Caracterización del perfil proteico de una cepa entomopatógena de
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Universidad de Granada Instituto de Biotecnología Trabajo de investigación tutelada para la obtención del título: “Máster en Biotecnología” Caracterización del perfil proteico de una cepa entomopatógena de Bacillus pumilus. Diana Carolina García Ramón Julio de 2011 Universidad de Granada Instituto de Biotecnología Trabajo de investigación tutelada para la obtención del título: “Máster en Biotecnología” Caracterización del perfil proteico de una cepa entomopatógena de Bacillus pumilus. Diana Carolina García Ramón Julio de 2011 Tutora: Dra. Susana Vílchez Tornero Profesora Contratada Doctor Departamento de Bioquímica Instituto de Biotecnología Universidad de Granada Co-Tutor: Dr. Antonio Osuna Carrillo de Albornoz Catedrático Universidad de Granada Departamento de Parasitología Universidad de Granada Parte de los resultados de este trabajo de investigación han sido presentados en el Congreso 13th European Meeting of the IOBC/WPRS Working Groups, mediante presentación oral, con el título: “Understanding the toxicity of Bacillus pumilus 15.1 toward the Mediterranean fruit fly (Ceratitis capitata)”. Lugar de celebración: Innsbruck Austria Fecha: 19-23 Junio 2011 AGRADECIMIENTOS Primero quiero agradecer a la SENESCYT-ECUADOR, por la concesión de mi beca y al auspicio de la Escuela Politécnica del Ejército (Ecuador) que han permitido la realización de mis estudios de postgrado en la Universidad de Granada. A mi tutora, Dra. Susana Vílchez Tornero un gracias sincero por haberme dado la oportunidad de realizar este trabajo de investigación, gracias por el tiempo dedicado a este proyecto y por la enseñanza y orientación brindada en la realización del mismo, sin ella, esto no hubiese sido posible. Así mismo tengo que agradecer a mi co-Tutor, Dr. Antonio Osuna, por sus consejos y apertura al trabajo que realizo. A los dos, mil gracias por creer en mí y permitirme ser parte de este grupo de investigación. A mis compañeros de laboratorio, en especial a esas personas que han sabido darme su apoyo cuando lo he necesitado, gracias por brindarme su mano amiga y hacer que mi estancia aquí sea más fácil. Quiero nombrar a mi grupo de trabajo: Alfonso, Juanfran, Tania y Alejandra, gracias por compartir este proyecto, por su ayuda y sus consejos. Las gracias mayores se las debo a mis padres, Nancy y Pepe, no tengo palabras para decirles lo agradecida que estoy por brindarme todo su amor, por apoyar mis decisiones (aunque eso nos cueste la distancia) y por sacrificar tantas cosas por mí. Gracias papitos por enseñarme a luchar por lo que quiero. A mis hermanas Gaby y Josesita y mis sobrinas Paulita y Samy, por su amor, su apoyo y su confianza. Gracias familia por ser el eje de mi vida, por darme las fuerzas que necesito cuando he sentido flaquear y por su apoyo constante a pesar de la distancia. Porque los siento a mi lado todos los días… Un gracias especial a Víctor, por tener siempre las palabras adecuadas, por no soltar mi mano y caminar junto a mí. Las cosas a tu lado son más fáciles. Gracias totales a MI GENTE por estar siempre conmigo. Diana i ÍNDICE AGRADECIMIENTOS .......................................................................................................... I ÍNDICE ..................................................................................................................................V RESUMEN ............................................................................................................................. 1 ABREVIATURAS ................................................................................................................. 5 1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................................ 9 1.1 Microorganismos entomopatógenos ............................................................................. 11 1.2 Bacterias entomopatógenas .......................................................................................... 13 1.2.1 El género Bacillus ................................................................................................ 14 1.2.2 Bacillus thuringiensis ........................................................................................... 15 1.2.2.1 Factores de Virulencia: Toxinas Cry y Cyt .................................................... 17 1.2.2.2 Otros factores de virulencia ........................................................................... 19 1.2.2.3 Aplicaciones biotecnológicas ........................................................................ 21 1.3 Bacillus pumilus .......................................................................................................... 22 1.3.1 Biología ............................................................................................................... 22 1.3.2 Aplicaciones Biotecnológicas ............................................................................... 24 1.3.2.1 Producción de Enzimas ................................................................................. 24 1.3.2.2 Producción de Antibióticos ........................................................................... 26 1.3.2.3 Control Biológico ......................................................................................... 27 1.3.2.3.1 Control de Hongos y Bacterias en plantas .............................................. 27 1.3.2.3.2 Control de Insectos ................................................................................ 30 1.3.2.4 Otras Aplicaciones ........................................................................................ 32 1.4 Bacillus pumilus 15.1................................................................................................... 32 2. OBJETIVOS................................................................................................................... 37 3. MATERIALES Y MÉTODOS ....................................................................................... 43 3.1 Condiciones de cultivo de cepas bacterianas ................................................................. 45 3.1.1 Cepas bacterianas y su conservación ..................................................................... 45 3.1.2 Medios de cultivo ................................................................................................. 46 3.1.2.1 Medio rico .................................................................................................... 46 3.1.2.2 Medio de esporulación .................................................................................. 46 3.1.3 Condiciones de cultivo ......................................................................................... 47 3.2 Análisis de proteínas.................................................................................................... 47 3.2.1 Tratamiento de muestras proteicas ........................................................................ 47 3.2.2 Electroforesis de proteínas. SDS-PAGE ................................................................ 49 3.2.3 Separación de Proteínas mediante Gradiente de Sacarosa ...................................... 50 3.2.4 Microscopía ......................................................................................................... 51 3.2.4.1 Microscopía óptica....................................................................................... 51 3.2.4.2 Microscopía electrónica de transmisión ......................................................... 52 3.2.5 Inmunoblots ......................................................................................................... 52 3.2.6 Solubilización de Proteínas ................................................................................... 54 3.2.7 Análisis e identificación de proteínas por MALDI-TOF......................................... 56 3.2.8 Bioensayos con C. capitata .................................................................................. 56 3.2.8.1 Mantenimiento de la Colonia de moscas de la fruta del Mediterráneo ............. 56 3.2.8.2 Bioensayos con larvas ................................................................................... 58 4. RESULTADOS ............................................................................................................... 63 4.1 Perfil proteico de la cepa B. pumilus 15.1 ..................................................................... 65 4.1.1 Perfil proteico de un cultivo vegetativo ................................................................. 66 4.1.2 Perfil proteico de un cultivo esporulado ................................................................ 67 4.2 Separación de proteínas mediante Gradientes de Sacarosa............................................. 70 4.3 Observación de B. pumilus 15.1 mediante microscopía ................................................. 79 4.4 Análisis de las fracciones de un cultivo de B. pumilus 15.1 mediante Inmunoblot .......... 85 4.5 Solubilización de proteínas........................................................................................... 88 4.6 Identificación de proteínas mediante análisis de huella peptídica o finger printing. ........ 92 4.7 Actividad de las proteínas aisladas en los gradientes de sacarosa frente larvas de C. capitata ............................................................................................................................. 95 5. DISCUSIÓN .................................................................................................................... 99 6. CONCLUSIONES ........................................................................................................ 109 7. TRABAJO FUTURO .................................................................................................... 115 8. BIBLIOGRAFÍA .......................................................................................................... 121 ANEXOS ............................................................................................................................ 141 Análisis e identificación de proteínas por MALDI-TOF.................................................... 143 Proteína de 37 kDa ...................................................................................................... 143 Proteína de 17 kDa ...................................................................................................... 144 Proteína de 45 kDa ...................................................................................................... 145 Proteína de 60 kDa ...................................................................................................... 146 Proteína de 250 kDa .................................................................................................... 147 RESUMEN Nuestro grupo de investigación ha descrito el aislamiento de la cepa Bacillus pumilus 15.1 como una cepa entomopatógena, activa frente a larvas de la mosca de la fruta del Mediterráneo (Ceratitis capitata). No se conoce el factor o factores de virulencia de esta cepa, pero la evidencia de nuestro grupo sugiere que probablemente sea de origen proteico. Aquí radica el interés de caracterizar el perfil proteico de la cepa. En este trabajo se presentan el perfil proteico de la cepa B. pumilus 15.1, tanto en fase vegetativa como en fase de esporulación bajo condiciones de cultivo donde la cepa ha mostrado actividad frente a larvas de C. capitata. Además se realizó la comparación del perfil proteico de la cepa silvestre con una cepa curada de plásmidos y con una cepa control M1 de la misma especie. El perfil proteico de la cepa no mostró diferencias significativas cuando el cultivo fue sometido al tratamiento con frio durante 96 horas a 4 ºC con respecto a los cultivos sin tratamiento, ni tampoco entre la cepa silvestre y la curada de plásmidos. La técnica de gradiente de sacarosa permitió separar proteínas insolubles excretadas durante la fase de esporulación de la cepa. Las proteínas mayoritarias fueron analizadas mediante técnica de huella peptídica y MS-MS y dos de ellas (17 kDa y 45 kDa) bioensayadas de manera individual frente a larvas de C. capitata. Los resultados de los bioensayos indicaron que las proteínas no son tóxicas en las condiciones ensayadas en este trabajo. No hemos relacionado ninguna de las proteínas mayoritarias como responsables de la muerte de las larvas de C. capitata. 1 2 3 4 ABREVIATURAS (p/p) Relación peso/peso (p/v) Relación peso/volumen (v/v) Relación volumen/volumen ~ aproximado °C Grados Celcius µg Micro gramos µL Micro litros µm Micro metro 16S Molécula de ARNr de la subunidad menor del ribosoma de procariotas ADN Acido desoxirribonucleico APS Persulfato amónico ARN Acido ribonucleico ARNr ARN ribosómico ATP Adenosín trifosfato Bt. Bacillus thuringiensis cm Centímetro Cry Proteína formadora de cristal, del inglés Crystal protein Cyt Proteína citolítica, del inglés Cytolitic protein Da Daltons DNAsa Desoxirribonucleasa DTT Ditriotreitol EDTA Ácido Etilendiaminotetraacetico g Gramos H2O2 Peróxido de hidrógeno HCl Ácido clorhídrico K2MnO4 Manganato de potasio kb Kilo bases 5 kDa Kilo Daltons L Litro M Concentración molar mA Mili amperios mg Mili gramos mL Mili litros mm Mili metros mM Mili Molar MS - MS Método de fragmentación de péptidos en espectrometría de masas PBS Tampón Fosfato salino pH Potencial de Hidrógeno PMSF Fluoruro de fenilmetilsulfonilo ARNasa Ribonucleasa rpm Revoluciones por minuto SDS Dodecil sulfato sódico SDS-PAGE Electroforesis en gel de poliacrilamida con Dodecilsultafo sódico TEMED N, N, N’, N’-tetrametiletilenodiamina UFC Unidades formadoras de colonias V Voltios Vh Voltaje de hall W Watt o Vatio xg Fuerza relativa de centrifugación, del inglés Relative Centrifugal Force (RCF) 6 7 8 1. INTRODUCCIÓN 9 10 Introducción 1.1 Microorganismos entomopatógenos Los insectos son el grupo más diverso de animales sobre la tierra, con más de un millón de especies descritas, y cuya diversidad y adaptación a los ambientes los han convertido en hospederos o fuente de alimento de muchos parásitos (Bode 2009). Los microorganismos entomopatógenos son microorganismos parasíticos que causan la muerte al insecto huésped y posteriormente son dispersados por el agua, viento u otros insectos (NichollsEstrada 2008). Representan una alternativa sostenible de control a largo plazo comparados con los productos químicos cuyo espectro de especificidad es muy bajo y por lo general son de larga acción residual. Estos microorganismos han sido utilizados para el control biológico de plagas y vectores, reduciendo una población de plaga específica, con el objeto de que sea menos abundante y por lo tanto menos perjudicial. Se considera que un entomopatógeno es exitoso cuando sus niveles de infectividad, virulencia, patogenicidad, capacidad para sobrevivir, capacidad de dispersase y su capacidad reproductiva son altos (Nicholls-Estrada 2008). Los grupos más importantes de entomopatógenos son: bacterias, virus, hongos, nemátodos y protozoos. Los principales microorganismos entomopatógenos que han sido utilizados exitosamente para el control de plagas se muestran en la Tabla 1.1. 11 Tabla 1.1 Principales microorganismos entomopatógenos desarrollados y utilizados como agente de control biológico. Entomopatógeno Plaga principal Baculovirus Virus de la poliedrosis nuclear Virus Bacterias Virus de la granulosis Virus no ocluido (Oryctes) Virus de la poliedrosis citoplásmica Entomopoxvirus Inidovirus Bacillus popilliae Bt. var. thuringiensis Bt. var. israelensis Bacillus sphaericus Mastigomycotina Coelomomyces spp. Lagenidium giganteum Zygomycotina Entomophthoraceous Larvas de lepidópteros, larvas de Hymenoptera (Tenthredinidae) Larvas de lepidópteros Larvas de Scarabaeidae Larvas de lepidópteros Orthoptera, larvas de Scarabaeidae Mosquitos Larvas de Scarabaeidae Larvas de lepidópteros Larvas de mosquitos y otros dípteros Larvas de coleópteros y mosquitos Larvas de mosquito Larvas de mosquito Áfidos, larvas de lepidópteros, coleópteros, Orthoptera Deuteromycotina Hongos Beauveria bassiana Metarhizium anisopliae Verticillium lecanii Microsporidia Nosema spp. Nematodos Vairimorpha necatrix Mermithidae Steinernematidae y Heterorhabditidae Larvas de coleópteros, lepidópteros, Orthoptera Larvas de coleópteros, cicadélidos, cercopidos, cucarachas Áfidos, moscas blancas Orthoptera, larva de mosquito, coleoptera Larvas de lepidopteros Larvas de mosquito Larvas de lepidópteros, larvas de coleópteros y Gryllotalpidae Fuente: Adaptado de (Nicholls-Estrada 2008). 12 Introducción 1.2 Bacterias entomopatógenas Los insectos normalmente contienen un gran número de bacterias. La mayoría son saprofitas y comensales, y algunas son simbióticas. Relativamente pocas especies bacterianas han sido descritas como patógenas de insectos, sin embargo estas han recibido gran atención debido a su potencial para el control de plagas en la agricultura y el control de vectores en enfermedades (van Emden and Service 2004). Más de 90 especies de bacterias entomopatógenas han sido aisladas de insectos, plantas y suelo, pero sólo unas pocas se han estudiando intensivamente (Nicholls-Estrada 2008). Algunos miembros de la familia Enterobacteriaceae son reconocidos como especies muy patógenas para insectos (Priest 2000), entre las que se encuentra Serratia entomophila, causante de la muerte del escarabajo de pastizal en Nueva Zelanda y que destaca por ser la bacteria no esporulante que provoca mayor mortalidad (Jackson et al. 1992). Otras especies de Enterobacteriaceae con actividad entomopatógena incluyen a Photorhabdus luminescens, Xenorhabdus nematophilus (Forst and Nealson 1996), y Yersinia enterocolitica (Bresolin et al. 2006). Fuera de esta familia, otras de las bacterias entomopatógenas son: Pseudomonas entomophila (Grimont et al. 1988), Erwinia carotovora (Basset et al. 2000) y Dickeya dadantii (Grenier et al. 2006). Las bacterias entomopatógenas más conocidas y utilizadas son las formadoras de esporas de la familia Bacillaceae, en especial algunas especies del género Bacillus (Priest 2000; Nicholls-Estrada 2008). El interés por este género bacteriano se debe a la aptitud de sus cepas para ser tratadas 13 industrialmente para la producción masiva y la aplicación en el campo como insecticida microbiológico (van Emden and Service 2004). 