identificacion de haplotipos en la regin mitocondrial d-loop

Análisis de la región mitocondrial D-loop, en una población de ganado de
lidia seleccionada con base a su pedigrí
Resumen
La identificación de polimorfismos en la secuencia del ADN mitocondrial tiene aplicaciones
importantes en el estudio a nivel genético molecular de especies animales domésticas. Para
estos estudios, la región de control del ADNmt heredada maternalmente, conocida como D-loop
es de particular interés. El presente estudio tiene como objetivo, identificar mediante de análisis
PCR-RFLPs haplotipos de la región mitocondrial D-loop en dos poblaciones de ganado de lidia.
Se obtuvieron muestras de folículo de pelo de animales provenientes de dos ganaderías
mexicanas de toro de lidia [Los Encinos (ENC, n= 22) y Montecristo (MC, n= 37)]. Se amplificó
una región de aproximadamente 900pb de la región mitocondrial D-loop. Para analizar la
variabilidad haplotipica de la región amplificada, se digirieron cada uno de los productos de
amplificación con la enzima Hae III. Se identificaron en el total de la población analizada (n=37)
cinco haplotipos (H1-H5), mostrando las siguientes frecuencias H1= 54.23%, H5= 25.42%, H3=
10.16%, H4 y H2= 5.08% basados en los patrones de restricción con la enzima Hae III.
Introducción.
La fiesta de toros es un espectáculo antiguo en el mundo, sin que a la fecha se precise donde
surgió. (Castillo, 2002). En México, la lidia de bovinos bravos es una tradición heredada por los
españoles. Al igual que las razas de bovinos especializadas en producir leche o carne, al bovino
de lidia se le considera una raza especializada, que tiene como objetivo de crianza, el buen
desempeño en la lidia (Domínguez, 2005). La ganadería de lidia tiene gran importancia
económica, ya que la fiesta brava está ligada con diferentes actividades, las cuales, generaron
en el 2007 aproximadamente 700 millones de pesos en México (Gobierno del estado de
Aguascalientes, México, 2007). La ganadería de lidia se ha desarrollado en condiciones de
pastoreo en agostadero, con el mínimo de manejo y evitando el contacto con el hombre
(Lanfranchi, 1992; Castillo, 2002). Lo anterior implica que este recurso genético puede poseer
genes únicos para características de adaptación y rusticidad, mismos que potencialmente se
pueden utilizar en un futuro para complementar la composición genética de otras poblaciones de
bovinos (Crandall et al., 2000; Domínguez, 2008). Esta raza tiene algunas peculiaridades en su
población, lo que la hace merecer análisis genéticos separados: en primer lugar; de las especies
bovinas es la única seleccionada en base a sus características de comportamiento,
caracterizada por el aislamiento del resto de las razas bovinas domesticas, y en segundo lugar,
el termino racial Lidia hace referencia a la agrupación de bovinos nativos de la Península Ibérica,
que sobrevivieron exclusivamente en los ecosistemas forestales del Mediterráneo (Silva et al.,
2002; 2006). La raza de Lidia ocupa una zona de adaptación diferente a la de cualquier otra raza
en su área de distribución, y evoluciona por separado de las razas fuera de su área de
distribución. Aunque existe un modelo deseable de agresividad en toda la raza, su
comportamiento se determina por el tipo de evento al cual será dirigido el animal. Esas
necesidades en la variación del comportamiento han sido una de las principales razones por las
que este grupo racial se ha dividido en pequeños linajes tradicionalmente llamados encastes,
con diferentes niveles de flujo génico entre sí, favoreciendo en cada uno de ellos diferentes
características de comportamiento (Boletín Oficial del Estado, 2001), algunos de los encastes
más aislados, con un bajo número de animales contribuyen a la conservación genética, pudiendo
tener una variación genética baja y por lo tanto una depresión consanguínea, mientras que otros
encastes pueden originarse de la mezcla de encastes ancestrales (Cañon et al., 2008).
