Replicación del DNA

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Facultad de Ciencias Exactas, Universidad Nacional de La Plata
Bioquímica III - 2009
Replicación del DNA
Temario
I. Mecanismos y métodos de estudio. Replicación semiconservativa (experimento de Meselson y Stahl). Mecanismo
general de replicación: Orígenes de replicación. Crecimiento de la horquilla de replicación: sentido, unidireccional, bidireccional, continua, discontinua (fragmentos de Okazaki). Métodos experimentales: incorporación de precursores radiactivos
(dNTPs, nucleósidos, 32P), autoradiografía, pulso y lavado de radioactividad (pulse-chase). Esquemas de replicación de
DNAs circulares:  (theta) y círculo rodante.
II. Enzimología Uso de mutantes en el descubrimiento de funciones relacionadas con la replicación. Complementación de
funciones in vitro. Etapas de la replicación: inicio, elongación y terminación, proteínas y actividades enzimáticas involucradas: DnaA, helicasas, DnaC, topoisomerasas DNA polimerasas (fidelidad y corrección de errores o proofreading). Estructura y replicación de genomas en eucariotes Replicación de cromosomas lineales. Telomerasa (estructura y función:
tipo particular de transcriptasa reversa).
III. Regulación. Control de la replicación y ciclo celular. Sistemas de partición de genomas. Ciclo celular. Múltiples replicones.
IV. Aplicaciones de las enzimas de la replicación en Ingeniería Genética: marcación de sondas (fill-in, nick translation, random priming), amplificación (PCR: polymerase chain reaction) y secuenciación de ácidos nucleicos (terminadores
de cadena dideoxy: ddNTPs).
Bibliografía
Libros de texto generales
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

Todos los temas de Biología Molecular y Celular se pueden consultar en le Biblioteca online gratuita de libros de
NCBI. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Books
Genética Moderna. Griffiths, A.J.F., Gelbart, W.M., Miller, J.H., Lewontin, R.C. (2000) McGraw-Hill - Interamericana de España,
SAU. [traducción de: Modern Genetic Analysis. Griffiths, A.J.F., Gelbart, W.M., Miller, J.H., Lewontin, R.C. (1998) W.H. Freeman
and Company.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Search&db=books&doptcmdl=GenBookHL&term=Modern+Genetic+Analysis+A
ND+mga%5Bbook%5D+AND+111140%5Buid%5D&rid=mga
Biología Celular y Molecular. Lodish, H, Baltimore, D., Berk, A., Zipursky, S.L., Matsudaira, P. & Darnel,J. (2002). 4a ed. Editorial
Médica Panamericana SA, España. [Traducción de: Molecular Cell Biology. Lodish, H, Baltimore, D., Berk, A., Zipursky, S.L.,
Matsudaira, P. & Darnel, J. (1999). 4th ed. W.H. Freeman & Co. New York]
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?call=bv.View..ShowTOC&rid=mcb.TOC
Lehninger Principles of Biochemistry, Nelson, D.L. & Cox, M.M., 4th Ed (2005) Worth Publishers.
Biochemistry by Voet and Voet. (Wiley Publishers, 3rd Ed.),
http://bcs.wiley.com/he-bcs/Books?action=index&bcsId=1847&itemId=047119350X
Libros de consulta
Aquellos alumnos que una vez comprendidos los aspectos básicos de los temas discutidos deseen profundizar el conocimiento de los mismos pueden consultar los siguientes textos disponibles en la cátedra.


Genes VIII by Lewin (Pearson Prentice Hall, 2004.
Molecular Biology of the Gene, 5th edition (2005) by Watson et al. Capítulo 8
Clase 1
1.
Para estudiar la replicación del DNA cromosomal en Escherichia coli se creció un cultivo en un medio que contenía: 49
mM Na2HPO4, 22 mM KH2PO4, 50 mM NaCl, 10 mM glucosa, 1mM MgSO4 y 0,003 mM FeCl3, al cual se le añadió,
como fuente de nitrógeno, 100 mg por litro de 15NH4Cl. Al cabo de 14 horas de crecimiento con agitación a 37 oC (suficiente como para que transcurran 14 generaciones), se agregó al medio 1 g por litro de 14NH4Cl, y se dejó crecer durante otras 4 a 8 horas. A lo largo de todo este proceso se siguió el crecimiento mediante recuentos de células viables
y recuentos al microscopio (Figura 1).