1.2.1 El género Bacillus Son bacterias Gram-positivas, buenas secretoras de proteínas y metabolitos, fáciles de cultivar y altamente eficientes para el control de plagas y enfermedades (Berg and Hallmann 2006). Poseen una morfología alargada simulando un bastón, son aerobias estrictas o anaerobias facultativas, ubicuas en la naturaleza; incluyen especies de vida libre, patógenas y varias especies que forman parte natural de la flora intestinal humana (Todar 2006). Una característica particular de este género es su habilidad para formar endosporas bajo condiciones de estrés físico o químico, lo que le permite sobrevivir y permanecer metabólicamente activas por largos períodos de tiempo (Errington 2010), haciéndolos apropiados para la formulación de productos viables y estables para el control biológico. Existen otras bacterias capaces de producir endosporas, entre estas, bacterias pertenecientes a los géneros Clostridium, Sporosarcina, Sporohalobacter, Sporolactobacillus, Anaerobacter, Desulfotomaculum, Helicobacterium y Heliophilum (Nicholson et al. 2000), siendo los más estudiados Bacillus y Clostridium (Nicholson et al. 2000; Moller and Hederstedt 2006). El género Bacillus ha cobrado importancia por su producción de toxinas, las cuales pueden lisar eritrocitos de diferentes especies animales (hemolisinas) o tener propiedades patógenas frente a insectos (Hoult and Tuxford 1991). Las bacterias entomopatógenas pertenecientes a este género son agentes naturales de control biológico de plagas de insectos y han sido utilizadas como base de varios insecticidas biológicos comerciales. Las especies más 14 Introducción relevantes son: B. thuringiensis que forma un cuerpo paraesporal tóxico para insectos (Smirnova et al. 1996; Bravo 1997), Lysinibacillus sphaericus (Ahmed et al. 2007; Jones et al. 2007), B. laterosporus (Shida et al. 1996), Paenibacillus larvae (Evans 2004), P. lentimorbis, y P. popilliae (El-Borai et al. 2005). Sin embargo, B. thuringiensis es la especie más usada en programas a gran escala y de la que se tiene más conocimiento científico. Coincidiendo con la esporulación, estas bacterias son capaces de formar inclusiones cristalinas paraesporales, que muchas veces son las que contienen una o más proteínas insecticidas. Estas proteínas son tóxicas para los insectos por ingestión, cuya acción generalmente es sobre las células del epitelio del intestino medio (de Maagd et al. 2003). La ubicuidad en la naturaleza, la formación y resistencia de sus endosporas, la producción de antibióticos, la toxicidad de sus esporas, y la producción de cristales proteicos tóxicos para varios ordenes de insectos hacen del género Bacillus importante en la medicina, la agricultura, la bioquímica y en la empresa farmacéutica (Todar 2006). 1.2.2 Bacillus thuringiensis Es una bacteria aerobia estricta, flagelada, esporulante y ubicua. Ha sido aislada de todas partes del mundo y de muy diversos sitios como suelo (Martin and Travers 1989; Carozzi et al. 1991), agua (Iriarte et al. 2000), partes de plantas (Kaelin et al. 1994; Cinar et al. 2008), insectos muertos (Carozzi et al. 1991; Kaelin et al. 1994) y granos almacenados (Schnepf et al. 1998); incluso ha sido aislado del intestino de pequeños roedores del orden Rodentia e Insectivora (Swiecicka et al. 2002). Las cepas aisladas han mostrado alto grado de especificidad frente a diferentes órdenes de insectos 15 como Lepidóptera, Díptera, Coleóptera, Himenóptera, Homóptera, Ortóptera, Phthiraptera o Mallophaga y Acari; y en otros invertebrados como Nemathelminthes, Platyhelminthes, y Sarcomastigorphora (Bravo 1997; de Maagd et al. 2003). Durante su ciclo de vida presenta dos fases principales, el crecimiento vegetativo en el cual se duplica por bipartición y la fase de esporulación en la cual la bacteria se diferencia en endospora (Itoua-Apoyolo et al. 1995). La endospora se desarrolla en un esporangio formado por la célula madre y la espora. Las proteínas insecticidas se acumulan en la célula madre durante el proceso de esporulación. La fase de esporulación consta de siete estadios, los cuales se inician cuando hay limitación de nutrientes y se cierra en la fase lítica, en donde la endospora se lisa y tanto la exospora como los cristales son liberados (Bravo et al. 1992; Soberon and Bravo 2009). Los cristales paraesporales están constituidos fundamentalmente de proteínas llamadas δ-endotoxinas. Varios factores condicionan la cristalización de las δ-endotoxinas, entre estos están su estructura secundaria, la formación de puentes disulfuro entre residuos cisteína y la presencia de componentes adicionales en el cristal. Además, los mecanismos de cristalización pueden variar entre las distintas δ-endotoxinas (Agaisse and Lereclus 1995; Baum and Malvar 1995). La morfología que adquieren los cristales puede ser muy diversa y normalmente se la relaciona con el tipo de δ-endotoxina que lo componen. Se han reportado cristales romboides, bipiramidales, heterogéneos (en una misma cepa), esféricos, irregulares/amorfo y cúbicos (ver Figura 1.1). 16 Introducción B A D C F F E Figura 1.1 Diferente morfología de cristales paraesporales: romboides (A), bipiramidales (B), heterogéneos (C) (Kaelin et al. 1994), esféricos (D), irregulares (E) (Karamanlidou et al. 1991) y cúbicos (F) (Ramalakshmi and Udayasuriyan 2010). 1.2.2.1 Factores de Virulencia: Toxinas Cry y Cyt El grupo de las δ-endotoxina está compuesto por dos grupos de proteínas que no presentan homología de secuencia ni de estructura terciaria entre sí: las proteínas Cry (del inglés “Crystal”) y las proteínas Cyt (del inglés “Cytolitic”). Hasta la fecha se han clonado y secuenciado 572 genes cry diferentes y 35 genes cyt (Crickmore et al. 2011). Cada δ-endotoxina presenta un espectro de actividad insecticida característico, con un rango de acción limitado a pocas especies, generalmente de un mismo orden. Este espectro puede depender de la combinación de δ-endotoxina que la cepa produzca. Se han descrito una gran cantidad de combinaciones de genes de δ-endotoxinas, siendo las más 17 comunes de la familia cry1 y cry2 (Porcar and Juarez-Perez 2003) o la combinación cry4, cry10, cry11, cyt1 y cyt2 (Berry et al. 2002). Estas combinaciones se deben principalmente a que estos genes están situados en plásmidos transmisibles por conjugación entre cepas y en general estas secuencias se encuentran flanqueadas por elementos transponibles, posibilitando la transmisión horizontal (Schnepf et al. 1998; de Maagd et al. 2001). Estas toxinas no son exclusivas de Bt, también han sido descritas en otras bacterias esporulantes (Crickmore et al. 2011). La principal diferencia entre las endotoxinas Cry y Cyt, es que las endotoxinas Cry usan α-hélices para provocar poros en la membrana y las endotoxinas Cyt utilizan láminas β (Bravo et al. 2007). La estructura de las toxinas Cry es globular y presenta 3 dominios. Un prerrequisito para su toxicidad insecticida es la unión a receptores de membrana, fundamentalmente de tipo Aminopeptidasa N (APN) y proteínas similares a Caderina (Li et al. 2001). Las toxinas Cyt tienen un único dominio, la proteína receptora no ha sido identificada, pero se sabe que se insertan rápidamente en membranas que contienen fosfolípidos con una cadena de ácido graso no saturada en posición syn-2 (Schnepf et al. 1998; Li et al. 2001). El mecanismo de acción de estas toxinas es un proceso complejo desarrollado en varias etapas. Primero el insecto debe ingerir las bacterias, cuando esta llega al intestino medio, las condiciones posibilitan la solubilización de los cristales y la liberación de las protoxinas. Un factor determinante en esta etapa es el pH; si el pH del lumen intestinal no es el adecuado los cristales no se solubilizarán y por tanto no ejercerán su actividad (Bravo et al. 2007). Las protoxinas liberadas al lumen intestinal no son tóxicas por sí misma, deben ser activadas por la acción de enzimas proteolíticas del insecto. Las toxinas activadas atraviesan la membrana peritrófica y alcanzan la pared intestinal 18 Introducción donde causan la lisis osmótica de las células epiteliales. No obstante, el mecanismo para realizar esta última fase difiere entre las toxinas Cry y Cyt. Las toxinas Cry una vez activadas, se unen por su extremo C-terminal a una caderina en el extremo apical de la membrana de las células epiteliales del intestino, se produce una escisión de 28 residuos aminoacídicos del extremo N-terminal y se establece una forma pre-poro, que incrementa su afinidad por un receptor secundario que puede ser aminopeptidasa N o fosfatasa alcalina. Esta última unión facilita la formación del poro en el epitelio intestinal, provocando un desequilibrio osmótico y la posterior lisis celular (Bravo et al. 2004). En cambio, las toxinas Cyt no precisan receptores proteicos, interactúan directamente y de forma poco específica con la fracción lipídica de la membrana. Para esto se han propuesto dos modos de acción: A) modelo de formación de poro, en el cual las toxinas Cyt se insertan en la membrana como monómeros y cuando alcanzan cierta densidad, éstos se oligomerizan conformando poros de membrana (Promdonkoy and Ellar 2003) ; y B) modelo de acción tipo detergente, en el cual las toxinas Cyt se agregan de manera poco específica sobre la superficie de la membrana plasmática alterando su estructura o destruyéndola, de forma similar a la acción de un detergente (Butko 2003). El resultado de todo este proceso es la muerte del insecto producida por inanición y/o septicemia (Schnepf et al. 1998). 1.2.2.2 Otros factores de virulencia Se conoce que Bt ha desarrollado un amplio arsenal de compuestos tóxicos, algunos específicos contra insectos e invertebrados como es el caso de las δ19 endotoxinas, pero también se han reportado otros factores de virulencia, que actúan solos o activando la acción de las δ-endotoxinas dependiendo de la cepa bacteriana. Se ha visto un efecto sinérgico entre las esporas y las δ-endotoxinas de algunas cepas (Johnson and McGaughey 1996). El mecanismo por el cual la espora tiene efecto potenciador no es bien conocido, pero se sabe que no solo depende de la germinación de la espora sino también de las proteínas presentes en su cubierta (Johnson et al. 1998). Existen compuestos extracelulares tóxicos que pueden ser producidos antes de la esporulación: β-exotoxinas, conocidas como thuringiensina, se producen y son excretadas al medio en la fase vegetativa de la bacteria. Son toxinas insecticidas termoestables, solubles en agua y dializables. Es un análogo nucleotídico de ADN a la cual se le atribuye acción insecticida sobre Lepidópteros, Dípteros, Coleópteros, Hemípteros, además de ácaros, nematodos, protozoarios y platelmintos (Hernandez et al. 2003). Se cree que la toxicidad de este compuesto se debe a la inhibición de la enzima ARN polimerasa dirigida por ADN, ya que la β-exotoxina podría competir con el ATP (Levinson et al. 1990). Su gran similitud con Adenosin monofosfato hace que esta toxina muestre propiedades toxicas de amplio espectro, incluso sobre el hombre. Es por esto, que el uso de cepas productoras de β-exotoxina están prohibidos en la mayoría de los países (Joung and Côté 2000). Las proteínas Vip, del inglés “vegetative insecticidal proteins”, son sintetizadas y secretadas al medio en la fase de crecimiento vegetativo. Se han descrito 3 grupos, Vip1, Vip2 y Vip3 que muestran actividad sobre algunos lepidópteros y coleópteros (de Maagd et al. 2003). 20 Introducción Además existen otros factores como fosfolipasas, proteasas, quitinasas y exotoxinas alfa y gama (consideradas como fosfolipasa C y lecitina, respectivamente). Se cree que todos estos factores ayudan a la bacteria en la invasión del insecto. 1.2.2.3 Aplicaciones biotecnológicas Bacillus thuringiensis es el insecticida biológico más utilizado comercialmente, su uso tradicional ha sido el control de insectos plagas en la agricultura y de mosquitos vectores de enfermedades como la malaria y el dengue (Soberon et al. 2009). En el año 2007, se estimó que los productos de Bt constituían alrededor de un 80% del mercado de bioinsecticidas, sin embargo estos productos sólo representan el 2% del mercado global de insecticidas (Roh et al. 2007). Como insecticida ha mostrado eficacia en la protección de cultivos y muestras ventajas frente a los insecticidas químicos. Su éxito se debe a la especificidad y la inocuidad para mamíferos, otros vertebrados, plantas e inclusive otros insectos benéficos (Schnepf et al. 1998). Además, su producción es económicamente competitiva mediante el uso de fermentadores a gran escala. El conocimiento de las bases genéticas de la toxicidad de Bt, así como la utilización de diferentes técnicas de transformación genética, han permitido desarrollar productos modificados que han puesto en el mercado nuevas toxinas. Además se han podido generar plantas transgénicas que solucionan la baja persistencia en el medio ambiente de los productos Bt y han permitido dirigir la toxicidad a órganos específicos de las plantas (Zaidi et al. 2005). 21 Todas estas características, hacen de los productos basados en las toxinas de Bt sean una herramienta útil, ventajosa y muy aplicable para el control de plagas y vectores de enfermedades. 1.3 Bacillus pumilus 1.3.1 Biología Bacillus pumilus fue descrita por primera vez por Meyer y Gottheil en 1901. Es conocida también por los nombres de Bacillus aminoglucosidicus o Bacillus mesentericus. Taxonómicamente pertenece al dominio Bacteria, filo Firmicutes, clase Bacilli, orden Bacillales, familia Bacillaceae, género Bacillus (Skerman et al. 1989). Se considera como una bacteria ubicua en la naturaleza, asociada a animales (Shehata et al. 1983; Johnson et al. 2006; Coorevits et al. 2008; Hill et al. 2009; Porwal et al. 2009), a plantas y restos vegetales (Cottyn et al. 2001; Choudhary and Johri 2009; Asraful Islam et al. 2010), específicamente documentada como endofítica en cultivos in vitro (Thomas 2004) y plantas como el algodón y maíz (McInroy and Kloepper 1995), cítricos (Araujo et al. 2002), y epifita en arroz (Cao et al. 2001). Es comúnmente aislada de una gran variedad de fuentes ambientales: suelo (Meyers et al. 1991; Garbeva et al. 2003); mar y sedimentos marinos (Siefert et al. 2000; Banerjee et al. 2007; Inbakandan et al. 2010); alimentos fermentados (Ouoba et al. 2004; From et al. 2007; Meerak et al. 2008); superficies ambientales (Pirttijarvi et al. 1996; Silva et al. 2006; Porwal et al. 2009); además en sitios poco comunes para el aislamiento de microorganismos como en el interior de 22 Introducción basalto del desierto de Sonora (Benardini et al. 2003) o en una aeronave espacial (Kempf et al. 2005). Es una bacteria Gram-positiva, esporulante, de forma bacilar, aerobia o anaerobia facultativa, con bajo contenido en Guaninas y Citocinas en su genoma (aproximadamente 41%). Se la considera una especie mesófila (Coorevits et al. 2008), aunque también existen cepas que pueden ser termófilas y alcalófilas (Moallic et al. 2006). Crece como una colonia lisa que se torna amarilla mientras aumenta el tiempo de incubación. Es una especie móvil (posee flagelo), β- hemolítica en agar sangre, catalasa positiva, tolerante a las sales y susceptible a la penicilina (Tena et al. 2007; Porwal et al. 2009). B. pumilus tiene propiedades tóxicas, efectos citopáticos en células Vero, actividad hemolítica, producción de lectinasa y actividad proteolítica en caseína (Hoult and Tuxford 1991). Es considerada una bacteria no patógena para humanos, pero debido a su producción de hemolisinas se la considera una bacteria patógena oportunista. La infección humana por B. pumilus es excepcional (Porwal et al. 2009). From et al. (2007) la relaciona con incidentes de contaminación alimentaria debido a la producción de un complejo de lipoproteínas conocidas como pumilacidinas previamente encontradas en otros Bacillus spp. causantes de contaminación alimentaria. Ecológicamente, B. pumilus, al igual que otras bacterias de su género, mantiene relación endofítica con ciertas plantas, favoreciendo el crecimiento y desarrollo, y dando protección contra otros organismos del suelos que causan enfermedades, como hogos del género Fusarium (Benhamou et al. 1996) y Rhizoctonia (Cottyn et al. 2009). B. pumilus al ser una especie esporulante, puede permanecer en estado de inactividad durante largos períodos de tiempo cuando las condiciones 23 ambientales son desfavorables y luego volver a germinan y a formar una célula vegetativa (Nicholson et al. 2000). Sus esporas son resistentes al calor, desecación, radiación UV, radiación γ, H2O2 y a la escasez de nutrientes. Son más resistentes que otras bacterias de su género, pudiendo sobrevivir incluso a las prácticas de esterilización estándar (Gioia et al. 2007). Actualmente, se conoce el genoma completo de la cepa B. pumilus SAFR032 (No. de acceso al GenBank: NC_009848), las secuencias del genoma de B. pumilus ATCC 7061 (No. de acceso al GenBank: NZ_ABRX00000000), y las secuencias completas de tres plásmidos: B. pumilus plásmido pPZZ84 (No. de acceso al GenBank: NC_ 013534), B. pumilus ATCC 12140 plásmido pPL10 (No. de acceso al GenBank: NC_001858) y B. pumilus ATCC 7065 plásmido pPL7065 (No. de acceso al GenBank: NC_004932) . Esta información es una potente herramienta para la caracterización molecular de otras cepas. 