Existen antecedentes de que la ganadería de lidia más antigua del mundo, que aún está en pie,
es la de Aténco, ubicada en el estado de México, y data del año de 1522. Existen registros de
ganaderías españolas que enviaron toros y vacas a México desde finales del siglo XIX hasta
mediados del siglo XX y actualmente se considera que la base de la ganadería de lidia en
México se sustenta en seis ganaderías, siendo estas, los pilares del toro bravo mexicano de la
actualidad (Castillo, 2002). Un aspecto importante que sin duda daría mayor certeza a los
registros genealógicos actuales es el utilizar las herramientas moleculares para definir las
relaciones filiales de las poblaciones actuales con los encastes fundadores de las ganaderías de
lidia. La identificación de polimorfismos en la secuencia del ADN mitocondrial tiene aplicaciones
importantes en el estudio a nivel genético molecular de especies de animales domésticos. Para
estos estudios, la región de control haploide de ADNmt heredada maternalmente, conocida como
D-loop es de particular interés, ya que a diferencia de las regiones que codifican para genes,
tiene un alto nivel de variabilidad en la secuencia, esto aunado a la falta de recombinación da
como resultado una herramienta altamente informativa para el estudio de las relaciones entre
especies y entre individuos (Aquadro & Greenberg, 1983; Bowling et al., 2000).
Objetivo. Evaluar la diversidad genética de la línea materna de ganado de lidia y determinar las
relaciones filiales entre las diferentes castas establecidas con base a su pedigrí.
Materiales y Métodos.
De acuerdo a la existencia de registros genealógicos y fenotípicos (evaluaciones genéticas), se
seleccionaron las poblaciones de estudio, de un banco de pelo obtenido en el año 2007, e
incluyeron muestras de las ganaderías Los Encinos (ENC, 22 individuos); ubicada en el
municipio de Pedro Escobedo en el estado de Querétaro y Ganadería Montecristo (MC, n= 37
individuos); ubicada en el municipio de Hueyotlipan en el estado de Tlaxcala.
En la Figura 1 se muestran los encastes y familias de las muestras analizadas.
Para la extracción y purificación del ADN genómico, se utilizó la técnica estandarizada y descrita
en el protocolo del estuche comercial Genelute Mammalian Genomic DNA Cat. G1N350, la
revisión de integridad y cuantificación de los ácidos nucleicos se llevó acabó en gel de agarosa al
1.5%, utilizando el programa computacional Gel-Imagen de Kodak 1 Digital Science (Kodack
Company, 1995-1999), respectivamente, una vez obtenidos los patrones electroforéticos se
calculó la concentración de ADN de cada una de las muestras mediante dicho programa, y se
formaron alícuotas de trabajo a una concentración de 50ng/µl en un volumen final de 50 µl.
Se realizó la amplificación de un fragmento de aproximadamente 900 pb de la región D-loop,
utilizando los iniciadores UbovD-loop5´-AAT CCC AAT AAC TCA ACA C-3´ DbovD-loop 5´- GAA
AAT GCC TAG ATG AG-3´ previamente reportados por Pfeiffer et al., (2005), bajo las
condiciones indicadas en el Cuadro 1.
ANIMAL Familia Encaste MONTECRISTO (MC) MC48 MC56 MC80 MC66 MC60 MC79 MC59 MC61 MC62 MC53 MC74 MC58 MC63 MC67 MC75 MC70 MC43 MC82 246 LOS ENCINOS (E) E121 E115 E337 E309 E324 E275 E195 E151 MC20 MC23 MC46 MC42 MC73 MC35 MC17 MC65 MC52 MC45 MC50 MC68 MC72 MC78 MC54 MC47 MC69 MC76 MC64 E347 E294 E269 E322 E135 E375 E312 E272 E368 E377 E250 E293 E111 Serenata Pardita Bordadora Espejera Serenata Mexicana Pardito Andaluza picadora cominita castañuela cumplida Pardita Fantasía Giralda guantera Calera o Caleña Indiana Guantera Princesita Lebrijana Perlita Perlita Gandinguera Ventiladora Fundadora cumplida Andaluza Colorina Culebrilla Andaluza Azucarera Española Ventilador Ventilador Rastrojera Cominita Veladora Veladora Cominita Cubetera Nenita Platerita Andaluza pata Princesita Sombrerera Cocinera San Mateo Santa Coloma Los Encinos, Los Encinos San Mateo San Mateo Joaquín Buendía Santa Coloma San Mateo San Mateo San Mateo San Mateo San Mateo Los Encinos, Los Encinos Los camino Los Camino Figura 1.‐ Se muestran las familias y/o encastes registrados para los individuos incluidos en el estudio. Cuadro 1.- Mezcla para la amplificación de la región D-loop.