1
Figura 1
Figura 3
Como controles, dos cultivos se incubaron en las
mismas condiciones, pero con 15NH4Cl durante todo
el proceso o con 14NH4Cl durante todo el proceso. Estos controles fueron cosechados por centrifugación,
lisados con SDS, mezclados y sometidos a una centrifugación de densidad en CsCl, en una ultracentrífuga analítica durante 20 horas a 140.000 xg. Al cabo
de la centrifugación, se fotografió la distribución del
material en el tubo de centrífuga (Figura 2A: el tope
del tubo se encuentra a la izquierda y el fondo a la
derecha), y la cantidad de material observado se
cuantificó por densitometría (Figura 2B).
Alícuotas de los cultivos de la figura 1 se fueron
tomando a tiempos equivalentes a 0; 0,3; 0,7; 1,0;
1,1; 1,5; 1,9; 2,3; 3,0 y 4,1 generaciones transcurridas
después del agregado de 14NH4Cl. Las muestras se
introdujeron inmediatamente en baños de agua-hielo,
se centrifugaron en frío a 1.800 xg 5 minutos, se resuspendieron en una solución 10 mM NaCl y 10 mM
EDTA a pH=6,0, se lisaron con SDS y se sometieron
a centrifugación con CsCl en las mismas condiciones
que los controles de la Figura 2. También, al cabo de
la corrida los tubos fueron fotografiados y el material
que contenían cuantificado por densitometría (Figura
3).
Finalmente, se tomaron el DNA purificado de cada
uno de los controles de la Figura 2 y el correspondiente a 1 generación después del agregado de
14NH Cl, se los calentó a 100oC 30 minutos, se los
4
enfrió bruscamente y se los centrifugó en gradientes
de CsCl como se describió anteriormente. Los resultados obtenidos por densitometría se muestran en la
Figura 4 (A: DNA de 1 generación después del agregado de 14NH4Cl, B: pico de la izquierda, DNA del
control crecido en 14NH4Cl, pico de la derecha, DNA del control crecido en 15NH4Cl).
a) Explique cuál es el principio de separación del DNA empleado en estos experimentos, especificando los fenómenos
físicos y/o químicos que tienen lugar y sobre los cuales se
basan estos métodos.
b) Discuta los resultados mostrados en las Figuras 1 a 4, y
proponga en base a ellos un modelo para la replicación del
DNA en E. coli.
c) ¿Como serían los gradientes de ClCs en los otros modelos de replicación desechados?
2
3
2.
Se realizó un ensayo de incorporación de 3H-timidina a DNA de E. coli, según el siguiente protocolo:
tubo 1
Cultivo de E. coli (ml)
3H-timidina (10 mM, 6Ci/mol)(ml)
Medio de cultivo (ml)
ác. Nalidíxico (inhibidor de la girasa) (ml)
tubo 2
0.2
0.05
0.05
---
0.2
0.05
---0.05
Los tubos se incubaron durante 30 minutos; luego se precipitó el DNA total y se determinó la incorporación de marca radiactiva en el DNA obteniéndose 5210 y 260 cpm para los tubos 1 y 2 respectivamente (eficiencia 25%, fondo 10cpm).
a- Construya el protocolo para preparar 200 µl de una solución de 3H-timidina 10 mM, 6Ci/mol a partir de 3H-timidina 20
Ci/l, 0,1 mg/ml y timidina 0,1M. ¿Es conveniente utilizar directamente las soluciones anteriores para la preparación?
b- ¿Cuál debería ser la composición del medio de cultivo?
c- Describa las operaciones realizadas luego de los 30 min de incubación
d- Calcule los picomoles de timidina incorporados por minuto por el control.
