, un terminador de la transcripción funcional
en plantas. En general, cualquier terminador de la transcripción funcional en plantas puede ser utilizado
en la preparación de la construcción de la invención, por ejemplo, el terminador poli(A) de CaMV, el
terminador poli(A) del gen NOS, etc. En una realización particular, dicho terminador de la trancripción
funcional en plantas es el terminador poli(A) de CaMV.
En una realización particular, la construcción de la invención comprende un promotor funcional en
plantas capaz de regular la transcripción en plantas de una segunda secuencia de nucleótidos, y un terminador de la transcripción funcional en plantas, comprendiendo dicha segunda secuencia de nucleótidos:
(i) la secuencia de nucleótidos identificada como SEQ. ID. N◦ : 2;
(ii) la repetición invertida de dicha SEQ. ID. N◦ : 2; y
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(iii) entre dichas secuencias de nucleótidos (i) y (ii), la secuencia de nucleótidos identificada como SEQ.
ID. N◦ : 3.
La construcción de la invención puede contener, opcionalmente, una tercera secuencia de nucleótidos
que permite seleccionar una planta transformada con dicha construcción, estando dicha tercera secuencia
de nucleótidos operativamente unida a un promotor funcional en plantas que regula la expresión de dicha
tercera secuencia de nucleótidos y a un terminador de la transcripción funcional en plantas. Prácticamente
cualquier secuencia de nucleótidos que permita seleccionar una planta transformada con la construcción
de la invención puede ser utilizada, por ejemplo, el gen de la neomicinfosfotransferasa II (nptII), capaz de
conferir resistencia a kanamicina, el gen de la higromicin-fosfotransferasa (hpt), capaz de conferir resistencia a higromicina, el gen de la fosfinotricin acetil transferasa (Barr/PAT), capaz de conferir resistencia a
bialafos, o el gen csr1-1, capaz de conferir resistencia a sulfonil-urea. En una realización particular, dicha
tercera secuencia de nucleótidos comprende el gen nptII capaz de conferir resistencia a kanamicina en
una planta transformada con una construcción de la invención que contiene dicha secuencia. Asimismo,
en principio, puede utilizarse cualquier promotor y terminador de la transcripción funcionales en plantas.
No obstante, en una realización particular, dicho promotor funcional en plantas que regula la expresión
de dicha tercera secuencia de nucleótidos es el promotor pNOS y dicho terminador de la transcripción
funcional en plantas es el terminador poli(A) del gen NOS.
En una realización concreta de esta invención, la construcción genética proporcionada por esta invención, usada para la transformación de plantas, incluye un módulo diseñado para generar resistencia a
CYSDV y posibilitar la selección de plantas transformantes. Este módulo está inserto entre los bordes
derecho (RB) e izquierdo (LB) del plásmido Ti(tumor-inducing) de Agrobacterium, y todo ello incluido en
un vector binario seleccionable (SVS297-NOS) capaz de replicarse en Escherichia coli y Agrobacterium.
La organización del módulo de resistencia/selección se esquematiza en la Figura 6. Este módulo contiene,
desde el RB al LB, los siguientes elementos:
i) el promotor 35S del CaMV, para conferir al transgén viral expresión fuerte y constitutiva;
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ii) el transgén viral, formado por la secuencia de nucleótidos identificada como SEQ. ID. N◦ : 2 y
su repetición invertida, existiendo entre ambas secuencias una secuencia espaciadora constituida
por la secuencia de nucleótidos identificada como SEQ. ID. N◦ : 3; las secuencias utilizadas para
la construcción del transgén viral derivan de la secuencia correspondiente al ORF 1b del RNA1
de CYSDV, que es el ORF que contiene los motivos RdRp (Koonin y Dolja, 1993; Figura 2); el
transgén viral está diseñado para que tras su transcripción en el núcleo celular se genere dsRNA de
tipo “horquilla” (Waterhouse y col., 1998) con una región apareada de 711 nt y una región “bucle”
(no apareada) de 147 nt;
iii) el terminador poli(A) de CaMV;
iv) el promotor del gen nopalin-sintetasa (NOS), para conferir al transgén de selección expresión fuerte
y constitutiva;
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v) el gen de la neomicin-fosfotransferasa II, para conferir resistencia a kanamicina a las plantas transformadas; y
vi) el terminador poli(A) del gen NOS.
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La construcción de la invención puede obtenerse mediante el empleo de técnicas convencionales conocidas por los técnicos en la materia. En el Ejemplo 2 se describe la Preparación de la construcción de la
invención descrita previamente, utilizada para la transformación de plantas de melón y pepino, utilizando
E. coli como huésped de los vectores plasmı́dicos.
La construcción de la invención puede estar insertada en un vector apropiado. Por tanto, en otro
aspecto, la invención se relaciona con un vector que comprende una construcción de la invención. La
elección del vector dependerá de la célula hospedadora en la que se va a introducir posteriormente. A
modo de ejemplo, dicho vector puede ser un plásmido que, cuando se introduce en una célula hospedadora, se integra en el genoma de dicha célula y se replica junto con el cromosoma (o cromosomas) en
el que (o en los que) se ha integrado o bien un vector viral. En una realización particular, dicho vector
puede ser un vector de expresión provisto de una serie de elementos que permiten la transcripción de
un ácido nucleico determinado en la célula hospedadora. Dicho vector de expresión puede ser un vector
RNA o DNA.