Stock
ADN
Buffer 5X
MgCl2 25Mm
Iniciador 5´ (5µm)
Iniciador 3´ (5µm)
dNTPs (10mM)
Go Taq (5U/µl)
H2O
Vol. Final
Programa de
amplificación para PCR
Concentración
final
100 ng/µl
1X
2mM
0.1µm
0.1µm
0.2µm
1U
CBP
25µl
TD55*
*Programa de amplificación incluido en el método Touchdown (Hecker y Roux, 1996; McPherson y Møller, 2000).
Para el análisis del polimorfismo, primeramente se realizó un ensayo in silico utilizando el
programa NEBcutter V2.0 (Vincze et al., 2003), para determinar la/s enzima/s de restricción de
alta frecuencia de corte a usar en la región de ADNmt reportada. La enzima seleccionada fue
Hae III y con esta se digirieron los productos de PCR bajo las condiciones que se indican en el
Cuadro 2.
Cuadro 2.- Condiciones para la digestión de la enzima Hae III.
Stock
Producto PCR
Buffer de enzima
H2OmiliQ
Vol. final
Temperatura de digestion
Concentración final
5 µl
10x
10U/µl
10 µl
37ºC/por toda la noche
El análisis de los patrones de RFLP se realizó en geles de acrilamida bisacrilamida al 15%, en
cámara de electroforesis vertical, los patrones de corte fueron visualizados a través de un
transluminador ColeParmer, posteriormente se realizo una matriz binaria de presencia ausencia
de bandas de digestión a partir de la cual se determinaron los haplotipos de los animales
pertenecientes a cada ganadería. Utilizando el software TFPGA, se construyó un dendrograma
de distancia genética utilizando el método de UPGMA (Miller, 1997), a fin de conocer las
relaciones entre las diferentes familias de las cuales provienen los animales analizados.
Los productos de PCR obtenidos fueron también secuenciados utilizando el método de
terminadores y ek secuenciador de ADN ABI 3100. Las secuencias obtenidas fueron alineadas
utilizando el programa Clustal W.
Resultados y Discusión.
El análisis de PCR-RFLP permitió la asignación de cinco haplotipos en el total de las muestras
analizadas (Figura 2). De los 22 individuos analizados en la ganadería ENC, 12 individuos
mostraron el Haplotipo1 (H1: 400, 200, 100, 50, 30 pb), y 10 mostraron el H5 (H5: 400, 200, 100 y
30 pb). En la ganadería MC de los 37 individuos analizados, 20 individuos mostraron el H1 (H1:
400, 200, 100, 50 y 30 pb), 6 mostraron el H3 (H3: 400, 300, 100, 50 y 30 pb), el H5 (H5: 400, 200,
100, 30 pb) fue encontrado en 5 individuos, 3 mostraron el H4 (H4: 400, 200, 100, pb), y
finalmente 3 individuos portaban el H2 (H2: 400, 200, 100, 50 pb).
Figura 2.- Patrones de restricción de la región mitocondrial D-loop de ganado de lidia. Se muestran los patrones de
PCR-RFLP de nueve individuos de la ganadería MC, cada patrón fue identificado como haplotipo de acuerdo a la
presencia/ausencia de las bandas obtenidas en la población total analizada. M=marcador de peso molecular, H1-H4=
haplotipo.