e) Calcule el porcentaje de timidina (respecto al total disponible) incorporado por el control en el ensayo. ( PM : 242)
3. Se inoculan
con E. coli 10 ml de un medio mínimo conteniendo glucosa, sales y buffer fosfato 1mM. Luego del agregado de 0,01 ml de fosfato monosódico marcado con 32P (10Ci/μmol, 8.5 mCi/ml) se incuba el cultivo a 37 °C toda la
noche. A la mañana siguiente se diluye el total de dicho cultivo 100 veces en un medio de composición idéntica al anterior, excepto por la ausencia de fosfato, y luego de 2 hs, cuando las células se encuentran creciendo en forma exponencial, se le agrega timidina 3H, concentración final 10mM, 0,1 Ci/mmol y se toman muestras de 2 ml a tiempos 0, 10 y 20
minutos.
a) ¿Cuál será la actividad del fosfato en el DNA, expresada como mCi/mmol P. Cuál será la actividad específica del
DNA expresada como mCi/mmol DNA y mCi/ mmol nucleótido?
b) Si en la muestra de tiempo 0 se obtuvieron 2,2 x104 cpm de 32P por encima del blanco (eficiencia del contador
100%), ¿cuál será la masa total de DNA (un par de nucleótidos en el DNA tiene un PM promedio aproximado de
660)?
c) Verifique la validez de los resultados obtenidos en el inciso anterior, si el cultivo a tiempo cero contiene 10 8 bacterias/ml,
d) Si las cpm de tritio fueron 0, 2000, y 4000 por encima del blanco para las muestras a los distintos tiempos respectivamente, la eficiencia del contador 20%, el peso molecular de timina fuera 242 y su contribución a la masa de
DNA 15%, determine la velocidad de síntesis de DNA expresada en miligramos de DNA por minuto.
e) Verifique la validez del resultado en el inciso d) teniendo en cuenta el tiempo que tarda el cromosoma de E.coli en
replicarse.
Otros datos:1ci= 2.2 10 12dpm , tamaño del cromosoma de E. coli: 4x 10 6 , tiempo de replicación de E. coli : 4O min
Clase 2
4. a-Indique el número de orígenes de replicación que están presentes en las micrografías de la figura. Señale las regiones que han sufrido replicación ¿Es posible a partir de estos resultados indicar si la replicación es uni o bidireccional?. Justifique su respuesta.
3
b- Con el objetivo de determinar si la replicación es uni o bidireccional se realizaron los experimentos detallados en la figura empleando timidina con dos radiactividades específicas. Escoja el diagrama que mejor representa los resultados
que obtendría para una replicación bidireccional y para una unidireccional.
c- Luego de realizado el experimento de la Figura se obtuvo la micrografía
que se muestra a continuación. ¿Qué conclusiones obtiene a partir de la
misma?.
4
5
Se desea distinguir entre los modelos de replicación
representados en la figura para ello se cultiva una cepa de
E. coli infectada con el fago T4 (5x108 células/ml) en un
medio rico. Se agrega H3-timidina y se reduce la temperatura a 20 °C para disminuir la velocidad de replicación.
Como control se deja un cultivo a 37 °C. Luego de transcurrido el tiempo de marcado deseado, el cultivo se coloca en
hielo, se agrega KCN y se colectan las células por centrifugación. Se extrae el DNA , se desnaturaliza con NaOH
0.1M y se siembra en un gradiente de sacarosa. Luego de
la ultracentrifugación se obtienen los resultados mostrados
en la Figura 2.
1- Indique a que modelo de replicación corresponden los
resultados obtenidos.
2- Haga un gráfico que represente los resultados que obtendría si siembra el DNA no desnaturalizado en dicho gradiente. ¿Podría utilizar una electroforesis en geles de
agarosa en vez del gradiente?. Justifique
2- Explique detalladamente cómo haría para determinar el
destino de los intermediarios de menor velocidad de sedimentación que aparecen entre los 5-30 segundos.
5.
6. Se desea determinar el mecanismo de replicación
de un fago que infecta E. coli, cuyo genoma es un DNA de doble
cadena de 2000 pares de bases. Para ello, se propagaron los fagos en dos cultivos de E. coli cuya única fuente de nitrógeno era NH4 Cl (14N) en uno de los cultivos y NH4 Cl (15N) en el otro, Para separar las moléculas de distintas densidades
se emplearon gradientes de CsCl y gradientes de CsCl-NaOH. El DNA fágico se separó del cromosomal sin introducir
rupturas. La entrada del fago a la bacteria toma 2 min. (DNA desnudo) e inmediatamente comienza la replicación del DNA
que finaliza a los 30 min, empleándose para ello las enzimas bacterianas.
