TÕTULO DEL ARTÕCULO EN TAMAÃ`O 12 Y NEGRITA

Tercer Congreso Nacional – Segundo Congreso Iberoamericano
Hidrógeno y Fuentes Sustentables de Energía – HYFUSEN 2009
12-73
PRODUCCIÓN DE LÍPIDOS A PARTIR DE LEVADURA OLEAGINOSA
Rhodotorula glutinis
Martearena MR.(1) , Scaroni E.(2) , Locatelli S(3).
Univesidad Nacional de Salta, Avenida Bolivia 5150, CP 4400, Salta, Argentina.
(1) [email protected]
(2) [email protected]
(3) [email protected]
RESUMEN
Los microorganismos oleaginosos pueden considerarse como una alternativa a las fuentes vegetales y
animales para la producción de lípidos y biomasa proteica. La mayoría de estos lípidos pueden llegar a
ser alternativa para una industria de biodiesel sustentable. Algunas levaduras pueden acumular lípidos
intracelularmente en más de un 70% de su biomasa en peso seco.
En este trabajo se estudia la producción de lípidos a partir de Rhodotorula glutinis utilizando glucosa
como fuente de carbono y peptona como fuente de nitrógeno. En una primera etapa se generó biomasa
en un medio para producción de inóculo con una relación C/N igual a 8, durante 24hs. a 28 °C con
agitación de 140 rpm. En una segunda etapa se utilizó un medio de cultivo con exceso de glucosa y
contenido de nitrógeno limitante para generar lípidos durante 96hs. a 28 °C y agitación de 140 rpm.
Palabras claves: microorganismos oleaginosos, Rhodotorula glutinis, lípidos.
1. INTRODUCCIÓN
Con el incremento en el precio del aceite crudo,
la disminución proyectada en el suministro de
aceites, más las consecuencias ambientales de los
combustibles fósiles, en estos últimos años se
generó el interés en la búsqueda de
biocombustibles [1].
Los microorganismos pueden considerarse como
una alternativa potencial de productores de
aceites y grasas frente a las fuentes vegetales y
animales para la producción de biodiesel.
Las levaduras podrían ser utilizadas para la
producción de aceites de origen microbiano a
partir de residuos agroindustriales para la
producción de biodiesel y controlar la
contaminación ambiental [2].
Los microorganismos que pueden acumular
lípidos en más de un 20 % de su biomasa se los
llama microorganismos. oleaginosos Algunas
levaduras
como
Rhodosporidium
sp.,
Rhodotorula sp. y lipomyces sp. , pueden
acumular lípidos intracelularmente en más de un
70 % de su biomasa en peso seco. La mayoría de
estos lípidos son triacilgliceroles con ácidos
grasos de cadena larga, por lo que pueden llegar
a ser una alternativa para una industria del
biodiesel sustentable [3].
La
acumulación
de
lípidos
en
los
microorganismos oleaginosos ocurre cuando la
fuente de nitrógeno del medio se ha agotado y el
exceso de carbono es asimilado por las células y
convertidos en triacilgliceroles, por lo que hay
una relación crítica de C/N.
Los lípidos son sintetizados durante la fase de
crecimiento a la misma velocidad y son
acumulados [4]
En este trabajo se estudia la producción de
lípidos a partir de Rhodotorula glutinis y una
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Hidrógeno y Fuentes Sustentables de Energía – HYFUSEN 2009
cepa aislada de cachaza de un Ingenio del
Noroeste Argentino, utilizando glucosa como
fuente de carbono, peptona y (NH4)2SO4 como
fuentes de nitrógeno.
2. MATERIALES Y METODOS
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2.4. Método de extracción de lípidos
La extracción de lípidos se realizó a partir de
biomasas seca con diclorometano y mezcla de
cloroformo:metanol (2:1 v/v) durante 4 horas en
soxhlet. El solvente fue evaporado y los lípidos
fueron analizados por un equipo IR Spectrum
GX Serial Nº 76594/5/6 Perkin Elmer.
2.1. Cepas
Cepa autóctona con características de
Rhodotorula aislada de cachaza de un Ingenio de
la Provincia de Salta, que actualmente está
siendo identificada.
2.2. Medios de cultivos
Medio para inóculo 1 (mc1): 40 g/L glucosa, 15
g/L extracto de levadura, 5 g/L peptona, pH 6,0
[5].
Medio para inóculo 2 (mc2): 40 g/L glucosa, 15
g/L de extracto de levadura, 20 g/L (NH4)2SO4,
70 g/L KH2PO4, 20 g/L Na2SO4, 15 g/L
MgSO4.7H2O, pH 5,5[1].
Medio limitado de nitrógeno: 100 g/L glucosa, 8
g/L extracto de levadura, 3 g/L peptona, pH 5,0
[5].
2.3. Método Analítico
En un erlermeyer de 500 ml se colocó 100 mL de
medio para inóculo 1 y en otro 100 mL de medio
para inóculo 2. Se inocularon ambos con
Rhodotorula glutinis a 28 ºC durante 24 horas a
140 rpm. De la misma manera se trabajó con la
cepa aislada de cachaza.
Posteriormente en erlemeyers de 500 mL que
contenían 100 mL de medio de bajo nitrógeno se
colocó 10 % y 50 % de volumen de inóculo de
Rhodotorula glutinis respectivamente. Se
incubaron a 28 ºC durante 96 horas a 140 rpm.
Para la cepa aislada se trabajó con 50 % de
inóculo. Se determinó el número de células
durante la experiencia en cámara de Neubauer.
Se centrifugó a 7000 rpm, se lavó dos veces con
agua y se determinó biomasa sobre base seca.