En la figura 3, se puede apreciar que las familias de las ganaderías ENC y MC caen dentro de
dos grupos poblacionales (A y B, conteniendo el grupo B dos subgrupos B1 y B2), es decir, la
variabilidad poblacional encontrada en el grupo A está dada por el haplotipo H3, ya que en dicho
haplotipo se pueden identificar a individuos de MC, asumiendo por lo tanto que dicho grupo
puede compartir el mismo ancestro en común. Por su parte el grupo B está formado por dos
haplotipos H5 y H1 (contenidos en los subgrupos B1 y B2 respectivamente), estando formados B1
y B2 por individuos en su mayoría provenientes de MC, asumiendo que el grupo B comparte dos
líneas maternas en común, posiblemente debidas a la introducción de animales a ENC
originarios de MC. En el desarrollo histórico de la ganadería de lidia mexicana se ha reportado
que la genealogía de los animales fundadores de las ganaderías ENC y MC, se relacionan entre
sí a través de ganaderías fundadoras en común (Ganadería de: Gárfias y de San Martín)
(Lanfranchi, 1992; Castillo, 2002). Como se pudo observar, en la ganadería ENC se encontraron
dos haplotipos, y en MC se identificaron cinco, dichos resultados se pueden atribuir al número de
encastes fundadores de cada ganadería, siendo el caso de ENC en la que se cuenta con por lo
menos 17 diferentes familias, mientras que en MC los animales de estudio pertenecen a 25
diferentes familias.
Después del alineamiento de las secuencias obtenidas en las muestras de las dos ganaderías se
realizaron por ganadería dendrogramas de distancia genética utilizando el método de Neighbour
Joining, en las figuras 4 a y b se muestran los resultados de agrupamiento obtenidos.
Figura 3.- Dendrograma de distancias genéticas perteneciente a las ganaderías Encinos y Montecristo. Se muestra
las relaciones entre las diferentes familias de las cuales provienen los animales analizados.
Perspectivas. En las ganaderías ENC y MC se encontraron dos grandes grupos cuyas
diferencias se explican debido a que dentro del grupo A se encontró exclusivamente el H3 é
incluye solamente individuos de MC. El grupo B tiene dos líneas maternas compuestas por el H5
y H1 compartidas entre sí. El análisis PCR-RFLP implementado permite la identificación de
haplotipos entre y dentro de las poblaciones de ganado de lidia lo cual es un primer paso para
realizar estudios de variabilidad genética en las poblaciones mexicanas. Actualmente se
considera que la base de la ganadería de lidia en México se sustenta en seis ganaderías, siendo
estas, los pilares del toro bravo mexicano de la actualidad. Un aspecto importante que sin duda
daría mayor certeza a los registros genealógicos actuales es el utilizar las herramientas
moleculares para definir las relaciones filiales de las poblaciones actuales con los encastes
fundadores de las ganaderías de lidia.
Figura 4.- Se muestran los dendrogramas de distancia genética inferidos a partir de las secuencias nucleotidicas de
la región D-loop. En a) se muestran la población de los encinos y en b) la de Montecristi.
Referencias.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Aquadro C. F., Greenberg BD.1983. Human mitochondrial DNA variation and evolution:
analysis of nucleotide sequences from seven individuals. Genetics.103:287-312
Bowling A, Del Valle A, Bowling M. 2000. A pedigree-based study of mitochondrial D-loop
DNA sequence variation among Arabian horses. Animal Genetics 31:1-7.
Boletin Oficial del Estado (2001) Real Decreto 60/2001, de 26 de enero, sobre prototipo
racial de la raza bovina de lidia. Boletin Oficial del Estado 38, 5255–61.
Burrow H. M. 1993. The effects of inbreeding in beef cattle. Anim. Breed. Abstr. 65: 477-495.
Castillo G. E. 2002. Nuestro Toro. Editado por la Asociación Mexicana de Criadores de Toros
de Lidia. México, D.F.483 Pp.
