Una vez liberados huevos y espermatozoides estan destinadso a

FECUNDACIÓN
Una vez liberados los ovocitos y los espermatozoides están destinados a morir en
minutos o en horas a no ser que ellos se encuentren y se fusionen dando comienzo al
proceso de fecundación. Mediante la fecundación el ovocito y el espermatozoide son
salvados: el ovocito es activado para comenzar su programa de desarrollo y los núcleos
haploides de los dos gametos se fusionan para formar el núcleo diploide de un nuevo
organismo. La fertilización fue originalmente estudiada en invertebrados marinos tales
como erizo de mar y estrella de mar la cual ocurre en el agua de mar luego de liberado un
alto número de ovocitos y espermatozoides. La fecundación externa es más fácil de
estudiar que la fecundación interna que ocurre en el tracto femenino de las hembras
luego de la cópula, como por ejemplo, en los mamíferos. Sin embargo, a finales de 1950
se logró fecundar de ovocitos de mamífero in vitro abriendo el camino al estudio de los
eventos celulares y moleculares que ocurren en el inicio del desarrollo de este grupo.
En esta sección nos centraremos en la fertilización en mamíferos. Consideraremos
primero la maduración del espermatozoide que ocurre en el tracto femenino. Luego
analizaremos el primer contacto del espermatozoide con el ovocito (zona pelúcida) lo cual
desencadena la reacción acrosómica, necesaria para que el espermatozoide atraviese la
zona y se fusione con el ovocito. Luego estudiaremos la fusión de las membranas
plasmáticas del ovocito y del espermatozoide. Después discutiremos cómo la fusión del
espermatozoide activa el ovocito y cómo ocurre la fusión de los núcleos de los dos
gametos para originar el cigoto y así completar la fertilización.
El espermatozoide eyaculado es capacitado en el tracto reproductor femenino
De los 300.000.000 millones de espermatozoides eyaculados durante el coito solamente
200 alcanzan el lugar de la fertilización en el oviducto. Una vez que un espermatozoide
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alcanza el huevo debe migrar a través de la capa de células foliculares que rodea al
ovocito y luego unirse la zona pelúcida y atravesarla. Finalmente el debe unirse a la
membrana plasmática del ovocito y fusionarse con ella.
Para ser competentes en estas funciones normalmente los espermatozoides eyaculados
de los mamíferos tienen que ser modificados a su paso por el tracto genital femenino, en
un proceso llamado capacitación. En humanos esta lleva de 5 a 6 hrs. y termina cuando
los gametos masculinos entran en el oviducto.
El espermatozoide sufre cambios bioquímicos y funcionales, incluyendo cambios en las
glicoproteínas, en los lípidos, en los canales iónicos de la membrana plasmática y en su
potencial de reposo, el cual cambia a valores más negativos quedando la membrana
hiperpolarizada. La capacitación también está asociada con un aumento en el pH
intracelular, fosforilación de las tirosinas de varias proteínas y el desenmascarado de
varios receptores de membrana que necesita el espermatozoide para unirse a la zona
pelúcida.
La capacitación altera dos aspectos cruciales del comportamiento de los
espermatozoides: aumenta sustancialmente la movilidad del flagelo y lo habilita para la
reacción acrosómica.
La capacitación puede ocurrir in vitro en un medio adecuado y es un paso fundamental
para fertilización in vitro. Hay tres componentes críticos que deben estar presentes en el
medio, albúmina, Ca2+ y HCO3−, ya que están en altas concentraciones en el tracto
reproductor femenino. La albúmina participa en la extracción del colesterol de la
membrana plasmática del espermatozoide, aumentando así la capacidad de esta de
unirse a la membrana de la vesícula acrosómica durante la reacción acrosómica. Los
iones Ca2+ y HCO3− entran en el citoplasma del espermatozoide y activan la enzima
adenilato ciclasa que produce AMPc, el cual propicia la mayoría de los cambios que
ocurren en la capacitación.
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El espermatozoide capacitado se une a la zona pelúcida y se desencadena la
reacción acrosómica
Durante la ovulación los ovocitos de mamífero son liberados de los ovarios en la cavidad
peritoneal cerca de la entrada del oviducto, y rápidamente son barridos hacia el. Ellos
están cubiertos por una capa células (corona radiada) que están embebidas en una
matriz extracelular rica en ácido hialurónico. Dichas células participan en el ingreso del
ovocito en el oviducto y secretan una señal química que atrae el espermatozoide, dicha
señal aun no está identificada.
