Estudio de ADN en sangre materna

DIAGNÓSTICO A TRAVÉS DEL ADN
FETAL EN SANGRE MATERNA
Sebastián Manzanares Galán, Mª Dolores Moreno Martínez, Alicia Pineda
Lloréns y Alicia Jiménez Cobo.
INTRODUCCIÓN
El diagnostico prenatal de trastornos genéticos en el feto tiene su origen
hace más de 40 años cuando se comenzaron a cultivar células del feto
obtenidas
por amniocentesis. Desde entonces, este procedimiento se ha
extendido por todo el mundo y se ha utilizado para análisis cromosómicos,
enzimáticos y, más recientemente, moleculares, a partir de las 14 semanas de
gestación. La biopsia de vellosidades coriales en la década de los 80, aportó
una nueva vía para obtener información sobre la dotación cromosómica del
feto, con la ventaja de realizarse en el primer trimestre de gestación.
Actualmente la principal indicación de diagnóstico prenatal surge del cribado
prenatal de anomalías cromosómicas (marcadores fetales ecográficos y
bioquímicos en sangre materna) que estima el riesgo de aneuploidías en el
feto, siendo las enfermedades monogénicas una indicación menos frecuente.
El Diagnóstico Prenatal invasivo es así el método estándar para la
detección de numerosos congénitos en el feto durante la gestación. Sin
embargo, tanto la amniocentesis como la biopsia de vellosidades coriales son
procedimientos asociados a un riesgo de pérdida del embarazo del 1%
aproximadamente (0,3-2)%. Debido a estos riesgos, el diagnóstico prenatal no
invasivo está obteniendo tremendo interés entre los investigadores, y se estan
desarrollando métodos con alta fiabilidad aunque aún no se ha extendido su
aplciación a la población general.
Se denomina Diagnóstico Prenatal No Invasivo al estudio de
características genéticas del feto a través de material obtenido de la sangre
materna. Los dos abordajes actuales del problema son el estudio de ADN libre
en la circulación materna y la manipulación de células fetales completas.
ADN LIBRE FETAL EN SANGRE MATERNA
En 1997 el grupo de Lo y cols.1 describió, por primera vez, la existencia
de ADN fetal circulante en la sangre materna. Este descubrimiento abrió una
nueva puerta en el campo del diagnóstico prenatal no invasivo ya que hasta
entonces todos los esfuerzos de los diferentes grupos de investigación
implicados en este campo se habían centrado en el asilamiento de células
fetales en sangre materna sin éxito.
Actualmente se sabe que, durante el embarazo y aumentando con las
semanas de gestación, del 4 al 10% del ADN total libre en el plasma materno
tiene origen fetal (probablemente placentario) 2 . Este ADN, procedente de la
apoptosis de células fetales, puede detectarse en plasma materno a partir de la
5ª semana de gestación3. Su vida media es muy corta (16 minutos) debido al
aclaramiento materno, por lo que ofrece información a tiempo real y
desaparece de la circulación materna algunas horas después del parto4.
Para llevar a cabo un diagnóstico prenatal exacto es necesario distinguir
el ADN fetal del materno, lo cual no siempre es fácil. El método más fiable es
identificar secuencias de ADN únicas para el cromosoma Y1,2 y por tanto
exclusivas del feto, aunque esto limita el diagnóstico a fetos de sexo varón.
Otro método es identificar fragmentos de ADN asociados a características
heredadas del padre que no estarían presentes en la circulación materna si la
madre no las padece. El análisis de alelos que el feto heredó de la madre es
más problemático. Algunas técnicas propuestas son la identificación mediante
la metilación diferente en el tejido materno con respecto al tejido fetoplacentario
(hipometilado) 5,6 o las diferencias en su longitud, ya que los fragmentos de
ADN fetales en la circulación materna son más cortos7.
