la carga metabólica debida a la transcripción de plasmidos esta

XI CONGRESO NACIONAL DE BIOTECNOLOGÍA Y BIOINGENIERÍA
LA CARGA METABÓLICA DEBIDA A LA TRANSCRIPCIÓN DE PLASMIDOS ESTA
LIMITADA EN PARTE POR LA REGENERACIÓN DE PODER REDUCTOR
GERARDO HUERTA-BERISTAIN, SALVADOR FLORES, FRANCISCO BOLIVAR, GUILLERMO GOSSET,
ALFREDO MARTÍNEZ
Departamento de Ingeniería Celular y Biocatálisis, Instituto de Biotecnología - UNAM.
Av. Universidad 2001, Cuernavaca, Mor., CP 62210, México. Fax (777) 3172388. [email protected]
Palabras clave: Escherichia coli, Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, NADPH/NADH.
Resultados y discusión. Al transformar E. coli JM101 con
pTrc99A, pTrczwfEc y pTrczwfZm, la µ se redujo de 0.66 h-1
(silvestre) a 0.54, 0.49 y 0.51 h-1 respectivamente, en
promedio 33% debido al efecto de carga metabólica (Fig. 1).
No obstante que a diferentes niveles, al inducir la expresión
de zwf se incrementó la actividad de ZwfEc y ZwfZm, en
consecuencia aumentó la µ (Fig. 1) hasta 0.57 y 0.64 h-1 con
60 y 5.3 UI/mgPROT respectivamente. Esto es una
recuperación de la µ del 87 y prácticamente del 100% con
ZwfEc y ZwfZm, respectivamente.
Estos resultados muestran que incrementos en la actividad de
Zwf y en consecuencia en el flujo de carbono a través del
brazo oxidativo de la vía de las pentosas, incrementa la µ,
debido a que algunos precursores para nucleótidos y el
NADPH+H+ utilizado en reacciones biosintéticas, son
0.70
0.65
0.60
-1
Metodología. Se clonaron los genes zwfEc y zwfZm
(obtenidos, mediante amplificación por PCR, a partir del
ADN cromosomal) bajo la regulación del promotor trc en el
plásmido multicopia pTrc99A inducible por isopropil-tiobeta-D-galactopiranosido (IPTG). Los plásmidos se
transformaron en E. coli JM101. Mediante la adición de
IPTG se indujo la expresión de zwf y se evaluó su efecto
sobre los niveles de actividad de Zwf y µ en cultivos con
medio mineral y 2 g/l de glucosa.
sintetizados en mayor proporción a través de esta vía
ayudando a aliviar el efecto de carga metabólica. Sin
embargo al incrementar la actividad de ZwfEc, por arriba de
60 UI/mgPROT la µ disminuye drásticamente (fig. 1). Esto
probablemente se debe a un incremento elevado en la
disponibilidad de NADPH+H+ , el cual inhibe a ZwfEc.
Los incrementos de actividad específica de ZwfZm son
menores en un orden de magnitud en comparación con la
obtenida con ZwfEc, no obstante la µ se recupera totalmente.
ZwfZm utiliza indistintamente como cofactores a NAD+ o
NADP+ [2]. Se sugiere que los niveles de precursores
metabólicos, y de NADPH+H+ y NADH+H+ generados en
conjunto por ZwfZm y enzimas de la vía de las pentosas
permiten forzar un mayor flujo de carbono por el brazo
oxidátivo de la vía, generar una cantidad suficiente de poder
reductor para biosíntesis y al generarse una mayor
disponibilidad de NADH+H+ potencialmente se produce más
ATP y en consecuencia la recuperación de la velocidad de
crecimiento es cercana al 100%. Además ZwfZm no se inhibe
por NADPH+H+ o NADH+H+ [2].
µ (h )
Introducción. Escherichia coli es uno de los
microorganismos más utilizado para controlar la expresión
de genes homólogos ó heterólogos y llevar a cabo estudios
básicos, producción de proteínas o metabolitos de interés
comercial. Frecuentemente es necesario utilizar plásmidos
multicopia para lograr altos niveles de expresión, sin
embargo está estrategia conduce a reducciones drásticas en
la velocidad de crecimiento (µ), debido (entre otros factores)
a incrementos en la demanda de: nucleótidos y energía para
replicar el plásmido; carga de ARN y ribosomas;
aminoácidos y poder reductor para sintetizar la(s) proteína(s)
[1]. La ingeniería metabólica permite dirigir el flujo de
carbono a través de vías deseadas y potencialmente abatir la
demanda de precursores.
En este trabajo se evaluó como la generación de poder
reductor (NADPH+H+ o NADH+H+) permite recuperar la µ
en cepas de E. coli con carga metabólica. Se evaluó la
generación de NADPH+H+ al sobre-expresar zwf (glucosa-6fosfato deshidrogenasa) homóloga de E. coli (zwfEc), y la
formación de NADPH+H+/NADH+H+ con zwf de
Zymomonas mobilis (zwfZm) en cepas silvestres de E. coli.
0.55
0.50
0.45
0.40
0
2
4
6
8
10
20
40
60
80
Actividad Específica de Zwf (UI/mgPROT )
ZwfEc
ZwfZ m
JM101
JM101/pTrc99A
Fig 1. Evaluación de la µ en función de la actividad de glucosa-6fosfato deshidrogenasa (Zwf).
Conclusiones. La carga metabólica ocasionada por
transcripción de plásmidos multicopia fue contrarrestada
completamente por incrementos en la síntesis de
intermediarios metabolicos de la vía de las pentosas y la
cogeneración de NADPH+H+ y NADH+H+.
Agradecimientos. Al CONACYT, proyecto Z-003.
Bibliografía. [1] Flores S., Herrera R., Gosset G., Bolivar F.
(2004). Growth-rate recovery of Escherichia coli cultures carrying
a multicopy plasmid, by engineering of the pentose-phosphate
pathway. Botechnol Bioeng. 87 (4): 485-494.
[2] Scopes R K. (1997). Allosteric control of Zymomonas mobilis
glucose-6-phosphate dehydrogenase by phosphoenolpyruvate.
Biochem J. 326: 731-735.