3) Transformación y caracterización de las plantas transformantes
La construcción de la invención ası́ como los vectores proporcionados por la misma pueden ser utilizados para transformar plantas.
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Tal como se utiliza en esta descripción, el término “planta” incluye plantas completas; órganos y
estructuras vegetativas (por ejemplo, hojas, tallos y tubérculos); raı́ces; flores y órganos y estructuras
florales (por ejemplo, brácteas, sépalos, pétalos, carpelos, anteras, óvulos, etc.), semillas (incluyendo
embriones, endospermo y el recubrimiento de la semilla) y frutos; tejido vegetal (por ejemplo, tejido
vascular, etc.) y células vegetales, ası́ como a la progenie de una planta. La clase de plantas que puede
ser utilizada para la puesta en práctica del método proporcionado por esta invención incluye a cualquier
planta susceptible de ser infectada por el CYSDV, tal como una cucurbitácea, por ejemplo, melón, sandı́a,
pepino, etc.
Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con una célula vegetal transformada con una
construcción de la invención o con un vector proporcionado por esta invención. Las células hospedadoras
que se pueden transformar con la construcción o el vector proporcionado por esta invención son, preferentemente, células vegetales. La transformación de las células vegetales puede realizarse por métodos
convencionales. A modo ilustrativo, dicha construcción o vector puede ser introducido directamente
en el DNA genómico de la célula vegetal mediante el empleo de técnicas tales como electroporación y
microinyección de protoplastos de células vegetales, o bien vectores de expresión proporcionados por
esta invención pueden ser introducidos directamente en el tejido vegetal mediante el empleo de métodos
balı́sticos, por ejemplo, por bombardeo de partı́culas. Una revisión de técnicas relacionadas con la transferencia genética a plantas, incluyendo vectores, métodos de transferencia de DNA, etc., se recoge en, por
ejemplo, el libro titulado “Ingenierı́a genética y transferencia génica”, de Marta Izquierdo, Ed. Pirámide
(1999), en particular, en el capı́tulo 9, titulado “Transferencia génica a plantas”, páginas 283-316.
Las células vegetales transformadas que derivan de cualquiera de las técnicas de transformación mencionadas previamente pueden ser cultivadas para regenerar la planta completa que poseerá el genotipo
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transformado y, por tanto, manifestará el fenotipo deseado, es decir, una resistencia mejorada frente a
CYSDV. La regeneración de las plantas completas se realiza mediante el empleo de técnicas convencionales. A modo ilustrativo, las técnicas de regeneración dependen de la manipulación de ciertas fitohormonas
en un medio de crecimiento de cultivo de tejido, dependiendo, en general, de un marcador (biocida y/o
herbicida) introducido junto con la construcción de la invención. La regeneración de plantas a partir de
protoplastos cultivados ha sido descrita, por ejemplo, por Evans y col., (1983), y Binding (1985). La
regeneración de las plantas también puede obtenerse a partir de callos de plantas, explantes, órganos y
partes de una planta [Klee y col.,(1987)].
Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con una planta transformada con una construcción
de la invención o con un vector proporcionado por esta invención.
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La construcción de la invención puede ser integrada de forma estable en el genoma de la célula vegetal,
generándose una célula transgénica que puede regenerar una planta transgénica la cual puede ser utilizada
para generar plantas hı́bridas mediante cruce sexual con otras plantas transgénicas o no transgénicas.
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Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con una célula vegetal transgénica que comprende,
integrada en su genoma, una construcción de la invención. Una planta transgénica que comprende, al
menos, una de dichas células transgénicas proporcionadas por esta invención constituye un aspecto adicional de esta invención.
En otro aspecto, la invención se relaciona con una planta que es un clon o un descendiente de una
planta transformada o transgénica proporcionada por esta invención.
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En otro aspecto, la invención se relaciona con una planta hı́brida con resistencia mejorada a la infección
por CYSDV, preparada por cruce de una planta transgénica o de una planta transformada proporcionada
por esta invención, o de un clon o descendiente de dichas plantas, con una segunda planta susceptible a
la infección por CYSDV.
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En otro aspecto, la invención se relaciona con un propágulo de una planta transgénica o de una planta
transformada proporcionada por esta invención, o de un clon o descendiente de dichas plantas. En una
realización particular, dicho propágulo comprende una semilla.
35
En otro aspecto, la invención se relaciona con una semilla de una planta que comprende (i) una
secuencia de nucleótidos correspondiente a un fragmento del RNA1 del CYSDV, y (ii) una repetición
invertida de la totalidad o parte de dicha secuencia de nucleótidos (i), es decir, la segunda secuencia de
nucleótidos definida en la construcción de la invención.
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En otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de dicha construcción de la invención en la
producción de plantas, por ejemplo, plantas transgénicas, con resistencia mejorada frente a CYSDV.