Experimento 1: Se mezcló un inóculo de fagos con un cultivo líquido de bacterias en NH 4Cl (14N) y a los 2 min se tomó una muestra de la mezcla. Se extrajo y purificó el DNA fágico y se determinó la concentración de ácido nucleico por absorbancia a 260 nm. A dos alícuotas de esta preparación de DNA se las trató con: a) una exonucleasa 3´-5´ y b) una
exonucleasa 5´- 3´. Posteriormente, se separaron los productos de degradación y se determinó la concentración de DNA. En
ambos casos, a) y b), la A260nm después del tratamiento fue aproximadamente la mitad de la A260nm inicial.
5
Experimento 2: En el mismo momento en que se tomó la muestra para el exp. 1, se agregó al cultivo NH 4Cl (15N), lo
que se consideró como tiempo cero para el experimento 2. Se tomaron alícuotas a los 15, 30 y 45 min y el DNA fágico se
separó en gradiente de CsCl con y sin NaOH. De las bandas obtenidas en los gradientes de densidad, se extrajo el DNA para linearizarlo y someterlo a electroforesis en geles de agarosa y para tratarlo con exonucleasas. La tabla indica los resultados obtenidos en todas las determinaciones.
a)
Basado en la información que le da el problema, esquematice claramente el mecanismo de replicación de
este fago justificando sus razonamientos
Bandas extraídas del
Gradiente de CsCl
Tiempo(min)
del gradiente de CsCl (NaOH)
Tamaño
(número de nucleótidos)
2000
1000
3000
2000
2000
4000
2000
3000
5000
Bandas
14N
15
15N
14N y15N
14N y15N
14N
30
15N
14N y15N
14N y15N
14N
45
15N
14N y15N
14N y15N
Sensibilidad a
exonucleasa
No
Sí
Sí
No
Sí
Sí
No
Sí
Sí
Se está estudiando el origen de replicación de una bacteria aislada recientemente de una fuente de aguas termales.
El genoma tiene un tamaño de aproximadamente 500.000 pares de bases. Se han realizado mapas de restricción, encontrándose 10 sitios para la enzima Bam HI, que dan 10 fragmentos de 30.000 a 50.000 pares de bases. A cada fragmento
se lo denominó con una letra de A a J.
a) Para determinar la ubicación de los fragmentos en el genoma bacteriano se utilizaron experimentos de conjugación
y la técnica de PCR, encontrándose que A-C-E-G-B-D-J-F-H-I es el orden en que se encuentran los mencionados fragmentos en el genoma.
b) Se realizaron experimentos para determinar la localización del o de los orígenes de replicación. Para ello se cultivaron las células en medio rico a 70 C durante 2 horas, y luego se pasaron a un medio mínimo a la misma temperatura
(tiempo cero, t=0), donde se conoce que la replicación del genoma toma 25 min. Se tomaron muestras cada 5 min, se
extrajo el DNA genómico, y se lo repartió en 10 alícuotas. Cada una de las alícuotas fue hibridada con sondas correspondientes a cada fragmento BamHI, las cuales se marcaron con 32P de manera de alcanzar igual actividad específica.
Los resultados se expresan en forma de histograma, donde se grafica la actividad retenida por cada híbrido versus el
fragmento usado como sonda. Los histogramas a los distintos tiempos se muestran a continuación.
7.
1
c) Interprete los resultados obtenidos en el histograma:
2
i) cuántos orígenes de replicación tiene esta bacteria?
2
5 min
ii) dónde están ubicados?
10 min 1
iii) diga si el/los sitios es/son uni- o bidireccionales
iv) cómo deberían dar los histogramas si se tratara de E. coli ? Suponga la misma ubicación y tamaño de los fragmentos.