1.3.2 Aplicaciones Biotecnológicas 1.3.2.1 Producción de Enzimas B. pumilus es utilizada a nivel industrial por la gran cantidad de enzimas que es capaz de producir. Las primeras enzimas descritas producidas extracelularmente por esta bacteria fueron: celulasas, liquenasas, pectato liasas, serin proteasas, serin-metal proteasas y deoxiribonucleasa- ribonucleasa (Priest 1977). Las proteasas microbianas constituyen aproximadamente el 40% de la producción mundial de todas las enzimas. El género Bacillus produce las 24 Introducción proteasas comerciales más utilizadas en la actualidad, siendo B. licheniformis, B. subtilis y B. pumilus las especies más conocidas a nivel industrial por la producción de proteasas alcalinas, usadas ampliamente en la industria alimentaria, farmacéutica, producción de detergentes y tratamiento del cuero (Jaouadi et al. 2008; Zhang et al. 2010). Las proteasas alcalinas de B. pumilus han sido descritas para las siguientes aplicaciones: inactivación de ARNasas durante la purificación de ARN de células homogenizadas, coagulación de la leche de soja, limpieza de membranas de ultrafiltración, depilación del cuero, producción de hidrolizados de zeína, formulación de detergentes con subtilisina y otras proteasas (Jaouadi et al. 2008). Las proteasa de B. pumilus destacan por ser más eficientes que las de otras bacterias, por ejemplo, se ha descrito que la proteasa alcalina de B. pumilus CBS presenta mejor eficacia catalítica que la subtilisina, además mayor estabilidad al pH, temperatura y desnaturalizantes químicos (Jaouadi et al. 2008); mayor eficiencia en la depilación de cuero (Wang et al. 2007); keratinasa mas estable para la degradación de pelo de bovinos (Kumar et al. 2008); y colagenasa con alta especificidad (Wu et al. 2010). Otra de las enzimas producidas por esta bacteria son las xilanasas, ampliamente utilizadas en las industrias para blanquear la pulpa artesanal, aumentar el brillo del papel, mejorar la digestibilidad de los piensos, aclarar los zumos y procesar el alimento animal (Xu and Tao 2005; Kapoor and Kuhad 2007). Destacan las lacasas, por su versatilidad como biocatalizadores para aplicaciones industriales. Catalizan la oxidación de sustancias orgánicas, polimerización de monómeros, degradación de polímeros y la oxidación de compuestos fenólicos. Industrialmente ha sido utilizada para la 25 deslignificación de pulpa, la oxidación de los contaminantes orgánicos, el blanqueo de mezclilla y la decoloración y transformación de colorantes textiles. La importancia de la lacasa de B. pumilus se caracteriza por su tolerancia a altas temperaturas y actividad en condiciones neutras hasta alcalinas, a diferencia de las lacasa de hongos que son activas solo a pH ácidos (Naclerio et al. 2010; Reiss et al. 2011). También se ha descrito la producción de esterasas (Rasool et al. 2005); enzimas degradadoras de glúcidos como las endoglucanasas (Ariffin et al. 2008), quitinasas (Ahmadian et al. 2007; Dehestani et al. 2010), pectinasas (Sharma and Satyanarayana 2006) y pectato liasa (Ouattara et al. 2011). Otras cepas han sido descritas como degradadoras de compuestos xenobióticos (Meyers et al. 1991; Calvo et al. 2004; Hayase et al. 2004; Toledo et al. 2006; Hua et al. 2007). 1.3.2.2 Producción de Antibióticos B. pumilus es conocida por la producción de antibióticos, como es el caso de la pumilina (BHATE 1955), la pumilacidina (Naruse et al. 1990), la pumicilina (Aunpad and Na-Bangchang 2007) y tetaína (Krynski et al. 1952). También se ha descrito una cepa de B. pumilus que inhibe los factores de virulencia de algunas bacterias Gram-negativas como Chromobacterium violaceum ATCC 12472, C. violaceum CV026, Pseudomonas aeruginosa PAO1 y Serratia marcescens, mediante la acción de una acilasa cuya actividad inhibe el quorum sensing de estas bacterias (Nithya et al. 2010). 26 Introducción 1.3.2.3 Control Biológico 1.3.2.3.1 Control de Hongos y Bacterias en plantas Algunas cepas de B. pumilus tienen actividad fungicida y han sido utilizadas como agentes de control biológico de hongos fitopatógenos. La propiedad de estas cepas para producir metabolitos extracelulares antifúngicos es una de las más explotadas, ya que inhiben el crecimiento del micelio y la producción de micotoxinas de muchas especies de hongos como Aspergillus, Penicillium and Fusarium, causantes de grandes pérdidas económicas en los cultivos a nivel mundial (Munimbazi and Bullerman 1998). Se han descrito cepas de B. pumilus activas contra Mucoraceae y Aspergillus (Bottone and Peluso 2003), Ascosphaera apis (Reynaldi et al. 2004), Verticillium dahliae, Rhizoctonia solani, Phtophthora parasítica y Ralstonia solanacearum (Mei et al. 2010). En el 2001 se patentó una cepa de B. pumilus productora de metabolitos con propiedades fungicidas contra ciertos patógenos específicos de plantas, pero no contra bacterias. Esta cepa es capaz de proteger las raíces y las frutas de varias especies de cultivos de infecciones de hongos (Lehman et al. 2001). Hay cepas capaces de actuar contra hongos y/o bacterias en condiciones adecuadas. Es así que, Bacillus pumilus SE34 está descrita como una rizobacteria que induce sistemas de resistencia en Arabidopsis frente a Pseudomonas syringae pv. maculicola (Ryu et al. 2003) y en plantas de Tabaco frente a Peronospora tabacina (Zhang et al. 2002). Esta cepa activa las defensa de la planta, vía inducción de la resistencia sistémica; este proceso depende de la activación física o química de las barreras de la planta y es característica de la cepa que se encuentra colonizando su raíz. Otra cepa 27 con las mismas características es B. pumilus T4, que induce resistencia en Arabidopsis frente a Pseudomona syringae (Ryu et al. 2003). El mecanismo de acción de algunas cepas de B. pumilus para inducir sistemas de resistencia en plantas se conoce bastante bien. Por ejemplo, en remolacha azucarera, B. pumilus 203-6 y 203-7 induce la resistencia sistémica por el incremento de la producción de quitinasa y de β-1,3-glucanasa (Bargabus et al. 2004); en tabaco, la resistencia mediada por B. pumilus SE34 es determinada por el aumento de los niveles de ácido salicílico (Zhang et al. 2002), mientras que en guisantes, esta misma cepa induce la resistencia por el fortalecimiento de las paredes celulares epidérmica y cortical mediante la producción de calosa y compuestos fenólicos (Choudhary and Johri 2009). Así, la inducción de resistencia sistémica en plantas por B. pumilus, al igual que otras de su especie, depende de la cepa bacteriana, la planta huésped y en algunos casos del patógeno (Choudhary and Johri 2009). Varios ejemplos han sido descritos en la literatura (Tabla 1.2). Esta aplicación ha sido industrialmente explotada y existen varios productos a la venta, cuyo ingrediente activo es una cepa de B. pumilus (Tabla 1.3). 28 Introducción Tabla 1.2 Uso de B. pumilus para el control biológico de patógenos de plantas. Cepa de Planta Enfermedad 203-6 y 203-7 Remolacha azucarera Mancha de la hoja por Cercospora Cercospora beticola SE34 y T4 Tabaco Moho azul Peronospora hyoscyami pv. tabacina INR7 Pepino Marchitez bacteriana Erwinia tracheiphila SE34 Tomate Mancha de la hoja Virus mosaico del pepino (CMv) SE34 Tomate Tizón tardío Phytophthora infestans INR7, SE34, SE39, SE52 Pino de incienso Roya fusiforme Miyabe exsirai f. sp. Fusiforme INR7 Pepino Mancha angular Pseudomona syringae SE34 Tomate Mancha de la hoja Virus del moteado del tomate (ToMov) T4 Tabaco Fuego salvaje Pseudomona syringae pv. tabaco Bacillus pumilus Patógeno Cronartium quercuum, Fuente: (Choudhary and Johri 2009). 29 Tabla 1.3 Productos comerciales para control biológico en plantas basadas en B. pumilus Marca / nombre del Producto GB34 Biological Fungicide Ballad Cepa de B. pumilus Patógeno / enfermedad GB34 Rhizoctonia y Fusarium QST2808 Roya de la soya de Asia Oidio, mildiu, mancha de la hoja Sonata B. pumilus causada por Cercospora, tizón temprano, tizón tardío, podredumbre parda, niebla del peral. Yield Shield GB34 Hongos patógenos causantes de enfermedades en raíces. Fuente: APS Biological Control Committee (http://www.oardc.ohio-state.edu/apsbcc/) 1.3.2.3.2 Control de Insectos Tradicionalmente, B. pumilus no ha sido considerada una especie entomopatógena. A pesar de la gran diversidad de actividades biológicas útiles que se han demostrado, sus aplicaciones se han centrado en el uso de bioplagicidas para la prevención y tratamiento de enfermedades causadas por hongos fitopatógenos, principalmente en las raíces de ciertos cultivos. Sin embargo, estudios demuestran la patogenicidad de cepas de B. pumilus contra insectos diana (Heins et al. 1999; Eryurk et al. 2008; Molina et al. 2010; Yaman et al. 2010). 30 Introducción En 1999, Heins y colaboradores patentaron un método para proteger a las plantas contra el gusano de las raíces del maíz (Diabrotica virgifera, D. longicornis, D. undecimpunctata), la rosquilla verde o gusano de la remolacha (Spodoptera exigua) y algunas especies de nematodos, mediante la aplicación de una cantidad determinada del sobrenadante obtenido de un cultivo completo de B. pumilus AQ717 sobre cualquier parte de la planta incluida las raíces o aplicaciones al suelo que la rodean. Dicha patente incluye la cepa B. pumilus AQ717, los metabolitos con actividad pesticida que produce la cepa y varios métodos para proteger y tratar a las plantas contra estos insectos, ya sea el uso de la suspensión del cultivo bacteriano, el sobrenadante del cultivo o el metabolito purificado. La patente describe la producción de un metabolito tóxico y soluble de bajo peso molecular (<10.000 daltons), que se encuentra en el sobrenadante de un cultivo completo tras un periodo de incubación y agitación (Heins et al. 1999). En otro estudio, un Bacillus aislado del suelo e identificado como B. pumilus por métodos bioquímicos, presentó actividad tóxica frente a el escarabajo de la patata o dorífora (Leptinotarsa decemlineata), considerado como la plaga más importante en patatas, berenjenas y tomates. Esta cepa alcanza niveles de mortalidad de 95.7 y 26.7% en larvas y adultos, respectivamente, en ensayos de laboratorio (Eryurk et al. 2008). Otra cepa, aislada del escarabajo de la corteza del abeto (Dendroctonus micans), fue identificada como B. pumilus por métodos bioquímicos, y utilizada en bioensayos frente a insectos de la misma especie de la cual fue aislada. Estas pruebas revelaron una toxicidad del 69.4 y 40.9% de mortalidad en larvas y adultos, respectivamente de D. micans (Yaman et al. 2010). 31 Nuestro grupo de investigación, publicó el aislamiento y caracterización mediante comparación de secuencias parciales del gen 16S ARNr, de una cepa de B. pumilus entomopatógena activa frente a la mosca de la fruta del Mediterráneo (Ceratitis capitata). La cepa B. pumilus 15.1 presentó rangos de mortalidad del 68 al 94% en larvas de C. capitata, dependiendo de las condiciones bajo las cuales se realizan los bioensayos (Molina et al. 2010). 1.3.2.4 Otras Aplicaciones B. pumilus ha sido descrita como rizobacteria promotora del crecimiento vegetal (Ryu et al. 2003; Thomas 2004; Choudhary and Johri 2009; Udaya Shankar et al. 2009), como una herramienta potencial que proporciona importantes beneficios a la agricultura por su capacidad de potenciar el crecimiento de la planta y por tanto el rendimiento del cultivo. Además, es considerado como un microorganismo que al ser administrado en dosis adecuadas confiere beneficios en su huésped. Es así, que ha sido utilizada comercialmente como probióticos en el producto Biosubtyl (Green et al. 1999), y descrito con la capacidad de mejorar la respuesta inmune de peces, lo cual lo hace un atractivo probiótico para la acuicultura (Sun et al. 2010). 1.4 Bacillus pumilus 15.1 La cepa B. pumilus 15.1 fue aislada de vegetación en descomposición de caña silvestre (Phragmites australis) de la localidad agrícola de la Costa Tropical de Granada (Almuñecar), al sur de España, en donde la mosca de la fruta del 32 Introducción Mediterráneo es considerada la plaga económicamente más perjudicial de los cultivos frutales de la zona. La cepa se identificó mediante secuenciación del gen 16S ARNr, y su secuencia fue depositada en la base de datos GenBank, bajo el número de acceso EU978469 (Molina et al. 2010). Esta cepa ha cobrado importancia por presentar toxicidad frente a C. capitata. Su identificación y caracterización indican que es posible encontrar una cepa natural de Bacillus que sea tóxica para esta plaga y que cepas de B. pumilus son entomopatógenas. B. pumilus 15.1 es altamente tóxica para larvas de C. capitata, reportando mortalidad máxima del 94% en bioensayos. La toxicidad está determinada por las condiciones a las cuales el cultivo debe ser sometido. Así, la toxicidad se manifiesta cuando el cultivo esporulado tiene un tiempo de incubación de 96 horas a 4 °C (Molina et al. 2010). Nuestro grupo de investigación caracterizó esta cepa bioquímica y fisiológicamente. Los resultados fueron presentados por el doctorando Juan Francisco Caña Roca. En este trabajo se detallan algunas de las propiedades de B. pumilus 15.1, como parte inicial de la búsqueda del factor de virulencia de esta cepa (Caña-Roca 2009; Caña-Roca, J.F. et al., sin publicar). B. pumilus 15.1 tiene alta capacidad de degradar proteínas, es catalasa positiva, presenta actividad α y β hemolítica. En las pruebas de perfil metabólico, se comporta como otras cepas de la misma especie, a excepción del Ácido pirúvico, que solo es metabolizado por esta cepa. Es sensible a la penicilina y poco sensible a cloramfenicol y estreptomicina. Morfológicamente, la célula vegetativa tiene la forma típica bacilar, con un eje de mayor de 1.8-1.95 µm y un eje menor de 0.5 µm. Son formadoras de endosporas que se destaca por la ausencia de exosporio, característica de 33 otras especies de Bacillus. La endospora mide 1 µm en su eje mayor y 0.5 µm en su eje menor. Las endosporas son resistentes a agentes físicos (temperatura) y químicos (Etanol, Cloruro de benzalconio, K2MnO4 y pH extremos). El Formaldehido, Lejía y Peróxido de hidrógeno son letales para la cepa. B. pumilus 15.1 produce cristales paraesporales parecidos estructuralmente a los sintetizados por B. thuringiensis, estos cristales han sido observados tanto en el interior de la célula como dispersas por el medio de cultivo. El factor de virulencia de esta cepa no es conocido, pero la evidencia de nuestro grupo de investigación nos sugiere que puede ser de origen proteico. De aquí el interés por caracterizar el perfil proteico de esta nueva cepa, no solo por su actividad entomopatógena sino también por conocer el mecanismo de activación de dicha toxicidad. 34 35 36 2. OBJETIVOS 37 38 Objetivos El objetivo general de este trabajo de investigación es la caracterización del perfil proteico de la cepa Bacillus pumilus 15.1 bajo condiciones de cultivo donde la cepa ha mostrado actividad frente a larvas de la Mosca de la fruta del Mediterráneo C. capitata. Para lograr esto se plantean los siguientes objetivos concretos: 1. Caracterizar el perfil proteico de la cepa 15.1 en fase vegetativa. 2. Caracterizar el perfil proteico de la cepa 15.1 en fase esporulada. 3. Separar y analizar las proteínas más relevantes de los perfiles proteicos. 4. Bioensayar la actividad de las proteínas insolubles excretadas mayoritarias producidas durante la esporulación de la bacteria B. pumilus 15.1 frente a larvas de C. capitata. 39 40 41 42 3. MATERIALES Y MÉTODOS 43 44 Materiales y Métodos 3.1 Condiciones de cultivo de cepas bacterianas 3.1.1 Cepas bacterianas y su conservación Las cepas bacterianas utilizadas en este trabajo, junto con sus genotipos o características más relevantes se recogen en la Tabla 3.1 Tabla 3.1 Cepas bacterianas más relevantes utilizadas en este trabajo Especie Cepa 15.1 Genotipo/Características Cepa tóxica frente a larvas de C. capitata Referencia/Fuente (Molina et al. 2010) Sin publicar: Proporcionado por Bacillus pumilus 15.1 Cepa curada de elementos Curado extracromosómicos J.F. Caña-Roca (de nuestro grupo de investigación) Dr. Calvo, M1 Cepa degradadora de compuestos aromáticos Universidad de Granada La conservación de las cepas a corto plazo se realizó en cultivos en placa con medio LB sólido a 4 °C. La conservación a largo plazo se hizo por congelación de cultivos líquidos en 40% (v/v) de glicerol a -80 °C. 45 3.1.2 Medios de cultivo Los medios utilizados para el cultivo de B. pumilus se describen a continuación. Los medios fueron esterilizados en autoclave por calor húmedo a 121 °C y una atmósfera de presión, antes de ser utilizados. 3.1.2.1 Medio rico El medio utilizado rutinariamente para el crecimiento de las cepas de B. pumilus 15.1, 15.1 Curado y M1, fue el medio rico Luria-Bertani (LB) (Maniatis et al. 1982), cuya composición fue 10 g de Triptona, 5 g de Extracto de Levadura, 10 g de NaCl (cuando se requirió medio sólido se añadieron 15 g de Agar) por litro de agua destilada. También se utilizo el medio TSB (Tryptic Soy Broth) (Scharlau), usando las cantidades indicadas por la casa comercial (30 g por litro de agua destilada). 3.1.2.2 Medio de esporulación Cuando se requirió la esporulación de las cepas, el medio utilizado fue el medio T3, cuya composición fue 3 g de Triptona, 2 g de Triptosa, 1.5 g de Extracto de Levadura, 0.05 M de NaH2PO4 pH 6.8 (preparado y esterilizado previamente), 0.005 g de MnCl2 por litro de agua destilada (Travers et al. 1987). 46 Materiales y Métodos 3.1.3 Condiciones de cultivo Las cepas de B. pumilus fueron cultivadas aeróbicamente en medio LB, TSB o T3 a 30 °C en un incubador orbital (Lan Technics) a 240 rpm entre 12 y 72 horas en medio líquido o en un incubador sin agitación en medio sólido. En el caso de cultivos líquidos, la relación entre el volumen del matraz Erlenmeyer y el volumen del cultivo para el crecimiento de las bacterias fue de 5:1. Cuando el ensayo lo requirió, el cultivo fue incubado a 4°C durante 96 horas. 