45
Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con un método para generar resistencia frente
a CYSDV en plantas susceptibles a la infección por dicho virus que comprende transformar una célula
vegetal de una planta susceptible a la infección por CYSDV con una construcción de la invención y regenerar la planta a partir de dicha célula vegetal transformada.
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La construcción de la invención puede ser utilizada en procesos de mejora de plantas susceptibles
de ser infectadas por CYSDV, tales como las cucurbitáceas, algunas de las cuales, o sus frutos, son
consumidas por los seres humanos o por los animales. Estas plantas con resistencia mejorada frente a
CYSDV constituyen una importante mejora de las plantas tradicionales puesto que permiten aumentar
el rendimiento de las cosechas, reduciendo de ese modo las pérdidas económicas causadas por CYSDV.
En una realización particular, una construcción de la invención se utilizó para transformar una cepa
desarmada de Agrobacterium. La integridad de las secuencias introducidas en Agrobacterium se comprobó
mediante ensayo de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Una cepa de Agrobacterium portadora de
la construcción genética ı́ntegra se utilizó para transformar plantas de melón y de pepino utilizando procedimientos habituales. A partir de esa transformación se obtuvo un número de plantas capaces de crecer
en medio de selección y, por tanto, supuestamente transgénicas. La presencia del transgén en esas plantas
se confirmó mediante PCR. Aquellas plantas que resultaron positivas mediante este ensayo (generación
T0) se seleccionaron para llevar a cabo ensayos preliminares de susceptibilidad a la infección viral en T0
y para obtener semillas de una siguiente generación (T1). Los ensayos preliminares de susceptibilidad en
T0 sirvieron para seleccionar lı́neas de T1 que se ensayaron también para susceptibilidad a la infección
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por CYSDV. Los ensayos de susceptibilidad a CYSDV se realizaron tal como se describe en el Ejemplo
3.
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Los siguientes ejemplos ilustran la invención y no deben ser considerados en sentido limitativo de la
misma. Para la realización de la parte experimental se ha seguido, de forma general, a Sambrook y Russell
(2001) en las técnicas de Biologı́a Molecular y a Foster y Taylor (1998) en las técnicas de Virologı́a.
Ejemplo 1
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Secuenciación del RNA1 de CYSDV
Para la secuenciación del RNA1 de CYSDV se usó como molde dsRNA purificado a partir de plantas
de pepino infectadas con el virus. La preparación de dsRNA se hizo como se describe en Valverde y col.
(1990) incluyendo las modificaciones descritas por Célix y col. (1996). A partir de este dsRNA se generó
una librerı́a de cDNA utilizando oligonucleótidos al azar, obteniéndose en torno a 500 clones recombinantes. Una proporción de estos clones fue secuenciada en sus extremos utilizando los oligonucleótidos M13
universal y reverse, capaces de iniciar la reacción de secuenciación en regiones del vector utilizado en el
clonaje que son flanqueantes a los insertos. Las secuencias ası́ obtenidas se compararon con la secuencia
correspondiente al RNA1 de LIYV (Klaasen y col., 1995). Cuatro de los clones secuenciados mostraron
homologı́a de secuencia con regiones genómicas del RNA1 de LIYV (señaladas con un segmento horizontal
sombreado en la Figura 2). Las secuencias de estos clones se utilizaron para generar otro conjunto de
clones de cDNA que cubrieran la longitud completa del RNA1 de CYSDV usando dos estrategias: una
para generar clones de cDNA a los extremos 5’ y 3’ del RNA1, y otra para generar clones internos.
Para generar clones de cDNA a los extremos 5’ y 3’ del RNA1 se procedió como sigue. En primer
lugar se añadió una cola de poli(A) a los extremos 3’-OH libres de los dsRNAs. Ası́, a 9 µl de dsRNA a
una concentración aproximada de 10 ng/µl se añadió 1 µl de hidróxido de metil mercurio 0,1 M (SIGMA
Chemical Co., St Louis, MO, USA) y se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Al cabo
de ese tiempo se añadió 1 µl de (β-mercaptoetanol 1,4 M, se mezcló y se incubó en hielo durante 10
minutos. A esta mezcla se añadieron 4 µl de tampón concentrado 5 veces de la poli(A) polimerasa de
levadura (USB Co., Cleveland, Ohio, USA), 1 µl de ATP 2 mM, 50 U de inhibidor de RNasas (Amersham
Pharmacia Biotech, UK), 1 µl de poli(A) polimerasa de levadura (USB) y 2 µl de agua. Esta mezcla
se incubó a 37◦ C durante 30 minutos, se extrajo con fenol-cloroformo y se precipitó con etanol. El
concentrado seco resultante de esta precipitación se disolvió en 11 µl de agua y se le añadió 1 µl de
hidróxido de metil mercurio 0,1 M, se incubó 10 minutos a temperatura ambiente y se le añadió 1 µl de
(βmercaptoetanol 1,4 M. A continuación, se procedió a la sı́ntesis de cDNA utilizando un oligo(dT) que
iniciase en la cola de poli(A) añadida. Ası́, a los 13 µl anteriores se anadieron 5 µl de tampón 5 veces
concentrado de la transcriptasa reversa (Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania), 2 µl de dNTPs
5 mM, 50 U de inhibidor de RNasas (Amersham Pharmacia Biotech), 1 µl de DTT 100 mM, 1 µl de
transcriptasa reversa (Expand RT, Boehringer) y 2 µl de oligo(dT) a una concentración de 100 ng/µl.