2
1
15 min
A
6
B
C
D
E
F
G
H
I
J
7
Clase 3
8. En este trabajo se busca caracterizar un mutante de la DNA polimerasa I de E. coli, cuya actividad polimerizante es
normal. Para ello a
sendos cultivos de
la cepa mutante y
de la cepa salvaje
se les da un pulso
de timidina marcada con 3H durante
tiempos cortos. La
reacción se detiene
mediante el agregado de etanol
75% y luego de
centrifugar, el pellet se resuspende
en NaOH 0,2 M,
EDTA 10mM. Este
producto se analiza
mediante un gradiente alcalino de
sacarosa y los resultados se muestran en las figuras.
Las fracciones utilizadas corresponden a tamaños
que excluyen a la hebra continua.
Para ambas cepas se realizaron experimentos a la temperatura permisiva (30 oC) y a la temperatura restrictiva (43 oC).
a).Escriba con fórmulas la reacción de polimerización catalizada por la DNA Pol I, ¿qué otras acitividades cataliza?
b). Sobre la base de los resultados mostrados en las figuras, cuál cree que sería el defecto de este mutante? Explíquelo.
Dibuje las curvas que esperaría obtener a la temperatura permisiva para ambas cepas.
c) Para comprobar sus hipótesis, Ud decide purificar la enzima de la cepa mutante y realizar ensayos “in vitro” para medir
las distintas actividades de la polimerasa. Explique qué sustratos usaría en cada caso para medir independientemente dichas actividades.
9. Se estudió la actividad de las DNA polimerasas  y 
en la replicación del DNA del virus eucariota SV40. Para ello
estas enzimas se incubaron in vitro con DNA, dCTP, dGTP, dTTP cada uno en concentración 20 M, cofactores, otras
enzimas necesarias para la replicación y [ -32P] dATP en
presencia o en ausencia de butilfenil dGTP (BuPdGTP) o
afidicolina. La actividad enzimática se midió por incorporación de marca en DNA, y se expresó como Ci (precipitables con ácido tricloroacético) incorporados por minuto.
Por medio del mismo sistema de reacción, se aislaron intermediarios de la replicación, obtenidos durante incubaciones de 2 minutos en presencia de BuPdGTP y/o
afidicolina, con ambas enzimas. A dichos fragmentos se los
separó por electroforesis en geles de poliacrilamida con
urea 8 M y se observaron sus tamaños por autorradiografía (Figura 1).
a) Cual es la función del BuPdGTP y de la afidicolina?
7
b) ¿A qué tipos de intermediarios de la replicación corresponden cada uno de los grupos de pesos moleculares que se
observan en la Figura 1?
En otro ensayo, se incubaron las mezclas de reacción (con ambas enzimas y BuPdGTP o afidicolina) durante distintos
tiempos en presencia de [ -32P] UTP y con los cuatro dNTPs sin marca. Se separaron los productos por electroforesis y
autorradiografía en las mismas condiciones del ensayo anterior (Figura 2a). Los productos contenidos en las bandas mayoritarias (las que contenían más material) se digirieron exhaustivamente con DNAsa y se sometieron a una nueva electroforesis (Figura 2b).
c) ¿En qué región de los ácidos nucleicos nuevos se encuentra la marca que se observa en la Figura 2a? ¿Qué tipos
de intermediarios representa cada región de pesos moleculares en la Figura 2a? ¿Puede corroborar estos resultados con
los de la Figura 2b?
d). En base a los resultados discutidos en este problema ¿qué rol asignaría a las polimerasas  y  en la replicación
del DNA del virus eucariota SV40?
8
9
10. La replicación del cromosoma de E.coli
se inicia en el oriC y procede bidireccionalmente. Las horquillas opuestas se
encuentran en la región de terminación a unos 180º del oriC. Se requiere una precisa y completa terminación para la decatenación de los cromosomas hijos topológicamente unidos y para la posterior partición en las células hijas.
Se ha demostrado que la región de terminación (secuencias Ter) interviene en la detención de la progresión de la horquilla de replicación mediante la unión de la
proteína Tus. La región
de terminación actúa,
como una trampa de la
horquilla, permitiéndole
que entre pero no que
salga. Sin embargo, la
terminación
mediada
por Tus no es requerida
para la viabilidad de
E.coli ya que Tus puede
ser delecionada sin
afectar el crecimiento.