3.2 Análisis de proteínas 3.2.1 Tratamiento de muestras proteicas El análisis de proteínas se realizó en la fracción sedimento y la fracción sobrenadante de un cultivo bacteriano crecido durante 12 y/o 72 horas a 30°C y 240 rpm de agitación en medio T3 o TSB. Para la obtención de cada una de las fracciones el cultivo se centrifugó durante 20 minutos a 20000 x g a 4 °C en un rotor JA-30.50, en una centrífuga Beckman Coulter Avanti serie J-30 I. El sobrenadante se transfirió a un tubo limpio por decantación, y se lo concentró mediante liofilización y resuspensión en agua miliQ a una concentración final de 100x. La muestra fue dializada frente a PBS durante 24 horas, utilizando una membrana de diálisis Spectra/Por® (Spectrum Laboratories) con un tamaño de poro de 3500 Da, con objeto de eliminar las 47 sales del medio. Tras la diálisis las muestras estuvieron a una concentración aproximada de 20x. El sedimento del cultivo se lavó mediante resuspensión en 20 mL de PBS dos veces y se concentró 250x. Cuando se quiso analizar el contenido proteico de la célula bacteriana se utilizó un cultivo de 12 horas a 30 °C a 240 rpm en medio T3 y TSB y se realizó un tratamiento con lisozima antes de la electroforesis. Para ello el cultivo se centrifugó a 20000 x g durante 15 minutos a 4 °C. Se eliminó el sobrenadante y se resuspendió el sedimento en 20 mL de tampón TES frío (0.36 g de Tris base, 0.146 g de EDTA, 0.292 g de NaCl en 100 mL de agua destilada, pH 8 y esterilizado por autoclavado), se lavó dos veces más y por último el sedimento se resuspendió en 5 mL de tampón de lisis (20% (p/v) de Sacarosa, 20 mg/mL de lisozima, 1% (v/v) Tritón x-100, 1mM de PMSF, 10 µg/mL de ARNasa, 10 µg/mL de ADNasa en tampón TES). La suspensión fue incubada durante 90 minutos a 37 °C. Posteriormente, la suspensión se centrifugó bajo las condiciones anteriores, se eliminó el sobrenadante y el sedimento se resuspendió en 4 mL de tampón de sonicación (DTT 1 mM, PMSF 1 mM en tampón TES). La muestra fue transferida a tubos “Precellys lysing kit VK01/VK05” de 7 mL para ser lisadas en el equipo Precellys 24 de Bertin Technologies, utilizando un programa de 6500 rpm por 3 ciclos de 30 segundos cada uno con intervalo de 10 segundos entre cada ciclo y repitiendo este programa 6 veces con intervalos de 1 minutos entre cada programa, en donde la muestra se mantuvo en hielo. La muestra fue transferida a tubos Eppendorf y centrifugada a 14000 rpm durante 5 minutos, se eliminó el sobrenadante y se resuspendió el sedimento en 500 µL de tampón TES. 48 Materiales y Métodos Para comprobar que la lisis celular fue exitosa, se realizó la siembra en placa de diluciones seriadas de distintos puntos del lisado. 3.2.2 Electroforesis de proteínas. SDS-PAGE El análisis de proteínas se realizó mediante la técnica de electroforesis en geles de poliacrilamida, en presencia de dodecil sulfato sódico (SDS-PAGE), utilizando el equipo Mini-protean system (Biorad TM ). La composición del gel separador fue de 7.5, 12 o 15% (v/v) de Acrilamida al 30% (dependiendo del experimento) en Tris 0.375 M pH 8.8, SDS 0.1% (p/v), APS 0.2% (p/v) y TEMED 0.1% (v/v). El gel concentrador tuvo una composición de 17.4% (v/v) de Acrilamida al 30% en Tris 0.125 M pH 6.8, SDS 0.1% (p/v), APS 0.1% (p/v) y TEMED 0.4% (v/v). Siete microlitros de la muestra proteica se mezclaron con otros 7 µL de tampón de carga 2x (Tris 0.1 M pH 6.8, SDS 2% (p/v), EDTA 4 mM pH 8, Glicerol 20% (v/v), Azul bromofenol 0.01% (p/v) y 2% (v/v) de β-mercaptoetanol) y se calentaron durante 10 minutos a 95 °C antes de que fueran cargadas en el gel. El tampón de electroforesis contuvo 3.02 g/L de Tris, 14.4 g/L de Glicina y 1 g/L de SDS. La electroforesis se realizó a un voltaje constante de 120 V, durante 1 hora. El marcador de peso molecular usado fue “Precision Plus ProteinTM Standards” de BIO-RAD. El procedimiento de tinción consistió en sumergir el gel en una solución de Azul de Coomassie 0.025% (p/v) en Metanol 40% (v/v) y Ácido Acético 10% (v/v) durante 45 minutos. Para desteñir el gel se retiró la solución anterior y se sumergió en una solución de Propanol 10% (v/v) y Ácido Acético 10% (v/v). El gel una vez desteñido, se conservó en agua destilada. 49 3.2.3 Separación de Proteínas mediante Gradiente de Sacarosa Un mililitro de precultivo (una colonia incubada en medio LB a 30 °C a 240 rpm toda la noche) se diluyó en 100 mL de medio T3 y se incubó a 30 °C a 240 rpm por el tiempo en que se quiso analizar la cepa. El cultivo fue centrifugado a 20000 x g por 20 minutos a 4 °C en una ultracentrífuga Beckman ™ serie J-30 I con un rotor JA-30.50, la fracción sedimento fue lavada con PBS estéril frío y centrifugada en las mismas condiciones anteriores, y el sedimento fue resuspendido en 2 mL de agua miliQ. Esta muestra fue colocada en la parte superior de un gradiente discontinuo de sacarosa formado por tres soluciones de 1.9, 2.1 y 2.3 M de sacarosa tal como se muestra en la Figura 3.1. Fig 3.1 Gradiente discontinuo de Sacarosa. 50 Materiales y Métodos El gradiente fue centrifugado utilizando el rotor JS-24.38 a 53000 x g durante 16 horas a 4 °C. Las fases e interfases resultantes del gradiente se recogieron en tubos diferentes para posteriormente lavarlas tres veces con PBS estéril frío mediante centrifugación a 23730 x g durante 15 minutos a 4 °C. El sedimento formado en cada una de las fracciones fue resuspendido en 1 mL de agua miliQ. Cada fracción fue analizada mediante SDS-PAGE y almacenadas a -20°C para su uso posterior. 3.2.4 Microscopía 3.2.4.1 Microscopía óptica Las muestras observadas mediante microscopía óptica fueron tomadas de un cultivo completo de B. pumilus 15.1 en medio T3 incubado a 30 °C durante 72 horas con agitación a 240 rpm, con el cual se realizó un gradiente de sacarosa y cuyas fracciones resultantes fueron observadas al microscopio. Las muestras se extendieron sobre un portaobjetos de vidrio formando un frotis, que se fijó con calor, tras lo cual se tiñó con una solución 0.133% (p/v) de Azul de Coomasie y 50% (v/v) de Ácido Acético (Ammons et al. 2002), seguidamente el portaobjetos se lavó con agua destilada, se dejó secar y se le colocó un cubreobjetos, para su posterior observación en el microscopio óptico. La observación de las muestras se realizó en el Centro de Instrumentación Científica de la Universidad de Granada, en un microscopio óptico marca OLYMPUS modelo BX51con un objetivo 100x. 51 3.2.4.2 Microscopía electrónica de transmisión Cien microlitros de cada muestra, se centrifugaron a 14000 rpm durante 5 minutos, se eliminó el sobrenadante y se añadió solución fijadora (Glutaraldehido 2.5% (v/v) y Paraformaldehido 4% (v/v) en un tampón Cacodilato 0.05 M a pH 7.2). Las muestras se mantuvieron a 4 °C durante un periodo máximo de 24 horas, tras el cual se lavaron tres veces siguiendo el siguiente procedimiento: centrifugación a 14000 rpm durante 5 minutos, eliminación del sobrenadante, adición de 1 mL solución de lavado (Tampón Cacodilato 0.1 M a pH 7.2) e incubación en frío durante 20 minutos. Las muestras se resuspendieron en solución de lavado y se mantuvieron a 4 °C hasta ser procesadas y observadas en el Servicio de Microscopía del Centro de Instrumentación Científica de la Universidad de Granada. La observación de las muestras se realizó en un microscopio electrónico de transmisión marca ZEISS modelo EM 902. 3.2.5 Inmunoblots Un alícuota de 2 µL de las fracciones obtenidas en el Gradiente de Sacarosa fue diluida en tampón de carga 2x (cuya composición ha sido descrita en el apartado 3.2.1 de este capítulo), y sometidas a temperatura de 95 °C durante 10 minutos al igual que el marcador de peso molecular “Amersham FullRange Rainbow Molecular Weight Markers” de GE Healthcare. Las muestras se cargaron con ayuda de un peine en un gel de poliacrilamida Phast GelTM 7.5% de GE Healthcare para realizar una electroforesis de proteínas en el equipo Phast System usando el siguiente programa que consta de dos pasoscuyas condiciones son: primero paso, 250 V, 10.0 mA, 3.0 W, 15 °C, 65 Vh; segundo paso 50 V, 0.1 mA, 0.5 W, 15 °C, 0 Vh. 52 Materiales y Métodos Tras la electroforesis, el gel de poliacrilamida se sumergió en tampón de transferencia transferencia (Tris base 25 mM, Glicina 192 mM y Metanol 20% (v/v), ajustado a pH a 8.3) durante 10 minutos, se cortó el gel y se colocó sobre una membrana de nitrocelulosa, cubriendo ambos lados con papeles filtro previamente sumergidos en tampón de transferencia. La transferencia se realizó en u equipo Phast transfer bajo las siguientes condiciones: 20 V, 25.0 mA, 1.0 W, 15 °C, 5 Vh durante 25 minutos. La membrana de nitrocelulosa se incubó en agitación toda la noche a 4 °C en solución de bloqueo cuya composición fue PBS con Tween al 0.1% (v/v) y leche en polvo al 2% (p/v). Tras ello, la solución de bloqueo se retiró y la membrana se lavó tres veces con solución de lavado (PBS con Tween al 0.1% (v/v)) durante 10 minutos. Los sueros se añadieron en una dilución 1:1000 (suero anti Cry1Aa1 y suero preinmune), y se incubó a 37 °C durante 2 horas en agitación. Tras la incubación con el anticuerpo, la membrana se lavó tres veces con solución de lavado durante 10 minutos y se incubó en agitación durante 1 hora y 30 minutos a 37 °C con una solución 1:1000 de anticuerpo secundario IgG-Fab de cabra anti–ratón conjugada con la peroxidasa de rábano HRP (Dakor) en PBS. Posteriormente la membrana se lavó tres veces con solución de lavado. Posteriormente se añadió solución Sustrato Peroxidasa cuya composición fue Tris HCl 0.1 M pH 7.4, 3’-3’ Diaminobencidina Tetrahidroclorhídrico 0.05% (p/v) y Peróxido de Hidrógeno 0.05% (v/v). Cuando apareció señal se detuvo la reacción con agua ultra pura y se dejó secar la membrana al aire. Cuando fue necesario la transferencia a la membrana fue realizada en el quipo Mini Trans-Blot® Electrophoretic Transfer Cell de Bio Rad a 350 mA durante 45 minutos en cámara fría. Como anticuerpo se utilizo el suero anti Cry1Aa obtenido de conejo (cedido por el Dr. Colin Berry, Universidad de 53 Cardiff) a una dilución 1:2000. Como anticuerpo secundario se utilizó IgGFab de cabra anti–conejo conjugada con la peroxidasa de rábano HRP (Dakor) a una dilución 1:1000. La membrana se reveló con Sustrato Peroxidasa, cuya composición ha sido anteriormente detallada. 3.2.6 Solubilización de Proteínas Las fracciones 2 y 6 procedentes de un gradiente de sacarosa de un cultivo de B. pumilus 15.1 en medio T3 incubado durante 72 horas a 30 °C con agitación a 240 rpm, se solubilizaron en las condiciones detalladas en la Tabla 3.2. Todos los tampones de solubilización fueron suplementados con 10 mM de DTT. Diez microlitros de cada fracción se centrifugaron a 14000 x g durante 10 minutos a temperatura ambiente en el caso de la fracción de 2 y a 4 °C en el caso de la fracción de 6. Tras la centrifugación se eliminó el sobrenadante y el sedimento fue resuspendido en 10 µL del tampón de solubilización. Como control se utilizó PBS estéril. Las muestras resuspendidas en cada tampón fueron incubadas durante 1 hora a 37 °C en un baño. Posteriormente se centrifugaron a 14000 x g durante 10 minutos y se separó el sobrenadante en un tubo limpio. El sedimento fue resuspendido en 10 µL de PBS estéril. Tanto el sedimento resuspendido como el sobrenadante fueron analizados en geles de poliacrilamida mediante SDS-PAGE. 54 Materiales y Métodos Tabla 3.2 Condiciones de solubilización ensayadas pH Tampón 3 NaHCO3 50 mM 6 NaHCO3 50 mM 9 Na2CO3 50 mM 12 Na2CO3 50 mM TRATAMIENTOS Coctel inhibidor PMSF 1 mM de proteasa 1x KCl 50 mM 1 HCl 134 mM KCl 50 mM 2 HCl 13 mM CH3COOH 98 mM 3 CH3COONa*3H2O 1.77 mM CH3COOH 84.7 mM 4 CH3COONa*3H2O 15.4 mM Na2HPO4 95.5 mM 9 HCl 4.5 mM Na2HPO4 96.6 mM 10 NaOH 3.36 mM Na2HPO4 96.53 mM 11 NaOH 3.47 mM KCl 50 Mm 12 NaOH 12 mM KCl 50 Mm 13 NaOH 132 mM X X X X X X X X X X 55 3.2.7 Análisis e identificación de proteínas por MALDI-TOF El análisis de proteínas por MALDI TOF/TOF se realizó sobre proteínas previamente separadas mediante SDS-PAGE. Las bandas de interés fueron recortadas del gel utilizando un bisturí estéril, colocadas en tubos con agua miliQ y enviadas al Centro de Investigación Príncipe Felipe en Valencia para ser analizadas en un MALDI TOF/TOF 4700 PA tras realizar un digerido proteico con tripsina. La huella peptídica determinada por MS-MS/MS fue procesada por el servicio utilizando MASCOT como algoritmo de búsqueda. Bajo las mismas condiciones una de las bandas fue analizada por el Servicio de Proteómica del CBMSO, Madrid, el cual pertenece al Instituto Nacional de Proteómica, ProteoRed. 3.2.8 Bioensayos con C. capitata 3.2.8.1 Mantenimiento de la Colonia de moscas de la fruta del Mediterráneo Para los ensayos realizados con larvas de Ceratitis capitata se contó con la cría continua de una colonia en el laboratorio. La colonia fue establecida a partir de una colonia mantenida en el Centro de Ecología Química Agrícola (CEQA) de la Universidad Politécnica de Valencia, amablemente proporcionada por el Dr. Navarro Llopis. El mantenimiento de la colonia en el laboratorio se realizó siguiendo las recomendaciones de Chapman et al. (1998), Jaldo et al. (2001) y González et al. (2003). Los adultos se mantuvieron en una habitación “insectario” en cajas de metacrilato (40 x 30 x 28 cm), bajo un fotoperíodo de 16 horas de 56 Materiales y Métodos luz y 8 de oscuridad, con una humedad relativa de 50 ± 5% y temperatura promedio de 25 ± 2 ºC. Las moscas adultas fueron alimentadas con dieta artificial compuesta por Autolisado de Levadura y Sacarosa, en relación de 1:4 (p/p), y se les suministró agua a través de una esponja amarilla húmeda. La pared frontal de las cajas estaba provista de una tela para simular la piel de las frutas, y ahí las moscas depositen los huevos para ser recogidos en contenedores de plástico con agua destilada. Estos huevos fueron recogidos y colocados sobre una dieta artificial para larvas compuesta por 200 g de Salvado de Trigo, 50 g de Sacarosa, 25 g de Levadura de Cerveza, 2 g de Nipagin (Metil 4-hidroxibenzoato, Sigma), 2 g de Nipasol (Propil 4-hidroxibenzoato, Sigma), 7.5 mL de HCl 37% y 500 mL de agua destilada. Esta cantidad de dieta fue suficiente para alimentar las larvas procedentes de 0.5 mL de huevos de C. capitata, las cuales fueron colocadas en un ambiente de temperatura constante a 25 °C. Las larvas se desarrollaron en condiciones de densidad relajada. Aproximadamente entre 7 y 10 días después de haber recogido los huevos, cuando las larvas alcanzaron el tercer estadio larvario (6 a 8 mm de longitud), los contenedores donde se alimentaron fueron transferidos a cajas de pupación, cuyo suelo estaba cubierto con arena tamizada y esterilizada, para permitir que las larvas saltaran del contenedor donde crecieron, ingresaran en la arena y puparan. Después de 7 a 10 días en la caja de pupación, y antes de que emergieran los adultos, las pupas fueron recogidas en un tamiz, y colocadas en placas Petri, dentro de una nueva caja de cría para adultos que contuvo la dieta artificial y agua destilada para continuar con la colonia. 57 3.2.8.2 Bioensayos con larvas Los bioensayos con larvas se llevaron a cabo utilizando individuos de primer estadio, de tamaño uniforme, criados durante 72 horas en la dieta artificial para larvas descrita en el apartado 3.2.8.1. Las fracciones GA.1 y GA.5 procedentes de un gradiente de sacarosa de un cultivo completo de B. pumilus 15.1 en medio T3 incubado durante 72 horas a 30 °C en agitación a 240 rpm y activado durante 96 horas a 4 °C, fueron bioensayadas frente a neonatos de C. capitata. De igual forma se utilizaron 2 de las fracciones equivalentes procedentes de un cultivo completo de B. pumilus 15.1 curado crecido en medio T3 incubado durante 72 horas a 30°C con agitación a 240 rpm, y denominadas como GC.2 y GC.5. Todas las muestras bioensayadas estuvieron 75 veces concentradas con respecto al cultivo original. Cien microlitros de cada fracción concentrada se dispensaron en los pocillos de una Microplaca Cellstar® (Greiner Bio-One) estéril de 48 pocillos libre de ADNsas y ARNasas. Tras ello, se añadieron 500 μL de la dieta artificial compuesta por las soluciones A y B, mezcladas inmediatamente antes de su uso agregando 20 mL de agua destilada estéril (Molina et al. 2010). La solución A tuvo la siguiente composición: 52 g de Salvado de Trigo de grano fino, 20 g de Sacarosa, 10 g de Levadura de Cerveza, 1.58 mL de HCl 37% y 100 mL de agua destilada; mientras que la solución B fue una mezcla homogénea de Agar a una concentración de 1.6 g en 100 mL de agua destilada. Ambas suspensiones se autoclavaron previamente a su uso. Mientras se manipuló y alicuotó, la dieta se la mantuvo en un baño de agua a 50 ºC para evitar su solidificación. Una vez colocada la dieta junto a las muestras en los pocillos de la microplaca, se usó un palillo estéril para 58 Materiales y Métodos homogeneizar la mezcla, y se dejo solidificar a temperatura ambiente, tras lo cual se colocó una larva de primer estadio de C. capitata sobre la dieta de cada pocillo tomada con la ayuda de un palillo estéril. Posteriormente, la microplaca se selló con plástico transparente tensado, para evitar que las larvas escapasen. Finalmente, usando un alfiler entomológico se hizo un pequeño agujero sobre cada uno de los pocillos para proveer a las larvas de suficiente aeración. Los bioensayos se mantuvieron en un incubador a 25 ºC durante todo el experimento. La mortalidad de las larvas se registró 4 y 10 días después de haber iniciado el experimento. 59 60 61 62 4. RESULTADOS 63 64 Resultados La cepa bacteriana Bacillus pumilus 15.1 fue seleccionada de muestras recogidas en la Costa Tropical de la provincia de Granada, España, por nuestro grupo de investigación. Esta cepa fue identificada y caracterizada por presentar alta toxicidad frente a larvas de Ceratitis capitata, (Molina et al. 2010), díptero considerado como una de las plagas más dañinas de frutas comestibles. El agente o agentes causantes de la toxicidad no han sido descubiertos, ni tampoco el mecanismo por el cual estos factores son activados, mostrando un aumento de la toxicidad de la cepa frente a C. capitata cuando el cultivo completo permanece durante 96 horas a 4 °C. Nuestro grupo de investigación considera la posibilidad de que el o los agentes causales de la toxicidad tienen origen proteico, de ahí la necesidad de realizar un análisis del perfil proteico de la cepa B. pumilus 15.1, cuyos resultados son descritos en este capítulo. 4.1 Perfil proteico de la cepa B. pumilus 15.1 Para la determinación de los perfiles proteicos se utilizó la electroforesis en geles de poliacrilamida en presencia de dodecil sulfato sódico (SDS-PAGE), considerado un método eficaz para la diferenciación de microorganismos (Plikaytis et al. 1986; Costas et al. 1989) y una técnica fiable y comúnmente usada para la separación, identificación y caracterización de proteínas (Wirth and Romano 1995; Steinberg 2009). Existen varios métodos para visualizar los resultados, en la bibliografía se han descrito colorantes orgánicos e inorgánicos (Wirth and Romano 1995). 65 En este trabajo se utilizó Azul de Coomassie, comúnmente usado por su bajo costo, fácil visualización, mejor cuantificación y su compatibilidad con ensayos de espectrometría de masas (Westermeier 2006). Con esta técnica se visualizaron los perfiles proteicos de la cepa B. pumilus 15.1 a diferentes tiempos de incubación. 