La técnica estándar para el estudio del ADN fetal es la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR). Actualmente se dispone de técnica de PCR
digital que permite la realización de múltiples análisis de PCR en paralelo8,
siendo de gran utilidad para el diagnóstico prenatal en casos en los que es
necesaria una mayor sensibilidad, como cuando se busca una trisomía 21,
aunque ello implica numerosas reacciones de PCR que llevar a cabo
incrementando por tanto los costes. Otras técnicas empleadas son la
espectroscopia de masa de diferentes alelos de ARNm, enriquecimiento de
ADN fetal o secuenciación de alto rendimiento genético de células libres de
ADN en suero materno que identifica la concentración relativa de cromosomas
específicos fetales9.
El estudio del ADN fetal libre está establecido en el diagnóstico del sexo
fetal, y se considera de utilidad en el diagnóstico prenatal de
enfermedades
genéticas
recesivas
ligadas
al
sexo
(Hemofilia,
Enfermedad de Duchenne, etc.), el Rh del feto y el manejo de la
enfermedad hemolítica perinatal, y algunas otras enfermedades
monogénicas como beta Talasemia, acondroplasia, etc.
Sus principales limitaciones son pequeños porcentajes de falsos
negativos debido a la incapacidad de extraer en algunas ocasiones el ADN
fetal de la sangre materna, y, al estar muy fragmentado, resulta técnicamente
complejo proporcionar suficiente información genética para el diagnóstico de
anomalías cromosómicas, así como de enfermedades heredadas de la madre.
Se ha descrito una disminución del porcentaje de ADN fetal a medida que
aumenta el peso materno10.
CÉLULAS FETALES COMPLETAS EN SANGRE MATERNA
El estudio de células fetales completas tiene la ventaja de aportar una
información genética completa y detallada del feto, tanto del núcleo como del
citoplasma, especialmente útil para el diagnóstico de aneuploidías y en general
de cualquier anomalía que pudiera diagnosticarse en el adulto11.
Sin embargo existen algunas dificultades. Las células fetales en sangre
materna lo están en número reducido (0.0035%-0.008%), y la principal
dificultad radica en la separación de las células maternas, para su posterior
cultivo in vitro.
La presencia de células fetales en sangre materna es conocida desde
1.893 en que se describió la presencia de células multinucleadas del
sincitiotrofoblasto en tejido pulmonar de una mujer embarazada que murió de
eclampsia12 (9). Desde entonces, en el torrente circulatorio de la madre se han
descrito además de células trofoblásticas, linfocitos, eritroblastos primitivos y
células madre hematopoyéticas.
Por sus características, el eritroblasto fetal primitivo es el candidato ideal
para el diagnóstico prenatal no invasivo en el primer trimestre: Se trata de una
célula nucleada, por lo que contiene la información genética del feto, no se
encuentra en la sangre de adultos sanos, pero sí en sangre fetal a partir de la
semana octava de gestación, y su corta vida media (aproximadamente 30
días), hace improbable el aislamiento de eritroblastos de embarazos previos.
No obstante, el procedimiento de selección y manipulación para proporcionar
un número adecuado de células aún es un tema no resuelto y los intentos de
resolverlo no han sido satisfactorios hasta el momento13,14,15,16.
El análisis de estas células implica tres pasos fundamentales:
Enriquecimiento celular, aislamiento celular y detección y caracterización
genética y fenotípica celular: El enriquecimiento celular suele realizarse
mediante la aplicación de gradientes de densidad como es el caso del ficoll o el
percoll,
tanto
uno
como
otro
implica
pérdida
celular,
al
introducir
centrifugaciones y lavados post-enriquecimiento. Teniendo en cuenta que una
de las principales limitaciones de este estudio es el número de células, la
aplicación de este paso agrava el problema. Otra forma de enriquecimiento es
la utilización de tampones de lisis, pero estos pueden terminar dañando
también a los eritroblastos. El aislamiento celular se basa fundamentalmente
en la aplicación de “fortín celular” dependiente de marcajes magnéticos
(MACS) o de fluorescencia (FACS). El principal problema que presentan es que
ambos necesitan un paso previo de enriquecimiento y que ambos necesitan la
combinación con anticuerpos específicos de las células de interés (selección
positiva), o la utilización de un proceso de selección negativa, aislando las
células que no son de interés, para, posteriormente desecharlas El problema
es, que las células positivas para el estudio al encontrarse en menor
proporción, pueden quedar retenidas entre las células negativas ,mucho más
abundantes.