Los lípidos obtenidos fueron analizados por un
equipo IR Spectrum GX Serial Nº 76594/5/6
Perkin Elmer.
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Se realizó el recuento de células en el medio de
bajo contenido de nitrógeno a distintos tiempos
del cultivo. En la Figura 1 se observa que cuando
se utilizó el mismo volumen de inóculo el
comportamiento de la cepa aislada es semejante
al de Rhodotorula glutinis. Por otra parte el
medio de inóculo que contiene peptona como
fuente de nitrógeno (mc1) presenta un mayor
número de células que el medio que contiene
(NH4)2SO4 (mc2).
200
nº de cel x 107/ml
Rhodotorula glutinis suministrada por el Instituto
Spegazzini de La Plata-Buenos Aires.
150
100
50
0
0
50
100
tiempo (horas)
150
R.glutinis 50%mc2
R.glutinis 10% mc1
Cepa aislada 50% mc1
R.glutinis 50%mc1
Figura 1: Recuento de células en medio de bajo
contenido de nitrógeno.
En la Figura 2 se observan las células de
Rhodotorula glutinis provenientes del medio
mc1 en crecimiento. Estas corresponden al
tiempo cero en el medio de bajo contenido de
nitrógeno, cuando se utilizó un 10 % de volumen
de inóculo.
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totales fue para Rhodotorula glutinis en medio de
inóculo 1, con peptona, con un volumen de
inóculo del 10 %.
Cepa
Figura 2: Foto de la cepa Rhodotorula glutinis
en medio para inóculo 1 (x5000).
A las 96 hs, Figura 3, las células presentan
mayor tamaño que en el tiempo cero debido a la
acumulación de lípidos.
Medio
de
inóculo
%V
inóculo
%
Lípidos
totales
R. glutinis
Mc1
50
8,00
R.glutinis
Mc1
10
33,7
R.glutinis
Mc2
50
3,30
aislada
Mc1
50
5,60
Tabla I: Porcentaje de lípidos totales producidos
sobre base de biomasa seca.
Se determinó glucosa por el método de glucosa
enzimática a las 96 hs en el sobrenadante,
encontrándose que la misma se había agotado
cuando se utilizó un volumen de inóculo del 50
% y un valor de 2,25 g/L de glucosa para el 10 %
de inóculo. Debido a este consumo tan rápido de
los microorganismos oleaginosos de la fuente de
carbono, no llegaron a acumular lípidos
obteniéndose de esta manera porcentajes bajos de
lípidos totales.
Figura 3: Foto de la cepa Rhodotorula glutinis
en medio de bajo contenido de nitrógeno
(x5000).
Las muestras se observaron en un microscopio
electrónico de barrido marca JEOL Modelo JSM
6480 LV, con electrones secundarios (SEI) con
alto vacío.
Luego de extraer los lípidos con diclorometano y
mezcla de cloroformo:metanol (2:1 v/v) [6]
durante 4 horas en soxhlet. El solvente fue
evaporado y se determinó el porcentaje de
lípidos totales con respecto a la biomasa seca,
tabla I. El mayor porcentaje obtenido de lípidos
Los lípidos fueron seguidos por espectrometría
de IR. En todos los casos se obtuvieron
triacilgliceroles con ácidos grasos de cadena
larga. Se observó menor grado de instauración
cuando se utilizó mc1 y un 50 % de volumen de
inóculo. En la figura 4 se muestra un espectro de
Rhodotorula glutinis comparado con aceite de
girasol como patrón.
Estas levaduras generan como subproductos
biomasa que contiene un 40 % de proteínas
determinadas por el método de Kjeldahl, y ȕcarotenos. Estos temas están siendo estudiados
en forma paralela por nuestro grupo de trabajo.
Tercer Congreso Nacional – Segundo Congreso Iberoamericano
Hidrógeno y Fuentes Sustentables de Energía – HYFUSEN 2009
12-73
[3] Li Y., Zhao Z and F. Bai. Enzyme and
Microbial Technology, 41, 2007, 312-317.
[4] Meng X.,Yang J., Xu X., Zhang L., Nie Q.
and M. Xian. Renewable Energy. 2008, 1-5.
[5] Dai Ch., Tao J., Xie F., Dai Y. and M. Zhao.
African Journal of biotechnology, 6 (18), 2007,
2130-2134.
[6] Zhu M., Zhou P.P. and L J Yu. Bioresourse
Technology, 84, 2002, 93-95.
Figura.4: Espectro IR de lípidos producidos por
R. glutinis (color negro) y aceite de girasol (color
azul)
4. CONCLUSIÓN
La cepa autóctona aislada de cachaza de un
Ingenio de la Provincia de Salta, tiene un
comportamiento similar a Rhodotorula glutinis.
Las condiciones óptimas encontradas para la
producción de lípidos son medio de inóculo con
peptona y volumen de inóculo 10%. La
velocidad de generación de biomasa es
apreciable.
Los lípidos producidos presentan características
similares a los del aceite de girasol pero con un
menor grado de instauración.
5. AGRADECIMINENTOS
Los autores agradecen a la Ing. Silvia Blanco y al
Ing. Pedro Villagrán del INIQUI-Universidad
Nacional de Salta por las fotos tomadas en el
microscopio electrónico.
6. REFERENCIAS
[1] Xue F., Miao J., Zhang X., Luo H., and T.
Tao. Bioresourse Technology, 99, 2008, 59235927.
[2] Zhu L Y, Zong M H. and H. Wu. Bioresourse
Technology, 99, 2008, 7881-7885.