Cañon J, Tupac-Yupanqui I, García-Atance M.A, Cortes O, García D, Fernández J. Dunner
S. 2008. Genetic variation within the Lidia bovine breed Animal Genetics, 39, 439–445
Crandall K. A, Bininda-Emonds O. R. P, Mace G.M, Wayne R.K. 2000. Considering
evolutionary processes in conservation biology. Trends in Ecology and Evolution 15, 290–5.
Domínguez V.J, Núñez D. R, Ramírez V. R. Ruiz F. A. 2005. Parámetros de poblaciones y
evaluaciones genéticas en ganaderías de lidia mexicanas. Memorias. In memoria VII
Congreso Mundial de Ganaderos de Toro de Lidia. Cáceres, España. Octubre 2005.
http://www.toroslidia.com/congreso2005
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
Domínguez V. J, Rodríguez A. F. A, Núñez D. R, Ramírez V. R, Ortega G. J. A. Ruiz F. A.
2008. Análisis del pedigrí y efectos de la consanguinidad en variables de comportamiento en
ganaderías de Lidia mexicanas. Archivos de Zootecnia (En revisión).
Falcao S, Filho M. R, Magnabosco U.C, Bozzi R, y Lima M. F. A 2001. Efeitos da endogamia
sobre características de reproducao, crescimento e valores genéticos aditivos de bovinos de
raca Pardo-Suíca. Rev. Bras. Zootec. 30: 83-92.
Gobierno del Estado de Aguascalientes, México. 2007. “La feria de San Marcos es una
importante venta para promover el desarrollo económico local”: SEDEC. Boletín No. 2506.
Dir. de Información y Prensa de comunicación Social de Aguascalientes. Aguascalientes
Ags.
Hecker K. H, Roux K. H. 1996. High and low annealing temperatures increase both specificity
and yield in touchdown and stepdown PCR. BioTechniques, 20:478-485.
Kodak Company. Kodak Digital Science 1D Image Analysis Software, Version 3.0 Windous
User`s Manual. (Eastman Kodak Company, New Haven, CT, USA), 1995-1999.
Lanfranchi H. 1992. Historia del Toro Bravo Mexicano. Asociación Nacional de Criadores de
Toros de Lidia. México, D. F. 401 p.
Miller M. P. 1997. Tools for population genetic analyses (TFPGA) 1.3: A window program for
the analysis of allozyme and molecular population genetic data. Computer software
distributed by author.
McPherson M, Møller S. 2000. PCR the basics from background to bench. Springer-Verlag
New Cork.
Núñez D. R, Castro G H. 1998. Bases para la evaluación de los recursos genéticos de la
ganadería de lidia en México. En: Memorias del tercer foro de análisis de los recursos
genéticos: ganadería ovina, caprina, porcina, avícola, apícola, equina y de lidia. México, D.
F., 27 y 28 de agosto de 1998. pp: 223-230.
18. Pfeiffer I, Voelkel I, Brenig B. 2005. Phylogenetics of the European Dahomey miniature cattle
based on mitochondrial D-loop region DNA sequence. Animal Genetics.36:179-181.
19. Ruíz-Flores A, Núñez-Domínguez R, Ramírez-Valverde R, Domínguez-Viveros J, Mendoza-
20.
21.
22.
23.
Domínguez M, Martínez-Cuevas E. 2006. Niveles y efectos de la consanguinidad en
variables de crecimiento y reproductivas en bovinos Tropicarne y Suizo. Agrociencia 40:
289–301.
Santa-Martina M. J. 2001. El toro de lidia: conservación de los recursos genéticos. Arch.
Zootec. 50: 35–40.
Silva B, Gonzalo A, Cañon J. 2002. Genetic parameters of behavioural traits in the bovine
(Bos taurus). Proceedings of the 7th World Congress on Genetics Applied to Livestock XXXII,
83–6.
Silva B, Gonzalo A, Cañon J. 2006. Genetic parameters of aggressiveness, ferocity and
mobility in the fighting bull breed. Animal Research 55, 65–70.
Vincze T, Posfai J, Roberts R. J. 2003. NEBcutter: a program to cleave DNA with restriction
enzymes Nucleic Acids Res. 31: 3688-3691.