4.1.1 Perfil proteico de un cultivo vegetativo Para el análisis de la cepa en estado vegetativo se partió de cultivos incubados durante 12 horas bajo las condiciones descritas en el apartado 3.1.3 del capítulo de Materiales y Métodos, en medio T3 y TSB. El perfil proteico de un cultivo de B. pumilus 15.1 en esta fase, cargado directamente en el gel, mostró un reducido número de banda (Figura 4.1, carriles 1), siendo la más intensa una proteína de tamaño ligeramente menor a 37 kDa, y presentando más intensidad en el medio TSB que en el medio T3.Tras realizar una lisis enzimática con lisozima, la cantidad de bandas proteicas aumentaron, a la vez que disminuyó la intensidad de la banda de 37 kDa. Esto fue debido a la liberación de proteínas intracelulares y de membrana tras la formación de esferoplastos con el tratamiento de lisozima (carriles 2). El perfil proteico de los esferoplastos lisados por movimientos vibratorios del Precellys fue similar al obtenido con la lisis enzimática (carriles 3). Para comprobar la extensión de la lisis bacteriana en cada uno de los tratamientos se realizó recuento en placas de células viables, partiendo de 108 UFC/mL, tras la lisis enzimática se obtuvo 106 UFC/mL y después de la lisis mecánica el conteo fue de 103 UFC/mL, probando que los métodos empleados consiguieron lisar la mayoría de las células bacterianas. 66 Resultados En la Figura 4.1 se puede observar que las proteínas no se degradan con este proceso. T3 kDa M 1 2 TSB 3 1 2 3 250 150 100 75 50 37 25 20 15 Figura 4.1 SDS-PAGE al 12% de B. pumilus 15.1 en estado vegetativo crecido en medio T3 y TSB. El carril 1 corresponde al sedimento del cultivo (10x), el carril 2 al sedimento después del tratamiento con lisozima (10x) y el carril 3 al sedimento después de la lisis mecánica (100x). 4.1.2 Perfil proteico de un cultivo esporulado Para el análisis del perfil proteico de B. pumilus 15.1 en estado esporulado se utilizó un cultivo incubado a 30 °C en agitación a 240 rpm durante 72 horas (tratamiento B). Dado que la toxicidad de la cepa B. pumilus 15.1 se revela sólo tras la incubación de dicho cultivo durante 96 horas a 4 °C se decidió comparar el perfil proteico de un cultivo incubado bajo dichas condiciones (tratamiento A). 67 La comparación del perfil proteico de los dos tratamientos se realizó con objeto de determinar si durante la incubación en frio existieron grandes cambios a nivel de proteínas debido a procesamientos, polimerizaciones o degradaciones. Los sobrenadantes liofilizados y dializados de la cepa B. pumilus 15.1 con los tratamientos A y B, fueron analizados en geles de poliacrilamida. Los resultados se muestran en la Figura 4.2. En general el número de proteínas existentes en el sobrenadante de un cultivo esporulado resultó ser muy bajo, incluso tras su concentración. No se observó ninguna diferencia significativa en el patrón de bandas presentadas por la cepa bajo las condiciones de los tratamientos A y B. Las bandas que presentan mayor intensidad en el sobrenadante de los cultivos fueron de tamaño 25 y 75 kDa (Figura 4.2). kDa M 1 2 250 150 100 75 50 37 25 20 15 Figura 4.2 SDS-PAGE al 12%del sobrenadante de un cultivo de B. pumilus 15.1 con el tratamiento A (carril 1) y tratamiento B (carril 2). 68 Resultados En paralelo, se comparó el perfil proteico de los sedimentos de la cepa B. pumilus 15.1 con la cepa control M1 de la misma especie y sin ningún tratamiento con frío. Los resultados de los perfiles proteicos se muestran en la Figura 4.3. kDa M 1 M 2 M 3 250 150 100 75 50 37 25 20 15 Figura 4.3 SDS-PAGE al 12% del sedimento de un cultivo de B. pumilus 15.1 con el tratamiento A (carril 1), B (carril 2) y de un cultivo de la cepa M1 con el tratamiento B (carril 3). La Figura 4.3 muestra que el patrón de migración electroforético de las proteínas del sedimento de la cepa B. pumilus 15.1 fue similar en los tratamientos A y B. A su vez, el patrón proteico de la cepa M1 fue muy distinto al de la cepa 15.1. 69 4.2 Separación de proteínas mediante Gradientes de Sacarosa Los gradientes discontinuos de sacarosa son comúnmente utilizados para separar células bacterianas de proteínas insolubles excretadas debido a que la diferencia en sus tamaños es muy notable (Thomas and Ellar 1983). Esta técnica (descrita en el apartado 3.2.3 del capítulo de Materiales y Métodos) fue utilizada para separar las proteínas presentes en los sedimentos de los cultivos de B. pumilus 15.1 obtenidos bajo diferentes condiciones de incubación. Al realizar un gradiente de sacarosa de un cultivo en estado vegetativo (12 horas de incubación) en medio TSB, tras la centrifugación toda la muestra pasó al fondo del tubo y no se observó parte de muestra retenida en ninguna de las fracciones del gradiente discontinuo de sacarosa. El análisis de proteínas por SDS-PAGE de las fracciones de sacarosa y el sedimento resultantes del gradiente se muestra en la Figura 4.4. M 1 2 3 4 5 kDa 50 37 30 25 Figura 4.4 SDS-PAGE al 12% del gradiente de sacarosa de un cultivo de B. pumilus 15.1 en fase vegetativa. El carril 1 corresponde a la muestra antes del gradiente, el carril 2 al sedimento formado en el gradiente, el carril 3, 4 y 5 a las fracciones pertenecientes a las concentraciones 1.97 M, 2.10 M y 2.30 M respectivamente. 70 Resultados La Figura 4.4 muestra que ninguna proteína fue retenida en las fases del gradiente de sacarosa, posiblemente porque no existe síntesis importante de proteínas insolubles en este estado celular. Todas las células sintetizadas que se observan en el carril 1 forman parte constituyente de la célula y son arrastradas con ellas hacia el sedimento. El resultado fue muy distinto cuando se realizó un gradiente de sacarosa de cultivos esporulados (72 horas de incubación) tratados con frio (tratamiento A) o sin frio (tratamiento B). En estos cultivos, algunas de las proteínas sintetizadas fueron retenidas en las diferentes fracciones de sacarosa (Figura 4.5). En los gradientes se observaron claramente 3 interfases (nombradas como 1, 3 y 5), 3 fases (nombradas como 2, 4 y 6) y un sedimento (nombrado como 7). A B 1 2 3 4 5 6 7 Figura 4.5 Resultado del gradiente discontinuo de sacarosa, en donde se muestran las fases (2, 4 y 6), las interfases (1, 3 y 5) y el sedimento formado (7) de un cultivo de B. pumilus 15.1 con el tratamiento A y B respectivamente. 71 Cada una de estas fracciones, después de ser lavadas y resuspendidas a una concentración 500x, fueron analizadas mediante electroforesis SDS-PAGE. Para mejor visualización de las proteínas retenidas en cada fracción, el análisis se realizó en geles con distinta concentración de poliacrilamida, al 7.5% (Figura 4.6), 12% (Figura 4.7) y 15% (Figura 4.8). En todos los geles destaca la presencia de dos bandas de tamaños moleculares de ~ 45 kDa y ~17 kDa por la mayor intensidad que presentan en relación al resto de bandas. El hecho de que las proteínas de 45 y 17 kDa no estén presentes en la fracción pellet (carril 7), donde se encuentra la mayoría de las proteínas celulares, indica que dichas proteínas han sido excretadas por la bacteria durante el proceso de esporulación y que son insolubles, posiblemente porque sean cuerpos de inclusión. 72 Resultados A kDa M 0 1 2 3 4 5 6 7 250 150 100 75 50 37 B M 0 1 2 3 4 5 6 7 kDa 250 150 100 75 50 37 Figura 4.6 SDS-PAGE al 7.5% del gradiente de sacarosa de un cultivo de B. pumilus 15.1 con el tratamiento A y B, en donde carril 0 corresponde a la muestra antes del gradiente, y los carriles 1 al 7 a las diferentes fracciones resultantes del gradiente. 73 A kDa M 0 1 2 3 4 5 6 7 250 150 100 75 50 37 25 20 15 B kDa M 0 1 2 3 4 5 6 7 250 150 100 75 50 37 25 20 15 Figura 4.7 SDS-PAGE al 12% del gradiente de sacarosa de un cultivo de B. pumilus 15.1 con el tratamiento A y B, en donde carril 0 corresponde a la muestra antes del gradiente, y los carriles 1 al 7 a las diferentes fracciones resultantes del gradiente. 74 Resultados A kDa M 0 1 2 3 4 5 6 7 4 5 6 7 250 75 50 37 25 20 15 10 B kDa M 0 1 2 3 250 75 50 37 25 20 15 10 Figura 4.8 SDS-PAGE al 15% del gradiente de sacarosa de un cultivo de B. pumilus 15.1 con el tratamiento A y B, en donde carril 0 corresponde a la muestra antes del gradiente, y los carriles 1 al 7 a las diferentes fracciones resultantes del gradiente. La cepa B. pumilus 15.1 contiene al menos dos elementos extracromosomales, un plásmido y un megaplásmido (Molina et al. 2009). Previamente, en nuestro laboratorio, se ha conseguido eliminar dichos elementos extracromosómicos de la cepa B. pumilus 15.1 mediante un 75 método modificado del protocolo descrito por González et al. (Gonzalez et al. 1981; Caña-Roca, J.F. et al, sin publicar). Existen muchas bacterias en las que genes responsables de los factores de virulencia tienen localización plasmídica (Gitahy et al. 2007). La técnica de curado de plásmidos es considerada como la metodología estándar para revelar si las proteínas responsables de la toxicidad bacteriana son codificadas por plásmidos (Roh et al. 2007). Por esta razón, se analizó el perfil de proteínas mediante gradiente de sacarosa de un cultivo esporulado de la cepa B. pumilus 15.1 curada. Las bandas de 17 kDa y la de 45 kDa pudieron observarse en las distintas fracciones del gradiente. Sin embargo, la banda de mayor intensidad en esta cepa, bajo estas condiciones de cultivo, fue la de ~ 45 kDa tal y como se muestra en la Figura 4.9. Al compara el perfil proteico de esta cepa con la original de B. pumilus 15.1 silvestre, se observó que el patrón de proteínas de la cepa curada de plásmidos es muy similar, y que no existen cambios significativos en la expresión de las proteínas presentes en ninguna de las fracciones del gradiente. . 76 Resultados 12% kDa M 0 1 2 3 4 5 4 5 6 7 250 150 100 75 50 37 25 20 15 15% kDa M 0 1 2 3 6 7 250 75 50 37 25 20 15 10 Figura 4.9 SDS-PAGE al 12 y 15% del gradiente de sacarosa de un cultivo con el tratamiento B de la cepa B. pumilus 15.1 curada de elementos extracromosomales, en donde carril 0 corresponde a la muestra antes del gradiente, y los carriles 1 al 7 a las diferentes fracciones resultantes del gradiente. La separación en gradiente de sacarosa y el análisis de cada una de las fracción se realizó en la cepa control de nuestros estudios de toxicidad B. 77 pumilus M1. Una observación que se puedo hacer en el transcurso de la realización del gradiente fue que tras la centrifugación bajo las mismas condiciones que las usadas con la cepa B. pumilus 15.1, no hubo formación de sedimento. La muestra no entró ni siquiera en la fracción más concentrada de la sacarosa, la fracción de 2.3 M de sacarosa. Aún así, se recogieron las fracciones y se analizaron en un gel de poliacrilamida. Como se observa en la Figura 4.10, todas las fracciones (2, 3, 4 y 5) presentaron el mismo perfil proteico, sin haber a penas proteínas en las fracciones 6 y 7. kDa M 0 1 2 3 4 5 6 7 250 150 100 75 50 37 25 20 15 Figura 4.10 SDS-PAGE al 12%. Gradiente de sacarosa de un cultivo de B. pumilus M1 con el tratamiento B, en donde carril 0 corresponde a la muestra antes del gradiente, y los carriles 1 al 7 a las diferentes fracciones resultantes del gradiente. En principio cabe pensar que el hecho de que todas las fracciones tengan el mismo perfil indica que B. pumilus M1 no excreta proteínas insolubles como lo hace B. pumilus 15.1, aunque para finalmente concluir esto haría falta optimizar las condiciones del gradiente en cuanto a concentración de las fracciones y las condiciones de la centrifugación. 78 Resultados 4.3 Observación de B. pumilus 15.1 mediante microscopía Algunas bacterias esporulantes como B. thuringiensis, P. popilliae y algunas especies de Clostridium son capaces de formar cristales proteicos en el esporangio, simultáneamente a la formación de la endospora. La formación es estos cuerpos paraesporales ha sido descrita con anterioridad en la cepa B. pumilus 15.1 en nuestro grupo de investigación (Caña-Roca 2009). Utilizando la técnica de tinción descrita en el apartado 3.2.4.1 de Materiales y Métodos, se observaron las fracciones resultantes del gradiente de sacarosa de un cultivo de B. pumilus 15.1 bajo las condiciones de un tratamiento B. Estas muestras fueron observadas mediante microscopio óptico de contraste de fase con un objetivo de 100x. En la Figura 4.11 se muestra un cultivo completo B. pumilus 15.1 totalmente esporulado, así como las fracciones resultantes de un gradiente de sacarosa. En todas las fracciones se observó la presencia de esporas, siendo la fracción 7, correspondiente al sedimento, en donde se observó el mayor número de esporas con relación al resto de las fracciones. Sin embargo, mediante esta técnica, no fue posible distinguir de manera clara cristales teñidos, tanto en las muestras de cultivo inicial como en las diferentes fracciones del gradiente. La Figura 4.11 muestra varios campos observados en el microscopio óptico de la cepa. 79 a b c d Figura 4.11 Microscopia óptica (100x). Campos generales de un cultivo de B. pumilus 15.1 (a) y diferentes fracciones resultantes de un gradiente de sacarosa, fracción 4 (b), fracción 5 (c) y fracción 7 (d) tenidas con Azul de Coomassie. Según las bases de la técnica de tinción empleada solo los cristales se tiñen completamente, presentándose como cuerpos teñidos de azul obscuro (Ammons et al. 2002), mientras que las esporas presentan un color azul más claro. La definición de estas manchas no es clara, no se distinguen formas y son de tamaño similar a las esporas. Hay predominancia de este tipo de manchas en las fracciones 4 y 5 del gradiente de sacarosa. 80 Resultados Para observar mejor las muestras y ver si hay diferencia en la producción de cuerpos paraesporales entre los tratamientos A y B del cultivo y entre la cepa silvestre y la cepa 15.1 curada de plásmidos, se llevó a cabo una observación mediante microscopia electrónica de transmisión. La presencia de cuerpos paraesporales se observó en los dos tratamientos de la cepa 15.1 como se muestra en la Figura 4.12. Se observaron cuerpos paraesporales de características similares a los cristales sintetizados por B. thuringiensis durante la esporulación. No se observó diferencia significativa en el número de cuerpos paraesporales en los tratamientos. 81 A B Figura 4.12 Campos generales de un cultivo de B. pumilus 15.1 con el tratamiento A (A) y B (B), las fechas blancas señalan las estructuras paraesporales cristalinas fuera de las células. 82 Resultados También se observó una muestra de un cultivo de la cepa B. pumilus 15.1 curada de sus plásmidos, en donde se pudo ver la presencia de cuerpos paraesporales (Figura 4.13). a b Figura 4.13 Campos generales de un cultivo de B. pumilus 15.1 curado. Las flechas blancas señalan los cristales paraesporales (a). La imagen ampliada muestra la diversidad de formas de estos cristales (b). En las Figuras 4.12 y 4.13 se puede observar la diversidad de tamaño y forma que presentan los cuerpos paraesporales en las cepas 15.1, siendo la forma predominante la cúbica. Se observa que los cristales se agrupan, formando cuerpos paraesporales de tamaños superior a la de las esporas en algunas ocasiones. En la Figura 4.14 a se muestra la inclusión cristalinas dentro de la célula y en la Figura 4.14 b y c un detalle de un de los cristales mostrando una estructura en forma de rejilla, lo que recuerda la estructura de los cristales producidos por B. thuringiensis y B. licheniformis (Yan et al. 2007). 83 a b c Figura 4.14 Detalle de los cuerpos paraesporales producidos por B. pumilus 15.1. (a) muestra la estructura cristalina dentro de la célula. (b y c) muestra los detalles de las inclusiones cristalinas en donde se aprecia un patrón de cuadriculas en el cristal. 84 Resultados 4.4 Análisis de las fracciones de un cultivo de B. pumilus 15.1 mediante Inmunoblot Dado que en el cultivo de B. pumilus 15.1 se observaron mediante microscopía la existencia de inclusiones similares a las producidas por B. thuringiensis compuestas por toxinas Cry se decidió evaluar mediante imnunodetección si esas inclusiones estaban compuestas por dichas toxinas. La electroforesis se realizó en mini-geles de poliacrilamida al 7.5% y las muestras analizadas fueron las correspondientes a la Figura 4.6 de este capítulo. En la técnica de Inmunoblot o Western se utilizó como anticuerpo el suero de ratón inmunizado con la proteína Cry1Aa1 inmunosuero obtenido en nuestro laboratorio por T. Domínguez Flores. El anticuerpo se utilizó a una dilución 1:1000. Todas las fracciones resultantes del los gradientes de sacarosa de la cepa 15.1 con los tratamientos A y B se analizaron mediante inmunoblot. Como control se utilizó el suero de ratón preinmune. Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 4.15. 85 Figura 4.15 Inmunoblot realizado utilizando antiCry1Aa como anticuerpo frente a las muestras de B. pumilus 15.1 resultantes de gradientes de sacarosa con el tratamiento A y B. El carril C+ muestra el control positivo para el anticuerpo utilizado. Las flechas indican los carriles en donde se alguna señal. Tanto las muestras del cultivo antes del gradiente (carril 0), como el sedimento resultante del gradiente (carril 7) mostraron un rastro coloreado sin ninguna banda definida (Figura 4.15). 86 Resultados Para obtener un mejor resultado se realizó una electroforesis en geles de mayor tamaño que los anteriores y al 12% de poliacrilamida. Para este inmunoblot se utilizó como anticuerpo el suero de conejo inmunizado con la proteína Cry1Aa, cedida gentilmente por el Dr. Colin Berry de la Universidad de Cardiff, en una dilución 1:2000 y como control positivo una muestra del sobrenadante solubilizado de una cepa de B. thuringiensis spp. kurstaki obtenida por T. Domínguez Flores de nuestro grupo de investigación. Las muestras utilizadas corresponden a las fracciones resultantes del gradiente de sacarosa de un cultivo de la cepa 15.1 con el tratamiento A (Figura 4.7, A). Los resultados se muestran en la Figura 4.16. M 0 1 2 3 5 7 C+ M 225 150 102 76 225 150 102 76 52 52 38 38 31 31 24 24 17 17 Figura 4.16 Inmunoblot realizado utilizando Cry1Aa como anticuerpo frente a una muestra de B. pumilus 15.1. Se analizan el cultivo antes del gradiente (carril 0) y cinco de las fracciones resultantes de gradientes de sacarosa con el tratamiento A (carriles 1, 2, 3, 5 y 7). El carril C+ es el control positivo para el anticuerpo utilizado. 87 En la Figura 4.16 se muestra el resultado del imnumoblot realizado. Se pudo observar la existencia de varias bandas tenues de ~17 kDa de tamaño en los carriles 0 y 3, una banda de ~50 kDa en el carril 0, y una banda de ~31 kDa en el carril 7. Las bandas de ~17 kDa correspondieron a una de las bandas de mayor intensidad en los geles SDS-PAGE teñidos con Coomassie Blue, las bandas de ~50 y 31 kDa son poco intensas en estos geles (Figura 4.7, A). 