Una vez que el espermatozoide llega al óvulo, éste debe atravesar la corona radiada y lo
hace con la enzima hialuronidasa, que porta en su membrana plasmática. Luego se unirá
a la zona pelúcida (figura 1). La zona pelúcida (cubierta vitelina) actúa como barrera para
la fecundación cruzada entre especies, por ejemplo un espermatozoide humano sólo
puede fecundar un ovocito de hámster si a éste se le ha quitado la zona pelúcida, sin
embargo en esos embriones híbridos el desarrollo no es viable. Algunas veces se utilizan
los ovocitos de hámster despojados de la zona pelúcida en estudios clínicos de
esterilidad para valorar la capacidad fecundante de los espermatozoides humanos in
vitro (figura 2).
Figura 1 La zona pelúcida.
A) Micrografía electrónica de barrido
de un oocito de hámster, mostrando
la zona pelúcida.
B) La zona (a la que están adheridos
muchos espermatozoides) se ha
separado para poner de manifiesto
la membrana plasmática subyacente
que presentan numerosos microvilli.
La zona pelúcida
ha sido
sintetizada exclusivamente por el
oocito
(De D. M. Phillips, J. Ultrastruc. Res.
72:1-12, 1980)
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Figura 2 Micrografía electrónica de barrido de un espermatozoide humano en contacto
con un oocito de hámster.
Se ha eliminado la ZP del oocito, quedando al descubierto la membrana plasmática que
presenta numerosos microvilli. La capacidad de un espermatozoide para penetrar en un
oocito de hámster se utiliza como prueba de fertilidad; una penetración del 10 al 25 % de los
oocitos se considera un valor normal.
(Por cortesía de David M. Phillips)
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La zona pelúcida de los mamíferos está integrada por tres glicoproteínas todas ellas
producidas exclusivamente por el ovocito. Dos de ellas ZP2 y ZP3 se ensamblan
formando largos filamentos mientra que la ZP1 entrecruza los filamentos, constituyendo
así una red tridimensional. La proteína ZP3 es crucial: las hembras de ratón con un gen
ZP3 alterado producen ovocitos sin zona pelúcida y son estériles.
ZP3 es responsable, al menos en el ratón, de la unión específica de especie del
espermatozoide a la cubierta, Diversas proteínas de la superficie del espermatozoide que
se unen a un oligosacárido de la ZP3 se consideran receptores para esta glicoproteína,
aunque su función se está por determinar. La unión del espermatozoide a la zona es
compleja e involucra mecanismos dependientes e independientes de ZP3 y una gran
variedad de proteínas de la superficie del espermatozoide.
La zona pelúcida induce la reacción acrosómica en al cual el contenido de la vesícula
acrosómica es liberado por exocitosis (figura 3).
La reacción acrosómica es
indispensable para la normal fecundación. Dicha reacción expone varias enzimas
hidrolíticas requeridas para la formación del túnel en la zona pelúcida por donde pasará el
espermatozoide para alcanzar la superficie del ovocito y luego fusionarse con ella. In
vitro la reacción acrosómica es desencadena por la ZP3, posiblemente activando los
receptores tipo lectina en la superficie del espermatozoide, se supone que tales
receptores sean la forma transmembrana de la enzima galactosil-transferasa. La
activación del receptor provoca un aumento del Ca2+ intracelular lo cual desencadena la
exocitosis de la vesícula acrosómica.
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Figura 3 La reacción acrosómica que se produce en los mamíferos cuando un espermatozoide
fecunda un oocito.
En el ratón parece que una sola glucoproteína de la cubierta vitelina, la ZP3, es la responsable tanto de la
unión del espermatozoide como de inducir la reacción acrosómica. Obsérvese como un espermatozoide
de mamífero interacciona tangencialmente con la membrana plasmática del oocito; de modo que la fusión
se produce, más que en el extremo, en la región ecuatorial de la cabeza de la célula. En el ratón la zona
pelúcida tiene alrededor de 6 μm de grosor y el espermatozoide la atraviesa a una velocidad de 1μm/m
aproximadamente.
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El mecanismo de fusión del ovocito y el espermatozoide sigue aun sin estar claro
Una vez que el espermatozoide penetra la zona pelúcida se encuentra con la membrana
del ovocito, uniéndose a ella por el extremo de una de las microvellosidades que se
encuentran en la superficie del gameto femenino (figura 2). El espermatozoide primero
se une por su extremo y luego por un lado (figura 3). Las microvellosidades vecinas
rápidamente se elongan y rodean al espermatozoide, quedando éste afirmado para
proceder a la unión de las membranas. Después de la fusión, todo el contenido del
espermatozoide ingresa en el ovocito y las microvellosidades se reabsorben.
El mecanismo de fusión de las membranas del espermatozoide y el ovocito aun se
desconoce, sin embargo hay varias proteínas de membrana descriptas que son
necesarias para que ocurra la fusión. Una es la proteína Izumo perteneciente a la
superfamilia de las inmunoglobulinas. Esta aparece expuesta en la superficie del
acrosoma de ratón y de humano durante la reacción acrosómica. Los anticuerpos antiIzumo bloquean la fusión y los espermatozoides Izumo-deficientes fallan en la fusión con
ovocitos normales, pero aun no se sabe como media Izumo la fusión de las membranas.