Esta mezcla se incubó durante 1 h y 30 minutos a 37◦C. Al cabo de este tiempo se procedió a amplificar
por PCR los cDNAs ası́ generados mediante el uso de oligonucleótidos especı́ficos diseñados a partir de
las secuencias previamente obtenidas (segmentos horizontales sombreados en la Figura 2) y el oligo(dT).
El oligonucleótido empleado para amplificar el extremo 3’ se denominó U28-475 y el oligonucleótido
empleado para amplificar el extremo 5’ se denominó U31-617 (Tabla 1). La amplificación por PCR dió
lugar a fragmentos de DNA únicos y de aproximadamente 1,8 kbp y 0,9 kbp para los extremos 3’ y
5’, respectivamente. Ambos fragmentos fueron ligados al plásmido pCR-BluntII-TOPO (Invitrogen Co.,
Carlsbad, CA, USA) y clonados en E. coli. Por cada fragmento de cDNA se secuenciaron dos clones
(clones pLM0,9-11, pLM0,9-12, pLM2 y pLM44; Figura 2) y cada posición (nt) en esos clones ha sido
leı́da al menos dos veces.
TABLA 1
Oligonucleótidos utilizados
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Nombre
Secuencia 5’-3’ del oligonucleótido
Posición en el RNA1 de
CYSDV
MA146
U31-617
511
CCATGTTAAGGTAGTACTGG
GTTTACAGGATTTTATGGTC
TATGGTACCCGTTACAAGTCT
841-860
950-931
1235-1255
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TABLA 1 (Continuación)
Oligonucleótidos utilizados
Nombre
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MA147
U148-1274
U148-32
U28-475
L28-821
Oligo(dT)
MA160
MA161
MA174
Secuencia 5’-3’ del oligonucleótido
Posición en el RNA1 de
CYSDV
CTGGGCATAGCAATCTTGGCTC
AGGGAAGGTCACTCAAATCA
CGGATTGAAAAACTGTTGA
CCCGATCCGAAGGTCAGATT
TGTCGGAAAAGAAATGATT
CCCTCTAGATATCTCGAGTCGAC(T)17
CGCATATGTCCTTGGTAAATCC
GTCCCGGGTTCCAGTATATCTCG
GTCCCGGGTGTGATAAGCCTCC
1314-1293
2605-2624
3058-3040
7301-7320
7665-7647
6116-6132
6974-6958
6827-6812
Para generar clones internos a los extremos del RNA1 se diseñaron oligonucleótidos especı́ficos a
partir de las secuencias obtenidas inicialmente (señaladas con un segmento horizontal sombreado en la
Figura 2) que se usaron en reacciones de RT-PCR usando como molde dsRNA. Estos oligonucleótidos
especı́ficos fueron MA147, U148-32 y L28-821, complementarios a la supuesta secuencia viral, y MA146,
511 y U148-1274, idénticos a la supuesta secuencia viral (Tabla 1). En el experimento de RT-PCR se
utilizaron las combinaciones de oligonucleótidos siguientes: MA147 y MA146, U148-32 y 511 y L28-821
y U148-1274. La sı́ntesis de la primera cadena del cDNA se realizó utilizando 10 µl de dsRNA de plantas
infectadas a una concentración de 10 ng/µl por cada una de las tres combinaciones de oligonucleótidos
empleados. A este RNA se añadió 1 µl de hidróxido de metil mercurio 0,1 M y se mantuvo a temperatura
ambiente 10 minutos. A continuación se añadieron los reactivos siguientes: 1 µl de β-mercaptoetanol
1,4 M, 5 µl del tampón de transcriptasa reversa concentrado 5 veces (Boehringer Manheinn, Manheinn,
Alemania), 1 µl de una mezcla de dNTPs 10 mM, 50 U de inhibidor de RNasas (Amersham Pharmacia
Biotech, UK), 1 µl de DTT 100 mM, 1 µl de transcriptasa reversa (Expand RT, Boehringer), 2 µl de
los oligonucleótidos complementarios (a una concentración de 100 ng/µl), todo ello en un volumen final
de 25 µl. Esta mezcla se mantuvo a 37◦C durante 1 h y 20 minutos. A continuación, se procedió a la
sı́ntesis de la segunda cadena del cDNA. A 1 µl de la mezcla anterior se añadieron 5 µl de tampón de
polimerasa Taq concentrado 10 veces (Bioline, Londres, UK), 2 µl de Cl2 Mg 25 mM, 1 µl de dNTPs 10
mM, 0,5 µl de los oligonucleótidos idénticos a la secuencia viral (a una concentración de 100 ng/µl) y
1 µl de polimerasa Taq (BioTaq; Bioline, Londres, UK), todo ello en un volumen final de 50 µl. Esta
mezcla se sometió a los siguientes ciclos de PCR: un ciclo de desnaturalización a 94◦ C durante 4 minutos,
treinta ciclos de desnaturalización a 94◦ C durante 30 s seguida de la hibridación de los oligonucleótidos a
45◦C durante 30 s seguida de la polimerización del cDNA a 72◦ C durante 3 minutos, y un ciclo final de
polimerización a 72◦ C durante 7 minutos. El resultado del PCR se comprobó por electroforesis de una
alı́cuota en un gel de agarosa teñido con bromuro de etidio. Tras transiluminación con luz ultravioleta,
en este gel se observaron bandas especı́ficas de los tamaños aproximados 0,5 kbp, 1,8 kbp y 5 kbp para las
combinaciones de oligonucleótidos MA146/MA147, 511/U148-32 y U148-1274/L28-821, respectivamente.