4.5 Solubilización de proteínas Debido a la similitud observada entre los cristales producidos por esta cepa y los cristales de δ-endotoxinas de B. thuringiensis intentó realizar una solubilización in vitro de la misma forma que se realiza en las inclusiones de B. thuringiensis (Li et al. 2004). Las fracciones utilizadas en el ensayo de solubilización fueron la fracción 2 y 6 correspondientes principalmente a las proteínas de 17 y 45 kDa respectivamente. En primera instancia se ensayó la solubilización de estas proteínas insolubles a pHs de 3, 6, 9 y 12. Los resultados se muestran en la Figura 4.17. 88 Resultados P S 3P P S 3P 3S 6P 6S 9P 6S 9P 9S 12P 12S 12P 12S 17 kDa 3S 6P 9S 42 kDa Figura 4.17 SDS-PAGE al 15%. Ensayo de solubilización a diferentes pH de las fracciones 2 y 6 de un gradiente de sacarosa de la cepa 15.1. Las letras P representan la fracción del sedimento y las letras S la fracción sobrenadante. Los dos primeros carriles de cada gel son el control sin solubilizar. El número inicial de cada letra corresponde al pH ensayado (3, 6, 9 y 12). La proteína de 17 kDa se solubilizó de forma casi total a pH 3 y mantuvo la intensidad de la banda después del tratamiento, lo que indica que no hubo problemas de degradación de la proteína tras la solubilización. La proteína de 45 kDa perdió intensidad en el tratamiento, posiblemente por un problema de degradación. De hecho, en los controles se observa, que la mera incubación a 37 °C degrada la proteína. Dicha proteína se solubilizó preferentemente a pHs 6, 9 y 12 (Figura 4.17). 89 Para estrechar el rango de solubilización óptimo para la proteína de 17 kDa, se realizó un ensayo de solubilización a pHs 1, 2, 3 y 4. Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 4.18. kDa M F2 CP CS 1P 1S 2P 2S kDa 200 200 75 50 75 50 37 37 25 25 20 20 15 15 10 10 M 3P 3S 4P 4S Figura 4.18 SDS-PAGE en acrilamida al 15%. Ensayo de solubilización de la proteína de 17 kDa a pH 1, 2, 3 y 4. El carril F2 es la muestra antes del tratamiento. La letra P representa el sedimento, la letra S el sobrenadante, la letra C el control del tratamiento y los números los diferentes pH ensayados. La proteína de 17 kDa mostró alguna solubilización a pHs comprendidos entre 1 y 3, siendo su pH óptimo 3 (Figura 4.18). La proteína de 45 kDa se solubilizó sólo de manera parcial únicamente con el tratamiento de incubación a 37ºC, aunque la solubilización fue más evidente a pH básicos. En todos los ensayos de solubilización, la intensidad de las bandas obtenidas fue muy inferior a las bandas de partida, lo que pareció indicar que el proceso de solubilización venía acompañado de un proceso de degradación proteico. Por esta razón se intentó realizar la solubilización en presencia de un inhibidor de serín proteasas (PMSF) y en presencia de un 90 Resultados coctel inhibidor de proteasas. La solubilización se realizó a pHs 9, 10, 11, 12 y 13. Los resultados se muestran en la Figura 4.19. kDa M F6 CP CS 9P 9S 10P 10S kDa 200 200 75 50 75 50 37 37 25 25 20 20 15 15 10 10 kDa M F6 CP CS 9P 9S 10P 10S M 11P 11S 12P 12S 13P 13S A kDa 200 200 75 50 75 50 37 37 25 25 20 20 15 M 11P 11S 12P 12S 13P 13S B 15 10 10 kDa kDa M F6 CP CS 9P 9S 10P 10S M 200 200 75 50 75 50 37 37 25 25 20 20 15 15 10 10 11P 11S 12P 12S 13P 13S C Figura 4.19 SDS-PAGE en acrilamida al 15%. Ensayo de solubilización de la proteína de 45 kDa a pH 9, 10, 11, 12 y 13. El carril F6 es la muestra antes del tratamiento. La letra P representa la fracción del sedimento, la letra S el sobrenadante, la letra C el control del tratamiento y los números los diferentes pH ensayados. (A) tampón de solubilización, (B) tampón de solubilización con PMSF, y (C) tampón de solubilización con coctel inhibidor de proteasas. 91 Los esfuerzos para inhibir la acción de las proteasas no consiguieron mejorar el resultado, obteniéndose una proteína mucho menos intensa en todos los sobrenadantes de todas las condiciones. Es interesante el resultado que se observó en la solubilización realizada a pH 13, ya que fue la única muestra en donde toda la proteína se solubilizó eliminándose por completo de la fracción del sedimento (Figura 4.19). 4.6 Identificación de proteínas mediante análisis de huella peptídica o finger printing. Algunas de las proteínas resueltas por SDS-PAGE fueron extraídas del gel para ser enviadas a al servicio de identificación por espectrometría tal y como se explica en el apartado 3.2.7 de Materiales y Métodos. Las bandas analizadas se muestran en la Figura 4.20. La identificación peptídica de la proteína de 37 kDa fue llevada a cabo por el Servicio de Proteómica del CBMSO, Madrid. Las proteínas de 17, 45, 60 y 250 kDa fueron analizadas en el Centro de Investigación Príncipe Felipe, de Valencia. La identificación se realizó mediante análisis de huella peptídica, que consiste en la digestión por tripsinización del polipéptido a identificar y la determinación del tamaño de los péptidos resultantes por espectrometría de masas (MALDI-TOF); y la obtención del espectro de fragmentación de uno o varios de los péptidos obtenidos en el paso anterior (técnica MS-MS) mediante espectrometría de masas (MALDI-TOF-TOF). 92 Resultados M 1 M 250 250 150 150 100 100 75 75 50 GA.6 GA.3 GA.1 250 60 37 50 45 37 25 20 37 17 25 15 20 Figura 4.20 SDS-PAGE en acrilamida al 12% de muestras de B. pumilus 15.1 analizadas mediante MALDI TOF/TOF. Carril 1 muestra de un cultivo en estado vegetativo (12 horas), los carriles GA.6, GA.3 y GA.1 corresponden a las fracciones 6, 3 y 1 del gradiente de sacarosa con el tratamiento A. Los resultados obtenidos se detallan en la Tabla 4.1. Para todos los polipéptidos analizados se detectaron proteínas con una fidelidad de identificación significativa. Sin embargo todas las proteínas analizadas presentaron un porcentaje de identidad con la proteína con la que se comparó inferior al 36%, llegando a valores más bajos que el 10 % para la proteína de 250 kDa. El porcentaje de identidad de estas proteínas con secuencias proteicas presentes en las bases de datos fue muy bajo y las identidades se produjeron no a lo largo de toda la proteína sino sólo en partes (Ver Anexos), lo cual nos 93 sugiere que no son proteínas homólogas con la del B. pumilus con el que se las compara. Tabla 4.1 Resultados de las búsquedas en base de datos utilizando el programa Mascot a partir de los espectros obtenidos por el análisis de MALDI TOF/TOF de proteínas de B. pumilus 15.1 Muestra kDa Predicción peso Da Proteína (nr. NCBI) Especie Descripción MS SC 37 ---- 157691932 B. pumilus SAFR-032 Flagelina 89* 35.4 17 19297 157692390 B. pumilus SAFR-032 Proteína hipotética BPUM_1610 143* 19 45 43580 194017930 B. pumilus ATCC 7061 Oxalato descarboxilasa 275* 19 60 58882 157691334 B. pumilus SAFR-032 Proteína A de la cubierta externa de la espora 191* 34 250 81260 194015823 B. pumilus ATCC 7061 Repetición de colágeno triple hélice 228* 9 nr. NCBI: Número de referencia en el Centro Nacional de Información sobre Biotecnología. MS: Mascot Score, se calcula como MS = -10*log(P); donde P es la probabilidad de que la identificación se produzca por azar. Es un indicador de la calidad de la identificación; un valor por debajo de 83 (NCBIn) es considerado no significativo; (*) indica resultados significativos. SC: Sequence coverage, porcentaje de veces que un segmento de proteínas está representado en la secuencia proteica de la base de datos. 94 Resultados 4.7 Actividad de las proteínas aisladas en los gradientes de sacarosa frente larvas de C. capitata La mayoría de los factores de virulencia expresados por bacterias entomopatógenas esporulantes Gram-positivas son de naturaleza proteica. Por esta razón se decidió analizar dos de las proteínas parcialmente purificadas por el método de gradiente de sacarosa evaluándolas en bioensayos con larvas de C. capitata bajo las condiciones estandarizadas por nuestro laboratorio. En los bioensayos se ensayaron las fracciones 1 y 5 de un gradiente de sacarosa de la cepa 15.1 sometido al tratamiento A (GA) y las fracciones 2 y 5 de un gradiente de sacarosa de la cepa 15.1 curada (GC), ambas fracciones correspondientes a las mismas bandas proteicas de 17 y 45 kDa respectivamente. El porcentaje de mortalidad obtenido en los bioensayos se muestra en la Figura 4.21. Se observó que la mortalidad en este bioensayo no alcanzó niveles superiores al 15% con la fracción GC.2 y 8% con la fracción GA.2, mortalidades extremadamente bajas comparadas con las obtenidas por Molina et al. (2010), donde se alcanzó una mortalidad del 94% de la población de larvas utilizando la cepa 15.1 con el tratamiento A. Parece ser que las proteínas ensayadas por independiente bajo las condiciones del ensayo, no son las responsables de dicha toxicidad. 95 Bioensayo 100 90 % de mortalidad 80 70 60 4 Dias 50 10 Dias 40 30 20 10 0 Control GA. 1 GA.5 GC.2 GC.5 Figura 4.21 Porcentaje de mortalidad en larvas de C. capitata después de 4 días (barras negras) y 10 días (barras grises) de bioensayo producidas por las fracciones GA.1, GA.5, GC.2 y GC.5 y el control positivo obtenido de los datos de Molina et al. 2010. 96 97 98 5. DISCUSIÓN 99 100 Discusión Bacillus pumilus 15.1 ha sido descrita, por nuestro grupo de investigación, como una cepa activa frente a larvas de Ceratitis capitata (Molina et al. 2010). Esta cepa despierta un gran interés científico y biotecnológico, tanto por los niveles de toxicidad que presenta para una de las plagas más destructivas de cultivos frutales a nivel mundial, como por las evidencias de que B. pumilus es un entomopatógeno, a pesar de las escasas publicaciones que revelan sus propiedades insecticidas (Heins et al. 1999; Eryurk et al. 2008; Molina et al. 2010; Yaman et al. 2010). No conocemos el factor o factores responsables de la toxicidad en la cepa 15.1, sin embargo, nuestro grupo ha obtenido evidencias de que el factor de virulencia probablemente sea de naturaleza proteica (Molina et al. 2010; Molina et al. 2011). Se sabe que la mayoría de bacterias entomopatógenas esporulantes Gram-positivas expresan una gran variedad de factores de virulencia de naturaleza proteica, las cuales son utilizadas por la bacteria para invadir, infectar y finalmente matar al insecto hospedador (de Maagd et al. 2003). De aquí surge la necesidad de caracterizar el perfil proteico de la cepa B. pumilus 15.1. Para la caracterización, el primer paso fue realizar geles SDS-PAGE para separar e identificar las proteínas presentes en el sobrenadante y sedimento de un cultivo de la cepa 15.1, y posteriormente separar las proteínas insolubles excretadas al medio de las células bacterianas mediante centrifugación del cultivo en un gradiente de sacarosa. En estado vegetativo, esta cepa presenta la producción de una banda mayoritaria de 37 kDa y con la técnica empleada para la lisis (lisozima y movimientos vibratorios) se observaron las proteínas intracelulares y de membrana. La técnica de gradiente discontinuo de sacarosa empleada para la cepa en esta fase, no sirvió para separar proteínas excretadas en ninguna de 101 las concentraciones de sacarosa empleadas (ver Figura 4.4), lo cual nos hace pensar que las proteínas sintetizadas por la cepa en este punto forman parte constituyente de las células y por eso son arrastradas con ellas al sedimento. El perfil proteico de la cepa 15.1 una vez esporulada, fue analizado con el tratamiento A y B para comparar las diferencias a nivel proteico que pueden suceder en el periodo de incubación a 4 °C durante 96 horas (tratamiento A), ya que es bajo estas condiciones donde se revela la toxicidad de la cepa (Molina et al. 2010). Los resultados de estos ensayos indicaron que tanto la fracción sobrenadante como el sedimento presentan perfiles proteicos similares en los dos tratamientos. Al realizar el gradiente de sacarosa con el sedimento, se logró la separación de diferentes proteínas en las fracciones de sacarosa, destacando proteínas de 17 kDa y 45 kDa por su mayor intensidad. Al analizar la cepa 15.1 bajo microscopia electrónica de transmisión, se encontró cuerpos paraesporales anteriormente descritos en nuestro grupo de investigación por J.F. Caña-Roca (Caña-Roca, J.F. et al, sin publicar) que morfológicamente son similares a los secretados por B. thuringiensis y B. licheniformis y que presentan una estructura en forma de rejilla muy característica (Yan et al. 2007). Las inclusiones cristalinas o cuerpos paraesporales no han sido descritas en ningún otro B. pumilus, pero se sabe que esta es una característica distintiva de muchas cepas del género Bacillus con actividad entomopatógena, además se conoce que estos cristales son de naturaleza proteica (Baumann et al. 1991; Helgason et al. 2000; de Maagd et al. 2003). La formación de estos cristales se debe a genes localizados comúnmente en plásmidos de alto peso molecular (Gitahy et al. 2007). Conocemos que la cepa 15.1 contiene por lo menos un plásmido de aproximadamente 6-8 kb y un megaplásmido. Estos elementos 102 Discusión extracromosómicos fueron eliminados en la cepa 15.1 curada (Caña-Roca, J.F. et al, sin publicar). En este trabajo se ha descrito el perfil proteico de esta cepa carente de plásmidos y la separación mediante gradiente de sacarosa de las proteínas insolubles (ver Figura 4.9). Al comparar el perfil proteico de esta cepa carente de plásmidos con la cepa silvestre, observamos que no existieron diferencias significativas en cuanto a su perfil proteico. Esta cepa fue también analizada mediante microscopía electrónica de transmisión, y se pudo observar cristales paraesporales idénticos a los de la cepa silvestre (ver Figura 4.13). Por esta razón creemos que la producción de cristales en la cepa 15.1 no está relacionada con elementos plasmídicos, sino más bien, que es codificada por elementos cromosómicos. En el caso de los genes cry o cyt, la literatura describe a la mayoría como elementos localizados en los plásmidos pero también, aunque con menos frecuencia, insertados en el propio cromosoma bacteriano (Lereclus et al. 1993). La morfología de los cristales en las cepas 15.1 es variada, siendo la forma predominante la cúbica. Hay que tener en cuenta que la diversidad de la morfología de los cristales puede deberse a diferentes estados de crecimiento de los cristales y también al ángulo seleccionado en el corte para ser visualizado mediante microscopia (Yan et al. 2007), con lo cual se puede explicar la diversidad de formas de los cristales de la cepa 15.1. Al utilizar la técnica de tinción descrita en el apartado 3.2.4.1 de Materiales y Métodos para visualización de cristales mediante microscopia óptica, no se pudo distinguir los cristales, probablemente porque los cristales al agregarse tienen un tamaño similar al de la espora. Sin embargo, si se puede decir que predominan las manchas azules, posibles cristales teñidos según la técnica (Ammons et al. 2002), en las fracciones de sacarosa 4 y 5 del gradiente. 103 Con la obtención de estos resultados barajamos la posibilidad de que el agente tóxico de la cepa 15.1 sea una proteína similar a las δ-endotoxinas. El espectro de toxicidad de algunas δ-endotoxinas puede ser más amplio de lo comúnmente establecido, por ejemplo la toxina Cry1 usualmente activa frente a lepidópteros es moderadamente tóxica para algunas especies de dípteros (Hodgman et al. 1993). Utilizando el antisuero Cry1Aa1 proporcionado por T. Domínguez-Flores de nuestro grupo de investigación, se realizaron inmunoblots para detectar proteínas Cry1Aa1 en las muestras de las fracciones de los gradientes de sacarosa de la cepa 15.1 con el tratamiento A y B. El resultado mostrado en la Figura 4.15 no evidencia bandas, sin embargo claramente se pudo ver que en los carriles 0 y 7 para ambos tratamientos, existe una señal o rastro. Se cree que al haber utilizado geles pequeños para la realización de este ensayo (geles Phast GelTM 7.5% de GE Healthcare), la muestra no fue capaz de entrar bien en los pocillos. Es por eso que se decidió probar con geles de mayor tamaño y utilizar el antisuero Cry1Aa cedido gentilmente por el Dr. Colin Berry de la Universidad de Cardiff. Los resultados obtenidos tras este ensayo mostraron señales positivas de proteínas de 50, 31 y 17 kDa aproximadamente en diferentes carriles del gel (ver Figura 4.16). Estas bandas están presentes también en geles SDS-PAGE (ver Figura 4.7). El tamaño de estas bandas no concuerda con las bandas esperadas para las proteínas Cry1, que tienen un peso molecular aproximado a 130 kDa (Soberon and Bravo 2009). Esto nos hace pensar que puede ser una δendotoxina nueva. También se sabe que las protoxinas de Cry1Aa y Cry1Ab (133 kDa) al ser sometidas a proteólisis in vitro producen hasta 7 proteínas intermediarias, hasta dar lugar a la toxina activada (57 kDa) (Mohan and Gujar 2003). Este ejemplo nos hace creer que dado que ni el cultivo ni el sedimento tiene ningún inhibidor de proteasas, las bandas observadas en los 104 Discusión inmunoblots pueden ser tanto protoxinas, toxinas activadas o intermediarios de la proteólisis de una toxina similar a Cry1Aa. Consideramos interesantes las proteínas de 17 y 45 kDa separadas mediante gradientes de sacarosa de la cepa 15.1 (ver Figura 4.7), ya que al no aparecer en la fracción sedimento son proteínas que han sido excretadas al medio por las bacterias y que posiblemente sean o se comporten como δ-endotoxinas. Considerando el mecanismo de acción de las toxinas Cry, el primer paso necesario para ejercer su actividad es la solubilización del cristal por acción del pH en el tracto intestinal del insecto. El pH del tracto intestinal de algunos dípteros varía de 7 a 8 (Chilcott et al. 1998), por lo que se considera que el pH óptimo para hacer solubilizaciones con tripsina de δ-endotoxinas es neutro o ligeramente alcalino para este género. Así, se intentó la solubilización in vitro de las proteínas de 17 y 45 kDa. La proteína de 17 kDa se solubilizó a pH ácidos entre 1 y 3, siendo 3 su pH óptimo. La proteína de 45 kDa se solubilizó con la acción de la temperatura, pero su estabilidad fue muy baja. Incluso en presencia de inhibidores de proteasas la proteína se degradó una vez fue solubilizada. Un pH extremo de 13 logró solubilizar completamente toda la proteína y eliminarla de la fracción sedimento. Estos resultados, reflejan que dichas proteínas no actúan de manera similar a las toxinas Cry descritas hasta hoy en la bibliografía. Para identificar algunas de las proteínas obtenidas en los cultivos de la cepa 15.1 con el tratamiento A, se empleó el análisis de la huella peptídica y la fragmentación MS-MS. El porcentaje de cobertura de las proteínas seleccionadas con las comparadas existentes en otros B. pumilus fue muy bajo (Secuence Coverage, ver Tabla 4.1). Esta técnica se sustenta en la búsqueda de homología con otras proteínas existentes, que ya han sido secuenciadas y publicadas en bases de datos. Esto representa un factor 105 limitante en la identificación de nuevas proteínas, es por eso que creemos que estos resultados no representan alta fiabilidad en nuestro caso. También, se bioensayó la toxicidad de las proteínas de 17 y 45 kDa frente a larvas de C. capitata. Los resultados de mortalidad obtenidos fueron muy bajos, 15 y 8% para las proteínas de 17 y 45 kDa, respectivamente; valores que son obtenidos comúnmente en laboratorio utilizando únicamente el medio de cultivo (control) (Molina et al. 2010). No descartamos la posibilidad de que una de estas proteínas sea la responsable de la toxicidad de la cepa 15.1, en combinación con otras o bajo otras condiciones. En la bibliografía se han descrito sinergismos entre toxinas Cry y Cyt, las cuales han incrementado la toxicidad de ciertas δ-endotoxina por separado (Bravo et al. 2007). También se ha descrito que las toxinas Cry y Cyt pueden ser moderadamente antagónicas (del Rincon-Castro et al. 1999; Hughes et al. 2005). Estos ejemplos nos indican que no hay una regla general de la acción única o conjunta de proteínas frente a insectos. En este trabajo se ha caracterizado el perfil proteico de la cepa 15.1, pero no se ha relacionado ninguna de las proteínas mayoritarias responsable de la muerte de las larvas de C. capitata. Barajamos varias hipótesis por las cuales no hemos podido descifrar cual es el factor proteico causante de la toxicidad en esta cepa, la primera es que hemos centrado nuestro esfuerzo en caracterizar las bandas de mayor intensidad presentadas en los geles, dejando a un lado bandas poco intensas que pueden ser los verdaderos factores tóxicos de la cepa; y la segunda es que el factor causante de la toxicidad sea un factor nuevo, todavía no descrito en la bibliografía. 