La única proteína en la superficie del ovocito que está demostrado es necesaria para la
fusión es la CD9, ésta es un miembro de la familia de las tetrasparinas, dado que tiene 4
segmentos transmembrana. Los espermatozoides normales fallan en unirse con ovocitos
deficientes en CD9, lo cual demuestra la importancia de dicha proteína, pero no se sabe
como media la fusión. CD9 no actúan sola, hay varias glicoporoteínas de membrana que
intervienen. El espermatozoide tampoco se unirá a ovocitos que han sido tratados con
enzimas para remover las proteínas de membrana unidas al glucosilfosfatidilinositol
(GIP). Esto demuestra que dichas proteínas también son necesarias, pero aun se
desconoce la o las que realmente median la fusión.
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La fusión del espermatozoide activa el ovocito por un aumento en la concentración
del Ca2+ en el citosol
La fusión con el espermatozoide activa el ovocito causando que los gránulos corticales
liberen su contenido por exocitosis, proceso denominada reacción cortical. La meiosis
que estuvo detenida en la metafase II se reanuda, liberando el segundo cuerpo polar,
pudiendo así el cigoto comenzar su desarrollo.
Un aumento de Ca2+ en el citosol dispara todos estos eventos. Si la concentración de
Ca2+ es elevada artificialmente (directamente por una microinyeccion de Ca2+ o
indirectamente agregando al medio Ca2+ con un ionóforo), los ovocitos de todos los
animales testeados incluyendo los humanos, son activados. También si se agrega un
factor quelante como el EDTA, que secuestra el Ca2+, se impide la activación como
respuesta a la fertilización.
Cuando el espermatozoide se une al ovocito provoca un aumento local de la
concentración de Ca2+ la cual se expande como una onda. La onda se propaga con
feedback positivo, el aumento de Ca2+ citoplasmático promueve la apertura de más
canales permitiendo que más Ca2+ entre en el citosol. En los ovocitos de algunos
mamíferos, el incremento inicial de la concentración de Ca2+ va seguido de oscilaciones
prolongadas de dicha concentración.
La fusión del espermatozoide dispara la onda de Ca2+ y su oscilación por medio de un
factor que introduce en el citosol del ovocito. Una inyección de un espermatozoide
intacto, una cabeza de espermatozoide o un extracto de espermatozoide provoca el
mismo efecto. Todos estos tratamientos provocan el aumento del inositol 1, 4, 5 trifosfato
(IP3), el cual libera Ca2+ del retículo endoplásmico rugoso e inicia la onda de Ca2+ y las
oscilaciones. Un fuerte candidato para el factor que introduce el espermatozoide es una
forma esperma-específica de la fosfolipasa C (PLC), que directamente cliva el
fofatidilinositol 4, 5 bifosfato (PI (4, 5) P2) para producir IP3 y diacilglicerol (figura 4).
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Figura 4 ¿Cómo los receptores acoplados a la proteína G (GPCRs) aumentan el Ca2+ citosólico y activan
la proteína quinasa C (PKC)?
Los GPCRs estimulan la fosfolipasa PLCβ a través de una proteína G. Dependiendo de la isoforma de PLCβ
ésta puede ser activada por la subunidad α de Gq como se muestra en la figura o por la subunidad βγ de otra
proteína G o por ambas. Dos pequeñas moléculas mensajeras intracelulares se producen cuando PI(4,5)P2 se
hidroliza por la activación de PLCβ. El inositol 1,4,5-trifosfato (IP3) difunde a través del citosol y libera Ca2+ de la
2+
2+
membrana del RE. El gran gradiente electroquímico de Ca a través de esas membranas causa que el Ca
escape hacia el citosol cuando los canales se abren. El diacilglicerol permanece en la membrana plasmática y
junto con la fosfatidilserina (no se muestra) y Ca2+ ayuda a activar la proteína quinasa C (PKC) la cual es
reclutada del citosol a la superficie citosólica de la membrana plasmática. De las diez o más isoformas distintas
de PKC humana, cuatro por lo menos son activadas por el diacilglicerol.
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La reacción cortical asegura que sólo un espermatozoide fertilice el ovocito
A pesar de que varios espermatozoides pueden llegar a las inmediaciones del ovocito,
sólo uno puede fusionarse con él e inyectar en su citoplasma el núcleo y los demás
organelos. Si más de un espermatozoide fusiona su membrana con el ovocito
(polispermia) entonces se formará más de un huso mitótico, habiendo segregación
desigual de cromosomas, se producirán células aneuploides y el desarrollo se detendrá.