Estos fragmentos de DNA fueron ligados al plásmido pCR-BluntII-TOPO (Invitrogen Co., Carlsbad, CA,
USA) o al plásmido pGEM-T Easy vector System II (Promega Co., Madison, WI, USA) y clonados en
E. coli. Por cada fragmento de cDNA se secuenciaron dos clones (clones pLM0,5-7, pLM0,5-9, pLM12-2,
pLM12-9, pLM15 y pLM24; Fig. 2) y cada posición (nt) en esos clones ha sido leı́da al menos dos veces.
Ejemplo 2
Preparación de las construcciones genéticas usadas para transformar plantas
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Para la preparación de la construcción genética usada para transformar plantas se procedió como
se esquematiza en la Figura 7. Mediante el uso de los oligonucleótidos MA160 y MA161 (Tabla 1) se
amplificó mediante PCR sobre el plásmido pLM15 (Figura 2) un fragmento de DNA de 858 nt (nt 6116
al nt 6974 de la secuencia del RNA 1 de CYSDV [Figura 1]). Este fragmento se ligó al plásmido pGEM-T
Easy System II (Promega) y se clonó en E. coli dando lugar a la construcción pRdRp (Figura 7). Usando
los oligonucleótidos MA160 y MA174 se amplificó un fragmento de DNA de 711 nt (nt 6116 al nt 6827
de la secuencia del RNA1 de CYSDV [Figura 1]). De nuevo, este fragmento se ligó al plásmido pGEM-T
Easy System II (Promega) y se clonó en E. coli dando lugar a la construcción p5’RdRp (Figura 7). El
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fragmento EcoRI de 730 nt del pásmido p5’RdRp se escindió del plásmido, se purificó y se hizo romo en
sus extremos (fragmento EcoRI-blunt) mediante tratamiento con el fragmento klenow de la polimerasa I
de DNA de E. coli. Este fragmento se ligó al vector pRdRp, que previamente se habı́a linearizado con
SmaI. La ligación se usó para transformar E.coli y se seleccionaron colonias que hubieran incorporado
el fragmento EcoRI-blunt en orientación opuesta a la del inserto correspondiente a la secuencia de CYSDV preexistente en pRdRp. Ası́ se originó la construcción denominada pIRRdRp (Figura 7). De esta
construcción se escindió el fragmento EcoRI que se insertó en el sitio EcoRI del plásmido pExSem-2.
El plásmido pExSem-2 es un derivado de pUC18 (Sambrook y col., 1989) que contiene el promotor y
el terminador del 35S de CaMV (P35S y T35S, respectivamente); en pExSem-2, P35S y T35S están
flanqueados por dianas de restricción HindIII y entre ellos existen otras tres dianas, EcoRI, NcoI y NdeI.
Este último paso dio lugar a la construcción pExIRRdRp (Figura 7). El fragmento HindIII de pExIRRdRp fue escindido, purificado de gel de agarosa y ligado al vector psvs297-NOS que previamente se
habı́a linearizado con HindIII. Las bacterias transformadas con esta ligación y que portaban el inserto
adecuado fueron seleccionadas, dando lugar a la construcción psvsExIR (Figura 7), que es la que se ha
utilizado para transformar plantas.
Ejemplo 3
Análisis de la susceptibilidad de plantas a la infección viral
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El procedimiento seguido para analizar la susceptibilidad de plantas a la infección por CYSDV ha
comprendido los pasos de i) inoculación en condiciones controladas del virus en las plantas a testar y en
los correspondientes controles y ii) seguimiento del desarrollo de la enfermedad y del progreso del virus
en las plantas inoculadas. Los métodos de mantenimiento e inoculación de plantas con CYSDV están
descritos en López-Sesé y Gómez-Guillamón (2000). Aquı́ se describen los métodos utilizados para la
estima de la gravedad de sı́ntomas inducidos por CYSDV y para la medida de la acumulación de CYSDV
en las plantas inoculadas.
Para la comparación de sı́ntomas se elaboró una escala (0 a 5) de la gravedad de los sı́ntomas que
puede inducir CYSDV en melón y pepino (Tabla 2).