106 107 108 6. CONCLUSIONES 109 110 Conclusiones De los resultados presentados en este trabajo de investigación se pueden extraer las siguientes conclusiones: 1. La técnica SDS-PAGE 1D no muestra diferencias significativas en los perfiles proteicos de la cepa 15.1 sometidas al tratamiento con frio durante 96 horas a 4 °C con respecto a los cultivos sin tratamiento, ni tampoco entre la cepa silvestre y la curada de plásmidos. 2. La técnica de gradiente de sacarosa permite separar proteínas insolubles excretadas durante la fase de esporulación de la cepa 15.1. 3. B. pumilus 15.1 produce cristales paraesporales estructuralmente similares a los producidos por las bacterias entomopatógenas Bacillus thuringiensis y B. licheniformis. 4. Las proteínas de 17 y 45 kDa, separadas mediante gradiente de sacarosa de un cultivo de B. pumilus 15.1 esporulado, no son tóxicas para larvas de C. capitata, en las condiciones ensayadas en este trabajo. 111 112 113 114 7. TRABAJO FUTURO 115 116 Trabajo futuro Este trabajo representa un avance en el estudio de la cepa Bacillus pumilus 15.1 a nivel proteico, mostrando la necesidad de seguir con la búsqueda del factor o factores de toxicidad de esta cepa frente a larvas de C. capitata y el análisis de propiedades que la hacen diferente al resto de B. pumilus descritas. Es necesario analizar en detalle los cristales producidos por esta cepa, para esto, se recomienda analizar todas las fracciones de los gradientes de sacarosa, para ver si esta técnica es capaz de retener esos cristales en alguna de las fracciones y de esta manera enviar a secuenciar las proteínas que se evidencien en esa fracción. Una estrategia planteada para seguir con este trabajo consiste en la secuenciación completa del genoma de la cepa y el análisis de las secuencias. Este análisis, en primera instancia, se centrará en la búsqueda de secuencias homólogas a toxinas ya descritas de bacterias entomopatógenas, como por ejemplo toxinas Cry, Cyt, Mtx, Bin, Vip, Sip, entre otras. Además es necesario enfocar el trabajo no solo a conocer el o los factores de toxicidad sino también el mecanismo de activación de dicha toxicidad, que hace de la cepa 15.1 una cepa con características únicas al resto de cepas conocidas de su especie. 117 118 119 120 8. BIBLIOGRAFÍA 121 122 Bibliografía 1. Agaisse, H., and Lereclus, D., 1995. How does Bacillus thuringiensis produce so much insecticidal crystal protein. J. Bacteriol. 177, 6027-6032. 2. Ahmadian, G., Degrassi, G., Venturi, V., Zeigler, D.R., Soudi, M., and Zanguinejad, P., 2007. Bacillus pumilus SG2 isolated from saline conditions produces and secretes two chitinases. J. Appl. Microbiol. 103, 1081-1089. 3. Ahmed, I., Yokota, A., Yamazoe, A., and Fujiwara, T., 2007. Proposal of Lysinibacillus boronitolerans gen. nov. sp. nov., and transfer of Bacillus fusiformis to Lysinibacillus fusiformis comb. nov. and Bacillus sphaericus to Lysinibacillus sphaericus comb. nov. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 57, 11171125. 4. Ammons, D., Rampersad, J., and Khan, A., 2002. Usefulness of staining parasporal bodies when screening for Bacillus thuringiensis. J. Invertebr. Pathol. 79, 203-204. 5. Araujo, W.L., Marcon, J., Maccheroni, W.,Jr, Van Elsas, J.D., Van Vuurde, J.W., and Azevedo, J.L., 2002. Diversity of endophytic bacterial populations and their interaction with Xylella fastidiosa in citrus plants. Appl. Environ. Microbiol. 68, 4906-4914. 6. Ariffin, H., Hassan, M.A., Shah, U.K., Abdullah, N., Ghazali, F.M., and Shirai, Y., 2008. Production of bacterial endoglucanase from pretreated oil palm empty fruit bunch by Bacillus pumilus EB3. J. Biosci. Bioeng. 106, 231236. 7. Asraful Islam, S.M., Math, R.K., Kim, J.M., Yun, M.G., Cho, J.J., Kim, E.J., Lee, Y.H., and Yun, H.D., 2010. Effect of plant age on endophytic bacterial diversity of balloon flower (Platycodon grandiflorum) root and their antimicrobial activities. Curr. Microbiol. 61, 346-356. 8. Aunpad, R., and Na-Bangchang, K., 2007. Pumilicin 4, a novel bacteriocin with anti-MRSA and anti-VRE activity produced by newly isolated bacteria Bacillus pumilus strain WAPB4. Curr. Microbiol. 55, 308-313. 9. Banerjee, S., Devaraja, T.N., Shariff, M., and Yusoff, F.M., 2007. Comparison of four antibiotics with indigenous marine Bacillus spp. in 123 controlling pathogenic bacteria from shrimp and artemia. J. Fish Dis. 30, 383389. 10. Bargabus, R.L., Zidack, N.K., Sherwood, J.E., and Jacobsen, B.J., 2004. Screening for the identification of potential biological control agents that induce systemic acquired resistance in sugar beet. Biological Control 30, 342350. 11. Basset, A., Khush, R.S., Braun, A., Gardan, L., Boccard, F., Hoffmann, J.A., and Lemaitre, B., 2000. The phytopathogenic bacteria Erwinia carotovora infects Drosophila and activates an immune response. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 3376-3381. 12. Baum, J.A., and Malvar, T., 1995. Regulation of insecticidal crystal protein production in Bacillus thuringiensis. Mol. Microbiol. 18, 1-12. 13. Baumann, P., Clark, M.A., Baumann, L., and Broadwell, A.H., 1991. Bacillus sphaericus as a mosquito pathogen: Properties of the organism and its toxins. Microbiol. Rev. 55, 425-436. 14. Benardini, J.N., Sawyer, J., Venkateswaran, K., and Nicholson, W.L., 2003. Spore UV and acceleration resistance of endolithic Bacillus pumilus and Bacillus subtilis isolates obtained from sonoran desert basalt: Implications for lithopanspermia. Astrobiology 3, 709-717. 15. Benhamou, N., Kloepper, J.W., Quadt-Hallman, A., and Tuzun, S., 1996. Induction of defense-related ultrastructural modifications in pea root tissues inoculated with endophytic bacteria. Plant Physiol. 112, 919-929. 16. Berg, G., and Hallmann, J., 2006. Control of plant pathogenic fungi with bacterial endophytes. Soil Biology 9, 53-69. 17. Berry, C., O'Neil, S., Ben-Dov, E., Jones, A.F., Murphy, L., Quail, M.A., Holden, M.T., Harris, D., Zaritsky, A., and Parkhill, J., 2002. Complete sequence and organization of pBtoxis, the toxin-coding plasmid of Bacillus thuringiensis subsp. israelensis. Appl. Environ. Microbiol. 68, 5082-5095. 18. BHATE, D.S., 1955. Pumilin, a new antibiotic from Bacillus pumilus. Nature 175, 816-817. 124 Bibliografía 19. Bode, H.B., 2009. Entomopathogenic bacteria as a source of secondary metabolites. Curr. Opin. Chem. Biol. 13, 224-230. 20. Bottone, E.J., and Peluso, R.W., 2003. Production by Bacillus pumilus (MSH) of an antifungal compound that is active against Mucoraceae and Aspergillus species: Preliminary report. J. Med. Microbiol. 52, 69-74. 21. Bravo, A., 1997. Phylogenetic relationships of Bacillus thuringiensis deltaendotoxin family proteins and their functional domains. J. Bacteriol. 179, 2793-2801. 22. Bravo, A., Gill, S.S., and Soberon, M., 2007. Mode of action of Bacillus thuringiensis cry and cyt toxins and their potential for insect control. Toxicon 49, 423-435. 23. Bravo, A., Gomez, I., Conde, J., Munoz-Garay, C., Sanchez, J., Miranda, R., Zhuang, M., Gill, S.S., and Soberon, M., 2004. Oligomerization triggers binding of a Bacillus thuringiensis Cry1Ab pore-forming toxin to aminopeptidase N receptor leading to insertion into membrane microdomains. Biochim. Biophys. Acta 1667, 38-46. 24. Bravo, A., Hendrickx, K., Jansens, S., and Peferoen, M., 1992. Immunocytochemical analysis of specific binding of Bacillus thuringiensis insecticidal crystal proteins to Lepidopteran and Coleopteran mudgut membranes. J. Invertebr. Pathol. 60, 247-253. 25. Bresolin, G., Morgan, J.A., Ilgen, D., Scherer, S., and Fuchs, T.M., 2006. Low temperature-induced insecticidal activity of Yersinia enterocolitica. Mol. Microbiol. 59, 503-512. 26. Butko, P., 2003. Cytolytic toxin Cyt1A and its mechanism of membrane damage: Data and hypotheses. Appl. Environ. Microbiol. 69, 2415-2422. 27. Calvo, C., Toledo, F.L., and Gonzalez-Lopez, J., 2004. Surfactant activity of a naphthalene degrading Bacillus pumilus strain isolated from oil sludge. J. Biotechnol. 109, 255-262. 28. Caña-Roca, J.F., 2009. Caracterización fisiológica y bioquímica de Bacillus pumilus 15.1: Una nueva cepa entomopatógena activa frente a la mosca de la fruta del Mediterráneo Ceratitis capitata (Wiedeman). 125 29. Cao, Q., Qu, Z., Wan, Y., Zhang, H., and Shen, D., 2001. Cloning, molecular characterization, and application of rice epiphytic Bacillus pumilus promoter fragments. Curr. Microbiol. 43, 244-248. 30. Carozzi, N.B., Kramer, V.C., Warren, G.W., Evola, S., and Koziel, M.G., 1991. Prediction of insecticidal activity of Bacillus thuringiensis strains by polymerase chain reaction product profiles. Appl. Environ. Microbiol. 57, 3057-3061. 31. Chilcott, C.N., Wigley, P.J., Broadwell, A.H., Park, D.J., and Ellar, D.J., 1998. Activities of Bacillus thuringiensis insecticidal crystal proteins Cyt1Aa and Cyt2Aa against three species of sheep blowfly. Appl. Environ. Microbiol. 64, 4060-4061. 32. Choudhary, D.K., and Johri, B.N., 2009. Interactions of Bacillus spp. and plants--with special reference to induced systemic resistance (ISR). Microbiol. Res. 164, 493-513. 33. Cinar, C., Apaydin, O., Yenidunya, A.F., Harsa, S., and Gunes, H., 2008. Isolation and characterization of Bacillus thuringiensis strains from oliverelated habitats in turkey. J. Appl. Microbiol. 104, 515-525. 34. Coorevits, A., De Jonghe, V., Vandroemme, J., Reekmans, R., Heyrman, J., Messens, W., De Vos, P., and Heyndrickx, M., 2008. Comparative analysis of the diversity of aerobic spore-forming bacteria in raw milk from organic and conventional dairy farms. Syst. Appl. Microbiol. 31, 126-140. 35. Costas, M., Sloss, L.L., Owen, R.J., and Gaston, M.A., 1989. Evaluation of numerical analysis of SDS-PAGE of protein patterns for typing Enterobacter cloacae. Epidemiol. Infect. 103, 265-274. 36. Cottyn, B., Debode, J., Regalado, E., Mew, T.W., and Swings, J., 2009. Phenotypic and genetic diversity of rice seed-associated bacteria and their role in pathogenicity and biological control. J. Appl. Microbiol. 107, 885-897. 37. Cottyn, B., Regalado, E., Lanoot, B., De Cleene, M., Mew, T.W., and Swings, J., 2001. Bacterial populations associated with rice seed in the tropical environment. Phytopathology 91, 282-292. 126 Bibliografía 38. Crickmore, N., Zeigler, D.R., Schnepf, E., Van Rie, J., Lereclus, D., Baum, J., Bravo, A., and Dean, D.H., 2011. Bacillus thuringiensis toxin nomenclature. 2011. 39. de Maagd, R.A., Bravo, A., Berry, C., Crickmore, N., and Schnepf, H.E., 2003. Structure, diversity, and evolution of protein toxins from spore-forming entomopathogenic bacteria. Annu. Rev. Genet. 37, 409-433. 40. de Maagd, R.A., Bravo, A., and Crickmore, N., 2001. How Bacillus thuringiensis has evolved specific toxins to colonize the insect world. Trends Genet. 17, 193-199. 41. Dehestani, A., Kazemitabar, K., Ahmadian, G., Jelodar, N.B., Salmanian, A.H., Seyedi, M., Rahimian, H., and Ghasemi, S., 2010. Chitinolytic and antifungal activity of a Bacillus pumilus chitinase expressed in Arabidopsis. Biotechnol. Lett. 32, 539-546. 42. del Rincon-Castro, M.C., Barajas-Huerta, J., and Ibarra, J.E., 1999. Antagonism between Cry1Ac1 and Cyt1A1 toxins of Bacillus thuringiensis. Appl. Environ. Microbiol. 65, 2049-2053. 43. El-Borai, F.E., Duncan, L.W., and Preston, J.F., 2005. Bionomics of a phoretic association between Paenibacillus sp. and the entomopathogenic nematode Steinernema diaprepesi. J. Nematol. 37, 18-25. 44. Errington, J., 2010. From spores to antibiotics via the cell cycle. Microbiology 156, 1-13. 45. Eryurk, Ö., Yaman, M., and Aslan, F., 2008. Effects of four Bacillus spp. of soil origin on the colorado potato beetle Leptinotarsa decemlineata (say). Entomological Research 38, 135-138. 46. Evans, J.D., 2004. Transcriptional immune responses by honey bee larvae during invasion by the bacterial pathogen, Paenibacillus larvae. J. Invertebr. Pathol. 85, 105-111. 47. Forst, S., and Nealson, K., 1996. Molecular biology of the symbioticpathogenic bacteria Xenorhabdus spp. and Photorhabdus spp. Microbiol. Rev. 60, 21-43. 127 48. From, C., Hormazabal, V., and Granum, P.E., 2007. Food poisoning associated with pumilacidin-producing Bacillus pumilus in rice. Int. J. Food Microbiol. 115, 319-324. 49. Garbeva, P., van Veen, J.A., and van Elsas, J.D., 2003. Predominant Bacillus spp. in agricultural soil under different management regimes detected via PCR-DGGE. Microb. Ecol. 45, 302-316. 50. Gioia, J., Yerrapragada, S., Qin, X., Jiang, H., Igboeli, O.C., Muzny, D., Dugan-Rocha, S., Ding, Y., Hawes, A., Liu, W., Perez, L., Kovar, C., Dinh, H., Lee, S., Nazareth, L., Blyth, P., Holder, M., Buhay, C., Tirumalai, M.R., Liu, Y., Dasgupta, I., Bokhetache, L., Fujita, M., Karouia, F., Eswara Moorthy, P., Siefert, J., Uzman, A., Buzumbo, P., Verma, A., Zwiya, H., McWilliams, B.D., Olowu, A., Clinkenbeard, K.D., Newcombe, D., Golebiewski, L., Petrosino, J.F., Nicholson, W.L., Fox, G.E., Venkateswaran, K., Highlander, S.K., and Weinstock, G.M., 2007. Paradoxical DNA repair and peroxide resistance gene conservation in Bacillus pumilus SAFR-032. PLoS One 2, e928. 51. Gitahy, P.d.M., Souza, M.T.d., Monnerat, R.G., Arrigoni, E.d.B., and Baldani, J.I., 2007. A brazilian Bacillus thuringiensis strain highly active to sugarcane borer Diatraea saccharalis (lepidoptera: Crambidae). Brazilian J. Microbiol. 38, 531-537. 52. Gonzalez, J.M.,Jr, Dulmage, H.T., and Carlton, B.C., 1981. Correlation between specific plasmids and delta-endotoxin production in Bacillus thuringiensis. Plasmid 5, 352-365. 53. Green, D.H., Wakeley, P.R., Page, A., Barnes, A., Baccigalupi, L., Ricca, E., and Cutting, S.M., 1999. Characterization of two Bacillus probiotics. Appl. Environ. Microbiol. 65, 4288-4291. 54. Grenier, A.M., Duport, G., Pages, S., Condemine, G., and Rahbe, Y., 2006. The Phytopathogen dickeya dadantii (Erwinia chrysanthemi 3937) is a pathogen of the pea aphid. Appl. Environ. Microbiol. 72, 1956-1965. 128 Bibliografía 55. Grimont, P.A.D., Jackson, T.A., Ageron, E., and Noonan, M.J., 1988. Serratia entomophila sp. nov. associated with amber disease in the new zealend grass grub costelytra zealandica. Syst. Bacteriol. 38, 1-6. 56. Hayase, N., Yano, H., Kudoh, E., Tsutsumi, C., Ushio, K., Miyahara, Y., Tanaka, S., and Nakagawa, K., 2004. Isolation and characterization of poly (butylene succinate-co-butylene adipate) -degrading microorganism. J. Biosci. Bioeng. 97, 131-133. 57. Heins, S.D., Manker, D.C., Jimenez, D.R., and Marrone, P.G., 1999. Bacillus pumilus strain for controlling corn rootworm, nematode and armyworn infestations. 08/916.847. 58. Helgason, E., Caugant, D.A., Olsen, I., and Kolsto, A.B., 2000. Genetic structure of population of Bacillus cereus and B. thuringiensis isolates associated with periodontitis and other human infections. J. Clin. Microbiol. 38, 1615-1622. 59. Hernandez, C.S., Martinez, C., Porcar, M., Caballero, P., and Ferre, J., 2003. Correlation between serovars of Bacillus thuringiensis and type I betaexotoxin production. J. Invertebr. Pathol. 82, 57-62. 60. Hill, J.E., Baiano, J.C., and Barnes, A.C., 2009. Isolation of a novel strain of Bacillus pumilus from penaeid shrimp that is inhibitory against marine pathogens. J. Fish Dis. 32, 1007-1016. 61. Hodgman, T.C., Ziniu, Y., Ming, S., Sawyer, T., Nicholls, C.M., and Ellar, D.J., 1993. Characterization of a Bacillus thuringiensis strain which is toxic to the housefly Musca domestica. FEMS Microbiol. Lett. 114, 17-22. 62. Hoult, B., and Tuxford, A.F., 1991. Toxin production by Bacillus pumilus. J. Clin. Pathol. 44, 455-458. 63. Hua, D., Ma, C., Lin, S., Song, L., Deng, Z., Maomy, Z., Zhang, Z., Yu, B., and Xu, P., 2007. Biotransformation of isoeugenol to vanillin by a newly isolated Bacillus pumilus strain: Identification of major metabolites. J. Biotechnol. 130, 463-470. 