Dos mecanismos aseguran que sólo un espermatozoide fertilice el ovocito. Primero, en
muchos casos (erizo de mar) una rápida despolarización de la membrana plasmática del
ovocito, causada por la fusión del primer espermatozoide, impide que otros
espermatozoides se fusionen, actuado así como un rápido bloqueo primario de la
polispermia (en mamíferos aún no se conoce el mecanismo). Sin embargo, el potencial
de membrana recupera rápidamente su valor normal poco después de la fecundación, de
manera que es necesario un segundo mecanismo para asegurar a largo plazo el bloqueo
secundario de la polispermia. Este segundo mecanismo de bloqueo de la polispermia es
desencadenado por la reacción cortical del ovocito, mediante la cual se produce la
exocitosis de los gránulos corticales debido al incremento del Ca+2 intracelular. El
contenido de los gránulos corticales incluye varias enzimas que al ser liberadas alteran la
estructura de la zona pelúcida. Esta cubierta alterada se ”endurece”, de manera que no
se puede unir a ella ningún otro espermatozoide, constituyendo un bloqueo definitivo a la
polispermia. Entre los cambios que se producen en la zona pelúcida están la
degradación proteolítica de la ZP2 y la hidrólisis de los azúcares de ZP3 (figura 5).
El espermatozoide provee de los centríolos y de su genoma en la formación del
cigoto
Una vez fertilizado el ovocito se llama cigoto. La fertilización no está completa hasta que
los núcleos haploides (denominados pronúcleos), uno proveniente del ovocito y otro del
espermatozoide, se fusionan y combinan sus cromosomas formando un sólo núcleo
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diploide. Los pronúcleos de mamíferos no se fusionan directamente como ocurre en
todas las especies. Ellos se aproximan pero permanecen independientes uno del otro
hasta que la envoltura nuclear de cada pronúcleo se desensambla y se forma el primer
huso mitótico del cigoto (figura 6).
Figura 5 Esquema que representa de qué
forma la reacción cortical puede impedir
que entre más de un espermatozoide en
un oocito de ratón.
La liberación del contenido de los gránulos
corticales elimina los carbohidratos de la ZP3
de manera que ya no pueden unirse a la
membrana plasmática del espermatozoide y
fracciona parcialmente la ZP2, endureciendo
la cubierta. Estos dos cambios provocan un
bloqueo de la polispermia.
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Figura 6 Unión de los pronúcleos del espermatozoide y del oocito después de la fecundación
en los mamíferos.
Los pronúcleos migran hacia el centro del óvulo. Cuando se encuentran, las envolturas nucleares se
interdigitan. Los centrosomas se replican, las envolturas nucleares se desensamblan y los
cromosomas de ambos gametos se integran formando un huso mitótico común, que determina la
primera división del cigoto.
(Adaptado de dibujos y micrografías de Daniel Szöllösi)
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Figura 7
Micrografía de
inmunofluorescencia
de
la
fusión de un espermatozoide
humano y el pronúcleo de un
óvulo en un proceso de
fecundación in vitro.
Los microtúbulos del huso se han
teñido de color verde con
anticuerpos antitubulina y el ADN
está marcado con azul mediante
un colorante específico.
A) Huso meiótico en un oocito
maduro no fecundado.
B) Éste óvulo fecundado expulsa
su segundo corpúsculo polar
aproximadamente a las 5 hrs. de
la fusión con el espermatozoide
(izquierda) que ha nucleado un
conjunto de microtúbulos.
C) Los dos pronúcleos se
encuentran.
D) A las 16 hrs. de fusión, el
centrosoma que ha entrado con el
espermatozoide se ha duplicado y
los centrosomas han organizado
un huso mitótico bipolar. Los
cromosomas
de
ambos
pronúcleos se alinean en la placa
metafísica del huso.
Como
indican las flechas C) y D), la cola
del espermatozoide se asocia con
uno de los centrosomas (De C.
Simerly et al.Nat.Med. I:47-53, 1995 ©
Macmillan Magazines Ltd.)
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En varios animales incluyendo los humanos, el espermatozoide contribuye con algo más
que su genoma en el cigoto. Aporta los centríolos, estructuras que se pierden en el
ovocito sin fertilizar. Los centríolos entran en el ovocito, junto con el pronúcleo masculino
y toda la cola del espermatozoide, y el centrosoma se forma alrededor de ellos. En la
especie humana, este centrosoma se duplica y organiza el primer huso mitótico del cigoto
(figura 7). Esto explica porqué la polispermia causa la formación de varios husos
mitóticos, cuando muchos espermatozoides transfieren sus centríolos al ovocito.
La fecundación marca el comienzo de uno de los fenómenos más extraordinarios de toda
la biología − el proceso de embriogénesis − durante el cual el cigoto se desarrolla
formando un nuevo individuo.
Tomado y modificado de Molecular Biology of the Cell 5/e (© Garland Science 2008)
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