TABLA 2
Escala de la gravedad de los sı́ntomas que CYSDV puede inducir en plantas de melón y pepino
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Escala
Descripción
0
No sı́ntomas
Ninguna hoja completamente amarilla. Clorosis internervial sólo en hojas
basales, el resto de las hojas tiene moteado clorótico suave hasta la hoja 15
contada desde el ápice. Desde esta hoja hasta el ápice no hay sı́ntomas.
Ninguna hoja completamente amarilla. Clorosis internervial hasta la hoja 5
contada desde la hoja inoculada. Desde ésta, moteado clorótico hasta la hoja
14-15 contada desde el ápice. Desde esta hoja hasta el ápice no hay sı́ntomas.
2 hojas básales completamente amarillas exceptuando los nervios, que
permanecen verdes. Desde éstas, clorosis internervial en hojas basales que
según se asciende en la planta se torna en moteado clorótico. La última hoja
con moteado clorótico es la 11-12 contada desde el ápice. Desde esta hoja
hasta el ápice no hay sı́ntomas.
1-2 hojas básales completamente amarillas, las 2 siguientes amarillas con
nervios verdes. Desde éstas, clorosis internervial en hojas basales que según
se asciende en la planta se torna en moteado clorótico. La última hoja con
moteado clorótico es la 7 contada desde el ápice. Desde esta hoja hasta el
ápice no hay sı́ntomas.
3-4 hojas básales completamente amarillas. Sı́ntomas de clorosis
internervial y moteado clorótico hasta la 2-3 hoja contada desde el ápice.
1
2
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3
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4
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Utilizando dicha escala, se realizaron estimas de gravedad de sı́ntomas sobre plantas correspondientes
a lı́neas transgénicas y controles no transgénicos inoculadas simultáneamente; además, para minimizar
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efectos no debidos a la infección viral sobre el desarrollo de sı́ntomas, el número y distribución de las
plantas siempre obedeció a un diseño experimental apropiado. La determinación de la presencia ó ausencia de CYSDV y/o su nivel de acumulación en tejidos de plantas se realizó sobre muestras tomadas a
las dos semanas y a las cinco semanas post-inoculación. La estima de la gravedad de sı́ntomas se realizó
a las cinco semanas post-inoculación (siete semanas post-transplante desde el semillero a maceta). Los
muestreos se realizaron en seis niveles distintos de las plantas analizadas: en la hoja cuarta sobre la hoja
inoculada (nivel I), en la octava (nivel II), en la 16 (nivel III), en la 22 (nivel IV), en la 26 (nivel V) y
en la 30 (nivel VI). Cada nivel fue tratado independientemente, para poder ası́ seguir la evolución de la
distribución espacial de la infección viral en cada entrada de germoplasma considerada.
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La presencia ó ausencia de CYSDV en material vegetal se determinó mediante la detección del virus
utilizando las técnicas de hibridación molecular en improntas sobre membranas de nylon de secciones
de tejidos (tissue-print; ver para un ejemplo Narváez y col., 2000). Además, en determinadas ocasiones
fue necesario estimar la cantidad de virus y no sólo su presencia ó ausencia. Para ello se utilizó una
técnica basada en la hibridación molecular conocida como dot-blot cuantitativo. El dot-blot cuantitativo
consistió, brevemente, en lo siguiente. El RNA total de muestras de plantas (0,2 g) se extrajo siguiendo el
método descrito por Célix y col. (1996). A continuación, por un lado se sometió a electroforesis en geles
de agarosa una alı́cuota de estos extractos con objeto de estimar la cantidad de RNA total presente con
respecto a patrones de cantidades conocidas y, por otro lado, se insertaron alı́cuotas de estos extractos en
membranas de nylon que se sometieron a un proceso estándar de detección del RNA viral por hibridación
molecular frente a una sonda diseñada para detectar especı́ficamente RNA viral. Para la realización de
los dot-blots cuantitativos se insertaron también en las membranas cantidades conocidas de RNA viral
que posibilitaron obtener para cada blot una curva patrón de cantidades de RNA viral frente a señal de
hibridación. Las señales de hibridación se cuantificaron por densitometrı́a óptica. Las curvas patrones
permitieron deducir por intrapolación las cantidades absolutas de RNA viral presente en cada extracto
de RNA total. Finalmente, las cantidades absolutas de RNA viral se refirieron a las cantidades absolutas
de RNA total de cada muestra.