64. Hughes, P.A., Stevens, M.M., Park, H.W., Federici, B.A., Dennis, E.S., and Akhurst, R., 2005. Response of larval Chironomus tepperi (diptera: 129 Chironomidae) to individual Bacillus thuringiensis var. israelensis toxins and toxin mixtures. J. Invertebr. Pathol. 88, 34-39. 65. Inbakandan, D., Murthy, P.S., Venkatesan, R., and Khan, S.A., 2010. 16S rDNA sequence analysis of culturable marine biofilm forming bacteria from a ship's hull. Biofouling 26, 893-899. 66. Iriarte, J., Porcar, M., Lecadet, M., and Caballero, P., 2000. Isolation and characterization of Bacillus thuringiensis strains from aquatic environments in Spain. Curr. Microbiol. 40, 402-408. 67. Itoua-Apoyolo, C., Drif, L., Vassal, J.M., Debarjac, H., Bossy, J.P., Leclant, F., and Frutos, R., 1995. Isolation of multiple subspecies of Bacillus thuringiensis from a population of the european sunflower moth, Homoeosoma nebulella. Appl. Environ. Microbiol. 61, 4343-4347. 68. Jackson, T., Pearson, J., O'Callaghan, M., Mahanty, H., and Willocks, M., 1992. Pathogen to product - development of Serratia entomophila (enterobacteriaceae) as a commercial biological control agent for the new zeland grass grub (Costelytra zealandica). In: Glare, T., and Jackson, T. (Eds.), Use of pathogens in scarab pest management. Intercept, Andover, pp. 191-198. 69. Jaouadi, B., Ellouz-Chaabouni, S., Rhimi, M., and Bejar, S., 2008. Biochemical and molecular characterization of a detergent-stable serine alkaline protease from Bacillus pumilus CBS with high catalytic efficiency. Biochimie 90, 1291-1305. 70. Johnson, D.E., and McGaughey, W.H., 1996. Contribution of Bacillus thuringiensis spores to toxicity of purified cry proteins towards indianmeal moth larvae. Curr. Microbiol. 33, 54-59. 71. Johnson, D.E., Oppert, B., and McGaughey, W.H., 1998. Spore coat protein synergizes Bacillus thuringiensis crystal toxicity for the indianmeal moth. Curr. Microbiol. 36, 278-282. 72. Johnson, S.A., Jackson, S., Abratt, V.R., Wolfaardt, G.M., Cordero-Otero, R., and Nicolson, S.W., 2006. Xylose utilization and short-chain fatty acid 130 Bibliografía production by selected components of the intestinal microflora of a rodent pollinator (Aethomys namaquensis). J. Comp. Physiol. B. 176, 631-641. 73. Jones, G.W., Nielsen-Leroux, C., Yang, Y., Yuan, Z., Dumas, V.F., Monnerat, R.G., and Berry, C., 2007. A new cry toxin with a unique twocomponent dependency from Bacillus sphaericus. FASEB J. 21, 4112-4120. 74. Joung, K.B., and Côté, J.C., 2000. A review of the environmental impacts of the microbial insecticide Bacillus thuringiensis. Technical bulletin No.29. Agriculture and Agri-food Canada. Horticultural R & D Center. 75. Kaelin, P., Morel, P., and Gadani, F., 1994. Isolation of Bacillus thuringiensis from stored tobacco and Lasioderma serricorne (F.). Appl. Environ. Microbiol. 60, 19-25. 76. Kapoor, M., and Kuhad, R.C., 2007. Immobilization of xylanase from Bacillus pumilus strain MK001 and its application in production of xylooligosaccharides. Appl. Biochem. Biotechnol. 142, 125-138. 77. Karamanlidou, G., Lambropoulos, A.F., Koliais, S.I., Manousis, T., Ellar, D., and Kastritsis, C., 1991. Toxicity of Bacillus thuringiensis to laboratory populations of the olive fruit fly (Dacus oleae). Appl. Environ. Microbiol. 57, 2277-2282. 78. Kempf, M.J., Chen, F., Kern, R., and Venkateswaran, K., 2005. Recurrent isolation of hydrogen peroxide-resistant spores of Bacillus pumilus from a spacecraft assembly facility. Astrobiology 5, 391-405. 79. Krynski, S., Borowski, E., Kuchta, A., Borowski, J., and Becla, E., 1952. Studies on tetaine, a new antibiotic from theta strain of Bacillus pumilus. Biul Panstw. Inst. Med. Morsk. Trop. J. W. Gdansku 4, 301-309. 80. Kumar, A.G., Swarnalatha, S., Gayathri, S., Nagesh, N., and Sekaran, G., 2008. Characterization of an alkaline active-thiol forming extracellular serine keratinase by the newly isolated Bacillus pumilus. J. Appl. Microbiol. 104, 411-419. 81. Lehman, L., McCoy, R., Messenger, B., Manker, D., Orjala, J., Lindhard, D., and Marrone, P., 2001. Strain of Bacillus pumilus for controlling plant diseases caused by fungi. 09/281.360. 131 82. Lereclus, D., Delecluse, A., and Lecadet, M.-., 1993. Diversity of Bacillus thuringiensis toxins and genes. In: Entwistle, P.F., Cory, J.S., Bailey, M.J., and Higgs, S. (Eds.), John Wiley and Sons Ltd., Chinchester, UK, UK, pp. 3769. 83. Levinson, B.L., Kasyan, K.J., Chiu, S.S., Currier, T.C., and Gonzalez, J.M.,Jr, 1990. Identification of beta-exotoxin production, plasmids encoding betaexotoxin, and a new exotoxin in Bacillus thuringiensis by using highperformance liquid chromatography. J. Bacteriol. 172, 3172-3179. 84. Li, H., Gonzalez-Cabrera, J., Oppert, B., Ferre, J., Higgins, R.A., Buschman, L.L., Radke, G.A., Zhu, K.Y., and Huang, F., 2004. Binding analyses of Cry1Ab and Cry1Ac with membrane vesicles from Bacillus thuringiensisresistant and -susceptible Ostrinia nubilalis. Biochem. Biophys. Res. Commun. 323, 52-57. 85. Li, J., Derbyshire, D.J., Promdonkoy, B., and Ellar, D.J., 2001. Structural implications for the transformation of the Bacillus thuringiensis deltaendotoxins from water-soluble to membrane-inserted forms. Biochem. Soc. Trans. 29, 571-577. 86. Maniatis, T., Fritsch, E.F., and Sambrook, J. (Eds.), 1982. Molecular cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, United States of America. 87. Martin, P.A., and Travers, R.S., 1989. Worldwide abundance and distribution of Bacillus thuringiensis isolates. Appl. Environ. Microbiol. 55, 2437-2442. 88. McInroy, J.,A., and Kloepper, J.,W., 1995. Survey of indigenous bacterial endophytes from cotton and sweet corn. 337-342. 89. Meerak, J., Yukphan, P., Miyashita, M., Sato, H., Nakagawa, Y., and Tahara, Y., 2008. Phylogeny of gamma-polyglutamic acid-producing Bacillus strains isolated from a fermented locust bean product manufactured in west Africa. J. Gen. Appl. Microbiol. 54, 159-166. 90. Mei, X.L., Zhao, Q.Y., Tan, S.Y., Xu, Y.C., Shen, B., and Shen, Q.R., 2010. Screening, identification, and biocontrol effect of antagonistic bacteria against Phytophthora capsici. Ying Yong Sheng Tai Xue Bao 21, 2652-2658. 132 Bibliografía 91. Meyers, P.R., Gokool, P., Rawlings, D.E., and Woods, D.R., 1991. An efficient cyanide-degrading Bacillus pumilus strain. J. Gen. Microbiol. 137, 1397-1400. 92. Moallic, C., Dabonne, S., Colas, B., and Sine, J.P., 2006. Identification and characterization of a gamma-glutamyl transpeptidase from a thermoalcalophile strain of Bacillus pumilus. Protein J. 25, 391-397. 93. Mohan, M., and Gujar, G.T., 2003. Characterization and comparison of midgut proteases of Bacillus thuringiensis susceptible and resistant diamondback moth (Plutellidae: Lepidoptera). J. Invertebr. Pathol. 82, 1-11. 94. Molina, A., Caña-Roca, J.F., Dominguez, T., Osuna, A., and Vilchez, V., 2009. High activity of a Bacillus pumilus strain against Ceratitis capitata. 12th European Meeting of the IOBC/WPRS Working Group "Insect Pathogens and Insect Parasitic Nematodes". 95. Molina, C.A., Caña-Roca, J.F., Garcia, D., Dominguez, T., Osuna, A., and Vilchez, S., 2011. Understanding the toxicity of Bacillus pumilus 15.1 toward the mediterranean fruit fly (Ceratitis capitata). Insect Pathogens and Insect Parasitic Nematodes. 96. Molina, C.A., Cana-Roca, J.F., Osuna, A., and Vilchez, S., 2010. Selection of a Bacillus pumilus strain highly active against Ceratitis capitata (Wiedemann) larvae. Appl. Environ. Microbiol. 76, 1320-1327. 97. Moller, M., and Hederstedt, L., 2006. Role of membrane-bound thioldisulfide oxidoreductases in endospore-forming bacteria. Antioxid. Redox Signal. 8, 823-833. 98. Munimbazi, C., and Bullerman, L.B., 1998. Isolation and partial characterization of antifungal metabolites of Bacillus pumilus. J. Appl. Microbiol. 84, 959-968. 99. Naclerio, G., Falasca, A., Petrella, E., Nerone, V., Cocco, F., and Celico, F., 2010. Potential role of Bacillus endospores in soil amended by olive mill wastewater. Water Sci. Technol. 61, 2873-2879. 100. Naruse, N., Tenmyo, O., Kobaru, S., Kamei, H., Miyaki, T., Konishi, M., and Oki, T., 1990. Pumilacidin, a complex of new antiviral antibiotics. 133 Production, isolation, chemical properties, structure and biological activity. J. Antibiot. (Tokyo) 43, 267-280. 101. Nicholls-Estrada, C.I., 2008. Control biológico de insectos: Un enfoque agroecológico. Universidad de Antioquia, Colombia. 102. Nicholson, W.L., Munakata, N., Horneck, G., Melosh, H.J., and Setlow, P., 2000. Resistance of Bacillus endospores to extreme terrestrial and extraterrestrial environments. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 64, 548-572. 103. Nithya, C., Aravindraja, C., and Pandian, S.K., 2010. Bacillus pumilus of palk bay origin inhibits quorum-sensing-mediated virulence factors in gramnegative bacteria. Res. Microbiol. 161, 293-304. 104. Ouattara, H.G., Reverchon, S., Niamke, S.L., and Nasser, W., 2011. Molecular identification and pectate lyase production by Bacillus strains involved in cocoa fermentation. Food Microbiol. 28, 1-8. 105. Ouoba, L.I., Diawara, B., Amoa-Awua, W., Traore, A.S., and Moller, P.L., 2004. Genotyping of starter cultures of Bacillus subtilis and Bacillus pumilus for fermentation of african locust bean (Parkia biglobosa) to produce soumbala. Int. J. Food Microbiol. 90, 197-205. 106. Pirttijarvi, T.S., Graeffe, T.H., and Salkinoja-Salonen, M.S., 1996. Bacterial contaminants in liquid packaging boards: Assessment of potential for food spoilage. J. Appl. Bacteriol. 81, 445-458. 107. Plikaytis, B.D., Carlone, G.M., and Plikaytis, B.B., 1986. Numerical analysis of normalized whole-cell protein profiles after sodium dodecyl sulphatepolyacrylamide gel electrophoresis. J. Gen. Microbiol. 132, 2653-2660. 108. Porcar, M., and Juarez-Perez, V., 2003. PCR-based identification of Bacillus thuringiensis pesticidal crystal genes. FEMS Microbiol. Rev. 26, 419-432. 109. Porwal, S., Lal, S., Cheema, S., and Kalia, V.C., 2009. Phylogeny in aid of the present and novel microbial lineages: Diversity in Bacillus. PLoS One 4, e4438. 110. Priest, F.G., 1977. Extracellular enzyme synthesis in the genus Bacillus. Bacteriol. Rev. 41, 711-753. 134 Bibliografía 111. Priest, F.G., 2000. Biodiversity of entomopathogenic, endospore-forming bacteria. In: Charles, J.F., Delaecluse, A., and Roux, C.L. (Eds.), Entomopathogenic bacteria: From laboratory to field application. Netherlands, pp. 16. 112. Promdonkoy, B., and Ellar, D.J., 2003. Investigation of the pore-forming mechanism of a cytolytic delta-endotoxin from Bacillus thuringiensis. Biochem. J. 374, 255-259. 113. Ramalakshmi, A., and Udayasuriyan, V., 2010. Diversity of Bacillus thuringiensis isolated from western ghats of tamil nadu state, India. Curr. Microbiol. 61, 13-18. 114. Rasool, S., Johri, S., Riyaz-ul-Hassan, S., Maqbool, Q.U., Verma, V., Koul, S., Taneja, S.C., and Qazi, G.N., 2005. Molecular cloning of enantioselective ester hydrolase from Bacillus pumilus DBRL-191. FEMS Microbiol. Lett. 249, 113-120. 115. Reiss, R., Ihssen, J., and Thony-Meyer, L., 2011. Bacillus pumilus laccase: A heat stable enzyme with a wide substrate spectrum. BMC Biotechnol. 11, 9. 116. Reynaldi, F.J., De Giusti, M.R., and Alippi, A.M., 2004. Inhibition of the growth of ascosphaera apis by Bacillus and Paenibacillus strains isolated from honey. Rev. Argent. Microbiol. 36, 52-55. 117. Roh, J.Y., Choi, J.Y., Li, M.S., Jin, B.R., and Je, Y.H., 2007. Bacillus thuringiensis as a specific, safe, and effective tool for insect pest control. J. Microbiol. Biotechnol. 17, 547-559. 118. Ryu, C.M., Hu, C.H., Reddy, M.S., and Kloepper, J.W., 2003. Different signaling pathways of induced resistance by rhizobacteria in Arabidopsis thaliana against two pathovars of pseudomonas syringae. New Phytologist 413-420. 119. Schnepf, E., Crickmore, N., Van Rie, J., Lereclus, D., Baum, J., Feitelson, J., Zeigler, D.R., and Dean, D.H., 1998. Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62, 775-806. 120. Sharma, D.C., and Satyanarayana, T., 2006. A marked enhancement in the production of a highly alkaline and thermostable pectinase by Bacillus 135 pumilus dcsr1 in submerged fermentation by using statistical methods. Bioresour. Technol. 97, 727-733. 121. Shehata, A.E., Magdoub, M.N., Sultan, N.E., and El-Samragy, Y.A., 1983. Aerobic mesophilic and psychrotrophic sporeforming bacteria in buffalo milk. J. Dairy Sci. 66, 1228-1231. 122. Shida, O., Takagi, H., Kadowaki, K., and Komagata, K., 1996. Proposal for two new genera, Brevibacillus gen. nov. and Aneurinibacillus gen. nov. Int. J. Syst. Bacteriol. 46, 939-946. 123. Siefert, J.L., Larios-Sanz, M., Nakamura, L.K., Slepecky, R.A., Paul, J.H., Moore, E.R., Fox, G.E., and Jurtshuk, P.,Jr, 2000. Phylogeny of marine Bacillus isolates from the gulf of Mexico. Curr. Microbiol. 41, 84-88. 124. Silva, M.T., Espirito Santo, F., Pereira, P.T., and Roseiro, J.C., 2006. Phenotypic characterization of food waste degrading Bacillus strains isolated from aerobic bioreactors. J. Basic Microbiol. 46, 34-46. 125. Skerman, V., McGowan, V., and Sneath, P.H.A. (Eds.), 1989. Approved lists of bacterial names (ameneded). Copyright (c) 1989, ASM Press. 126. Smirnova, T.A., Minenkova, I.B., Orlova, M.V., Lecadet, M.M., and Azizbekyan, R.R., 1996. The crystal-forming strains of Bacillus laterosporus. Res. Microbiol. 147, 343-350. 127. Soberon, M., and Bravo, A., 2009. Bacillus thuringiensis y sus toxinas insecticidas. Instituto Nacional de Tecnología Industrial INTI 16/06/2011. 128. Soberon, M., Gill, S.S., and Bravo, A., 2009. Signaling versus punching hole: How do Bacillus thuringiensis toxins kill insect midgut cells? Cell Mol. Life Sci. 66, 1337-1349. 129. Steinberg, T.H., 2009. Protein gel staining methods: An introduction and overview. Methods Enzymol. 463, 541-563. 130. Sun, Y.Z., Yang, H.L., Ma, R.L., and Lin, W.Y., 2010. Probiotic applications of two dominant gut Bacillus strains with antagonistic activity improved the growth performance and immune responses of grouper Epinephelus coioides. Fish Shellfish Immunol. 29, 803-809. 136 Bibliografía 131. Swiecicka, I., Fiedoruk, K., and Bednarz, G., 2002. The occurrence and properties of Bacillus thuringiensis isolated from free-living animals. Lett. Appl. Microbiol. 34, 194-198. 132. Tena, D., Martinez-Torres, J.A., Perez-Pomata, M.T., Saez-Nieto, J.A., Rubio, V., and Bisquert, J., 2007. Cutaneous infection due to Bacillus pumilus: Report of 3 cases. Clin. Infect. Dis. 44, e40-2. 133. Thomas, P., 2004. Isolation of Bacillus pumilus from in vitro grapes as a longterm alcohol-surviving and rhizogenesis inducing covert endophyte. J. Appl. Microbiol. 97, 114-123. 134. Thomas, W.E., and Ellar, D.J., 1983. Bacillus thuringiensis var israelensis crystal delta-endotoxin: Effects on insect and mammalian cells in vitro and in vivo. J. Cell. Sci. 60, 181-197. 135. Todar, K., 2006. The genus Bacillus. The genus Bacillus. Todar's online textbook of bacteriology. University of Wisconsin-Madison, Department of Bacteriology, Madison. 136. Toledo, F.L., Calvo, C., Rodelas, B., and Gonzalez-Lopez, J., 2006. Selection and identification of bacteria isolated from waste crude oil with polycyclic aromatic hydrocarbons removal capacities. Syst. Appl. Microbiol. 29, 244252. 137. Travers, R.S., Martin, P.A., and Reichelderfer, C.F., 1987. Selective process for efficient isolation of soil Bacillus spp. Appl. Environ. Microbiol. 53, 1263-1266. 138. Udaya Shankar, A.C., Chandra Nayaka, S., Niranjan-Raj, S., Bhuvanendra Kumar, H., Reddy, M.S., Niranjana, S.R., and Prakash, H.S., 2009. Rhizobacteria-mediated resistance against the blackeye cowpea mosaic strain of bean common mosaic virus in cowpea (Vigna unguiculata). Pest Manag. Sci. 65, 1059-1064. 139. van Emden, H.F., and Service, M.W., 2004. Pest and vector control. Cambridge University Press. 140. Wang, H.Y., Liu, D.M., Liu, Y., Cheng, C.F., Ma, Q.Y., Huang, Q., and Zhang, Y.Z., 2007. Screening and mutagenesis of a novel Bacillus pumilus 137 strain producing alkaline protease for dehairing. Lett. Appl. Microbiol. 44, 16. 141. Westermeier, R., 2006. Sensitive, quantitative, and fast modifications for coomassie blue staining of polyacrylamide gels. Proteomics 6 Suppl 2, 61-64. 142. Wirth, P.J., and Romano, A., 1995. Staining methods in gel electrophoresis, including the use of multiple detection methods. J. Chromatogr. A 698, 123143. 143. Wu, Q., Li, C., Li, C., Chen, H., and Shuliang, L., 2010. Purification and characterization of a novel collagenase from Bacillus pumilus col-J. Appl. Biochem. Biotechnol. 160, 129-139. 144. Xu, Z.H., and Tao, W.Y., 2005. Identification and mode of action of a xylanase. A purified from the culture filtrate of Bacillus pumilus WL-11. Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao 21, 407-413. 145. Yaman, M., Erturk, O., and Aslan, I., 2010. Isolation of some pathogenic bacteria from the great spruce bark beetle, Dendroctonus micans and its specific predator, Rhizophagus grandis. Folia Microbiol. (Praha) 55, 35-38. 146. Yan, M., Roehrl, M.H., and Wang, J.Y., 2007. Discovery of crystalline inclusions in Bacillus licheniformis that resemble parasporal crystals of Bacillus thuringiensis. Can. J. Microbiol. 53, 1111-1115. 147. Zaidi, M.A., Mohammadi, M., Postel, S., Masson, L., and Altosaar, I., 2005. The bt gene cry2Aa2 driven by a tissue specific ST-LS1 promoter from potato effectively controls Heliothis virescens. Transgenic Res. 14, 289-298. 148. Zhang, S., Moyne, A.L., Reddy, M.S., and Kloepper, J.W., 2002. The role of salicycil acid in induced systemic resistance elicited by plant growthpromoting rhizobacteria against blue mold of tobacco. Biological Control 25, 288-296. 149. Zhang, Z.H., Tian, W., Liu, D.Y., Liu, Y.C., Shen, Q.R., and Shen, B., 2010. Characterization of a cryptic plasmid pPZZ84 from Bacillus pumilus. Plasmid 64, 200-203. 138 139 140 ANEXOS 141 Anexos Análisis e identificación de proteínas por MALDI-TOF Proteína de 37 kDa Análisis realizado por el Servicio de Proteómica del CBMSO, Madrid. 143 Proteína de 17 kDa Análisis realizado por el Centro de Investigación Príncipe Felipe, Valencia. Anexos Proteína de 45 kDa Análisis realizado por el Centro de Investigación Príncipe Felipe, Valencia. 145 Proteína de 60 kDa Análisis realizado por el Centro de Investigación Príncipe Felipe, Valencia. Anexos Proteína de 250 kDa Análisis realizado por el Centro de Investigación Príncipe Felipe, Valencia. 147