El propósito de los siguientes experimentos
es determinar el rol de
este mecanismo de detención (Tus-Ter) del
progreso de la replicación en E.coli
Para realizar este estudio se construyeron 4
plásmidos que poseen
clonados dos secuencias TerB y el oriC , pero difieren en la
orientación relativa del
oriC y de las TerB (Figura 1)
Dado que el interés
de este estudio es la
terminación de la replicación bidireccional lo primero en analizar es si estas construcciones se replican bidireccionalmente y si utilizan el
oriC para iniciar la replicación en las condiciones del ensayo. Para ello se preparó una mezcla de replicación que consistió en:
10 mM AcMg
a) ¿Para que?.
 2 mM ATP, 0.4 mMGTP,
b)- ¿Para qué?, porqué se agrega más ATP que de los otros nucleótidos?
0.4 mM CTP, 0.4 mM UTP.
 40 uM dATP, dGTP, dCTP y dTTP
 DNA molde (I-535 y II-535, cada construcción plasmídica por separado)
 300 nM DnaA, 30 nM DnaB, 80 nM DnaC, 80 nM DnaG, DNA pol III, SSB, DNA girasa, c) ¿que función cumplen?
La mezcla de reacción se prepara en frío y se preincuba a 30ºC durante 2 min en presencia de Tus.
Se comienza la reacción por el agregado de DnaA
d) ¿porqué, cuál es su función?
La reacción se detiene por el agregado de EDTA.
e) ¿porqué?
9
.
Para cada molde, la resII-535
I-535
pectiva mezcla de repliExp. 1
Exp 2
Exp. 1
Exp 2
cación se dividió en 3
alícuotas, dos de las cuales fueron utilizadas para
una posterior digestión
con las enzimas de restricción indicadas.
f) A partir del esquema de
los plásmidos I-535 y II535 indique el o los productos de la replicación
que se observan en las
calles 1 y 4 de la Figura 2
(tenga en cuenta los tamaños moleculares de las
Los tamaños que se indican corresponden al marcador de peso molecular
Figura 2: En el experimento 1 los productos de la mezcla de repl icación
bandas que se observan
utilizado.
en la electroforesis). ¿Qué se digirieron con la enzima NruI (calles 2) y ScaI (calle 3).
le permite decir el patrón de En el experimento 2 se digirió con las enzimas NdeI (calles 5) y St I (calles 6). Las calles
digestión obtenido, es decir, 1 y 4 para ambos moldes corresponden a los productos de replicación sin digerir. Los
para qué se realiza este tra- productos se separaron mediante electroforesis en agarosa alcalina
tamiento?
g) ¿Puede concluir que la replicación es bidireccional y que comienza a partir del oriC? Justifique su respuesta en función de los resultados mostrados
En ausencia de la proteína Tus y con el agregado de DNApol I, RNAsa H y DNA ligasa, la síntesis de ADN continúa
durante 60 min, con una incorporación de deoxinucleótidos que es un exceso considerable al molde agregado. Por el contrario con el agregado de la proteína Tus se alcanza una meseta a los 15 minutos con un valor que representa el 30% del
molde agregado.
h) ¿Qué le sugiere este resultado en cuanto a lo que sucede en ausencia de la proteína Tus?
Los posibles mecanismos de terminación utilizando los sitios Ter se indican en la Figura 3.
El modo de terminación de la replicación bidireccional desde el
oriC se examinó analizando los productos de ADN nacientes formados
a partir de los moldes en presencia y ausencia de Tus. El resultado de
la electroforesis desnaturalizante se muestra en la figura 4.
i).¿Cómo se generan cadenas adelantadas de ese tamaño?
j). Entonces, ¿Cuál de los mecanismos es el que se está poniendo en
juego para cada molde? (tenga en cuenta las intensidades relativas
de las bandas observadas)
Clase 4
10
11
11.Los siguientes estudios se han realizado con el objeto de entender la regulación de la replicación, su relación con la
Radioactividad (cpm x 10-3)
síntesis de proteína y con la división celular .