La sonda utilizada en las hibridaciones moleculares, tanto en improntas de tejidos como en dot-blot,
fue de cRNA y obtenida por transcripción in vitro utilizando como molde el plásmido pLM12.2 (Figura
2). Es de destacar que este plásmido contiene una secuencia viral distinta de la usada para crear el
transgén y que, por tanto, la sonda derivada de este plásmido sólo detecta RNA del virus y no RNA de
tipo viral generado a partir del transgén. Para la preparación de las sondas se procedió como se describe a
continuación. El plásmido pLM12.2 se linearizó utilizando el enzima de restricción SphI Para la reacción
de transcripción in vitro se utilizaron 10 µl de este DNA linearizado a una concentración de 100 ng/µl
a los que se añadieron 20 µl de tampón de transcripción concentrado 5 veces (Amersham Pharmacia
Biotech), 10 µl de DTT 100 mM, 20 µl de una mezcla de rNTPs 2,5 mM que contiene DIG-11-UTP
(Boehringer) en una concentración 1 mM, 50 U de inhibidor de RNasas (Amersham Pharmacia Biotech)
y 50 U de la transcriptasa SP6 (Amersham Pharmacia Biotech), todo ello en un volumen final de 100
µl. Esta mezcla se mantuvo a 37◦C durante 1 h 30 minutos. Transcurrido este tiempo se añadieron
10 U de DNasa libre de RNasas (Boehringer) y se continuó la incubación durante otros 30 minutos. A
continuación, se añadieron a la mezcla 4 µl de EDTA 0,5 M, 5 µl de ClLi 8 M y 300 µl de etanol puro,
se mantuvo a -20◦C durante 3 h y el cRNA precipitado se concentró por centrifugación. El precipitado
seco se resuspendió en 50 µl de agua a los que se añadieron otros 50 µl de tampón carbonato de pH 10,2
para proceder a la hidrólisis controlada del cRNA. Esta mezcla se mantuvo a 60◦ C durante 56 minutos y,
a continuación, se añadieron 5 µl de ácido acético al 10 %, 10 µl de acetato sódico 3 M y 250 µl de etanol
puro. Se mantuvo a -20◦C durante 3 h y el cRNA precipitado se concentró mediante centrifugación. El
precipitado seco se resuspendió en 100 µl de formamida al 50 %. La sonda ası́ preparada se utilizó a
diluciones 1:1000 en tampón estándar de hibridación, siguiendo los procedimientos al uso.
50
Referencias
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45
50
55
60
14
ES 2 200 696 A1
REIVINDICACIONES
1. Una construcción de ácido nucleico que comprende
5
una primera secuencia de nucleótidos capaz de regular la transcripción en una planta de una segunda
secuencia de nucleótidos, comprendiendo dicha segunda secuencia de nucleótidos:
(i) una secuencia de nucleótidos correspondiente a un fragmento del RNA1 del Virus del amarilleo y
enanismo de las cucurbitáceas (CYSDV), y
10
(ii) una repetición invertida de la totalidad o parte de dicha secuencia de nucleótidos (i).
2. Construcción según la reivindicación 1, en la que dicha secuencia de nucleótidos (i) comprende una
secuencia de nucleótidos del ORF 1b del RNA1 del CYSDV.
15
3. Construcción según la reivindicación 1, en la que dicha secuencia de nucleótidos (i) comprende la
secuencia de nucleótidos identificada como SEQ. ID. N◦ : 2.
4. Construcción según la reivindicación 1, en la que dicha secuencia de nucleótidos (ii) comprende la
repetición invertida de la secuencia de nucleótidos identificada como SEQ. ID. N◦ : 2.
20
25
5. Construcción según la reivindicación 1, que comprende, además, una secuencia de nucleótidos (iii),
espaciadora, entre dichas secuencias de nucleótidos (i) y (ii).
6. Construcción según la reivindicación 5, en la que dicha secuencia de nucleótidos (iii) espaciadora
comprende la secuencia de nucleótidos identificada como SEQ. ID. N◦ : 3.
7. Construcción según la reivindicación 1, en la que dicha primera secuencia de nucleótidos comprende
un promotor funcional en plantas.
30
8. Construcción según la reivindicación 7, en la que dicho promotor funcional en plantas es un promotor constitutivo, inducible o especı́fico de tejido.
9. Construcción según la reivindicación 8, en la que dicho promotor funcional en plantas es el promotor 35S del Virus del mosaico de la coliflor (CaMV).
35
40
10. Construcción según la reivindicación 1, que comprende, además, un terminador de la transcripción
funcional en plantas.
11. Construcción según la reivindicación 10, en la que dicho terminador de la transcripción funcional
en plantas es el terminador poli(A) de CaMV.
12. Construcción según la reivindicación 1, que comprende un promotor funcional en plantas capaz
de regular la transcripción en plantas de una segunda secuencia de nucleótidos, y un terminador de la
transcripción funcional en plantas, comprendiendo dicha segunda secuencia de nucleótidos:
45
(i) la secuencia de nucleótidos identificada como SEQ. ID. N◦ : 2;
(ii) la repetición invertida de dicha SEQ. ID. N◦ : 2; y
50
55
(iii) entre dichas secuencias de nucleótidos (i) y (ii), la secuencia de nucleótidos identificada como SEQ.
ID. N◦ : 3.
13. Construcción según la reivindicación 1, que comprende, además, una tercera secuencia de nucleótidos que permite seleccionar una planta transformada con dicha construcción, estando dicha tercera
secuencia de nucleótidos operativamente unida a un promotor funcional en plantas que regula la expresión
de dicha tercera secuencia de nucleótidos y a un terminador de la transcripción funcional en plantas.
14. Construcción según la reivindicación 13, en la que dicha tercera secuencia de nucleótidos comprende el gen de la neomicin-fosfotransferasa II, capaz de conferir resistencia a kanamicina en una planta
transformada con dicha construcción.
60
15. Construcción según la reivindicación 13, en la que dicho promotor funcional en plantas que regula
la expresión de dicha tercera secuencia de nucleótidos es el promotor del gen nopalin sintetasa (pNOS).
15
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16. Construcción según la reivindicación 13, en la que dicho terminador de la transcripción funcional
en plantas es el terminador poli(A) del gen NOS.
5
17. Un vector que comprende una construcción de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16.
18. Una célula vegetal transformada con una construcción de ácido nucleico según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 16, o con un vector según la reivindicación 17.
10
19. Una célula vegetal transgénica que comprende, integrada en su genoma, una construcción de ácido
nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16.
20. Una planta transgénica que comprende, al menos, una célula transgénica según la reivindicación
19.
15
21. Una planta transformada con una construcción de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, o con un vector según la reivindicación 17.
22. Una planta que es un clon o un descendiente de la planta de la reivindicación 20 ó 21.
20
23. Una planta hı́brida con resistencia mejorada frente al virus del amarilleo y enanismo de las cucurbitáceas (CYSDV), preparada por cruce de una planta transgénica según la reivindicación 20, una planta
transformada según la reivindicación 21, o un clon o descendiente de las mismas, según la reivindicación
22, con una segunda planta susceptible a la infección por CYSDV.
25
24. Un propágulo de una planta según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23.
25. Propágulo según la reivindicación 24, que comprende una semilla.
30
26. Una semilla de una planta que comprende la segunda secuencia de nucleótidos definida en las
reivindicaciones 1 a 6.
35
27. Un método para generar resistencia frente al virus del amarilleo y enanismo de las cucurbitáceas
(CYSDV) en plantas susceptibles a la infección por CYSDV, que comprende transformar una célula vegetal de una planta susceptible a la infección por CYSDV con una construcción de ácido nucleico según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, y regenerar la planta a partir de dicha célula vegetal transformada.
40
28. Uso de una construcción según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 en la producción de una
planta transgénica con resistencia mejorada a la infección por CYSDV.
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Figura 7
32
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LISTA DE SECUENCIAS
<110> Consejo Superior de Investigaciones Cientı́ficas
5
<120> Métodos para generar resistencia frente al Virus del amarilleo y enanismo de las cucurbitáceas
(CYSDV) en plantas, construcciones genéticas usadas y plantas resistentes a CYSDV obtenidas mediante
dicho método.
<160> 3
10
<210> 1
<211> 9123
15
<212> ADN
<213> Virus del amarilleo y enanismo de las cucurbitáceas (CYSDV)
<400> 1
20
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5
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45
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ES 2 200 696 A1
5
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25
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35
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4
ES 2 200 696 A1
5
10
15
20
25
<210> 2
<211> 711
<212> ADN
30
<213> Virus del amarilleo y enanismo de las cucurbitáceas (CYSDV)
<400> 2
35
40
45
50
55
<210> 3
<211> 146
<212> ADN
60
<213> Virus del amarilleo y enanismo de las cucurbitáceas (CYSDV)
<400> 3
5
ES 2 200 696 A1
5
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30
35
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kES 2 200 696
kN. solicitud: 200201437
kFecha de presentación de la solicitud: 21.06.2002
kFecha de prioridad:
OFICINA ESPAÑOLA
DE PATENTES Y MARCAS
11
ESPAÑA
22
21
◦
32
INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA
k
51 Int. Cl.7 :
C12N 15/11, 15/40, A01H 5/00
DOCUMENTOS RELEVANTES
Categorı́a
Documentos citados
Reivindicaciones
afectadas
Y
WATERHOUSE et al. Virus resistance and gene silencing in plants
can be induced by simultaneous expression of sense and antisense
RNA. Proc. Natl. Acad. Sci., 1998, Vol. 95, páginas 13959-13964.
(Citado en la solicitud)
1-2,5-11,
13-28
Y
CELIX, ANA et al. Characterizacion of cucurbit yellow stunting
disorder virus, a Bemisia tabaci-transmitted closterovirus.
Phytopathology, (1996), 86 (12), 1370-1376.
(Citado en la solicitud)
1-2,5-11,
13-28
A
KLAASSEN V.A. et al. Genome structure and phylogenetic analysis
of lettuce infectious yellowsvirus, a whitefly-transmitted,
bipartite closterovirus. Virology, 1995, 208 (1): 99-110.
1-28
A
WO 9502056 A2 (THE UPJOHN COMPANY) 19.01.1995
1-28
Categorı́a de los documentos citados
X: de particular relevancia
O: referido a divulgación no escrita
Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la
P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación
misma categorı́a
A: refleja el estado de la técnica
de la solicitud
E: documento anterior, pero publicado después de la fecha
de presentación de la solicitud
El presente informe ha sido realizado
× para todas las reivindicaciones
Fecha de realización del informe
26.01.2004
para las reivindicaciones n◦ :
Examinador
M. Hernández Cuéllar
Página
1/1