a ) Se aisló un mutante letal condicional de replicación sensible a la temperatura (tienen mutado un aa de una proteína implicada en la replicación, donde esta proteína
mutada es funcional en condiciones permisivas pero deja
de serlo en condiciones restrictivas)
La velocidad de síntesis de DNA se estudió mediante
la incorporación de 3H timina. A distintos tiempos alícuotas de 1 ml se precipitan con TCA al 10%, para luego
contar las cpm en contador de centelleo. La Fig. 1
muestra los resultados correspondientes a la síntesis de
DNA a 30º C, temperatura permisiva, y su posterior pasaje a 42 C, la temperatura restrictiva
i) Discuta los resultados de la figura 1, explique la
forma de la curva al pasar a 42ºC.
ii) Qué etapa de la replicación cree Ud que está afectada?.
tiempo (min)
Figura 1
b) Se tiene un auxótrofo de Trp creciendo en un medio rico, al que se lo coloca en un medio sin el nutriente durante un tiempo para posteriormente restituírselo. Con este
protocolo, la Figura 2 muestra el comportamiento de distintas funciones celulares y la figura 3 mide el nivel de replicación
de oriC y terC para este auxótrofo medido por hibridación con las respectivas sondas radioactivas correspondientes a
esas regiones del genoma (considere 2 sitios terC por genoma).
i).¿A qué tiempo se tiene el cultivo sincronizado?
ii) ¿Cómo explica la forma de las curvas de las figuras 2 y 3. ¿Qué etapa de la replicación se ve afectada cuando se
detiene la síntesis de proteínas?
12. Se tienen dos cultivos bacterianos A y B creciendo a 37oC. Uno de ellos está en medio mínimo y el otro en medio
rico. El inóculo inicial (número de bacterias) fue el mismo para ambos. Se toman alícuotas a distintos tiempos y se hacen
plaqueos con el fin de conocer número de bacterias. El momento en que se realiza la siembra se considera tiempo 0. La
tabla muestra los datos obtenidos para cada cultivo.
a)
Calcule el tiempo de división celular en cada cultivo.
b) Diga en qué tipo de medio (mínimo o rico) se utilizó en los cultivos A y B.
c)
Sabiendo que el tiempo de replicación del DNA bacteriano es de 40 min., calcule (y explique cómo lo hace) el número mínimo de copias de un gen ubicado en el origen de replicación, a los 10 y a los 25 min de iniciado el ciclo de división celular
13.
Se dispone de un DNA de doble cadena lineal de 3650 pares de bases (bp) y se quiere amplificar una región de
1000 bp mediante el uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Con este fin, además del molde, se añaden
11
los oligonucleótidos o primers adecuados, una DNA polimerasa termorresistente (Taq DNApol) y el resto de los componentes necesarios para la reacción de manera de completar un volumen final de 25µL. Se emplean las siguientes condiciones de ciclado:
1) 92ºC durante 15 seg
2) 56ºC durante 15 seg.
3) 72º C durante 30 seg.
a) Escriba al lado de cada uno de los pasos anteriores, qué proceso ocurre.
b) Para completar la reacción de PCR, esta secuencia de variaciones de temperatura se repite 30 veces. Suponga que
a la enzima Taq polimerasa le lleva 1 segundo encontrar un primer unido al molde de DNA monocatenario, pero tarda
tan sólo 1 milisegundo en añadir una base. Si esta enzima tiene una procesividad de 10 bp, ¿será capaz de amplificar
DNA en las condiciones de ciclado mencionadas anteriormente?
c) ¿Qué sucedería si la Taq polimerasa tuviera una procesividad de 100 bp? Justifique sus respuestas de los items b y
c con cálculos.
d.) ¿Cuántos ng del fragmento de 1000 bp se obtendrían luego de 30 ciclos partiendo de 0,4 pg de molde (peso molecular promedio de un nucleótido 330)
e) Se quiere usar este fragmento de 1000 bp como sonda radiactiva para lo cual se realiza la PCR empleando las mismas condiciones de ciclado anteriores, la misma cantidad de DNA molde en un volumen final de 100 μL adicionando
2 μL [α-32P] dTTP (3000Ci/mol; 1.5mM); 1μL dTTP 0,50 mM sin marcar y 1 μL de soluciones 2.5 mM de cada uno de
los restantes nucleótidos (dATP, dCTP y dGTP). ¿Cuál es la actividad específica de la sonda? Considere que el
fragmento posee un 25% de cada dNTP. (1 Ci = 3.7 1010 desintegraciones/seg)
12