No obstante, dentro de estos dos procesos, el método basado en la
tecnología MACS, es más sensible y eficiente y no necesita una alta
especialización, siendo un método reproducible y no excesivamente caro. La
detección y caracterización es dependiente directamente de los dos pasos
anteriores, y está además supeditado a la existencia de marcadores
específicos de estas células.
Por todo ello, tras muchos años de investigación, el aislamiento de
células fetales en sangre materna prácticamente se ha descartado debido a su
escasez como un fenómeno biológico aceptado, y aún dificultad no se ha
solventado
eficazmente
con
los
métodos
disponibles.
Sin
embargo,
recientemente se ha propuesto una nueva metodología basada en el
aislamiento por tamaño de células de origen fetal, ya que los eritroblastos
fetales presentan un tamaño especifico que les permite quedar retenidos en un
sistema de filtros. Este sistema presenta la ventaja de eliminar el paso previo
de enriquecimiento, lo que podría proporcionar una mayor sensibilidad, y por
tanto un mayor índice de recogida celular, y ofrecer así resultados
prometedores.
APLICACIONES PARA EL DIAGNÓSTICO PRENATAL
Determinación del sexo fetal:
Esta es la primera aplicación y la más sencilla de la tecnología de
análisis de ADN fetal en sangre materna. Existen varias secuencias de ADN
específicas del cromosoma Y que permiten la determinación del sexo fetal ya
desde la semana 7 de gestación, con una fiabilidad cercana al 100 % a partir
de la semana 10ª17,18. Mediante la prueba de la PCR para estas secuencias en
sangre materna podemos determinar el sexo fetal: si la secuencia del
cromosoma Y están presente, el feto es de sexo masculino; y en su defecto, se
presume que el feto es de sexo femenino.
El conocimiento del sexo fetal, amen de información de tipo social, es
especialmente útil como paso inicial en el diagnóstico prenatal de
enfermedades ligadas al cromosoma X, como la hemofilia, la distrofia muscular
de Duchenne o el síndrome de X frágil entre otros. En estos casos, las mujeres
portadoras con feto femenino no deben someterse a pruebas invasivas ya que
un feto femenino o bien no se verá afectado por la enfermedad o será un
portador asintomático de la mutación. Por otro lado, si el feto es masculino,
existe una probabilidad del 50 % de que sea portador de la enfermedad por lo
que se podrán ofertar pruebas invasivas para el diagnostico prenatal a la
gestante si así lo desea.
Por otro lado, el conocimiento del sexo fetal también es útil en el
tratamiento de los embarazos en los que el feto está en riesgo de desarrollar
hiperplasia suprarrenal congénita. Si el feto es de sexo femenino puede
desarrollar ambigüedad genital y/o virilización genital, que se puede prevenir
mediante la administración de dexametasona a la madre durante el embarazo.
Si el feto se sabe que es masculino, la terapia con esteroides puede omitirse,
evitándose de este modo sus efectos secundarios y complicaciones.
Datos de revisión recientes
19
indican que la sensibilidad para el
diagnóstico aumenta con la edad gestacional (tabla 1)
Tabla 1. Capacidad de diagnóstica de los test no invasivos de
determinación del sexo fetal en función de la semana de gestación
Edad gestacional
Sensibilidad
Especificidad
< 7 semanas
74,5 %
99,1 %
7-12 semanas
94,8 %
98,9 %
13-20 semanas
95,5 %
99,1%
>20 semanas
99%
99,6%
Determinación del genotipo fetal Rh:
El antígeno D está presente aproximadamente en el 80 % de la
población caucásica (Rh positivo, y es causante de un cuadro de
isoinmunización cuando sangre el feto D+ se ponen en contacto con una madre
D-. Actualmente esta respuesta inmunológica se trata de forma preventiva
mediante la administración a la madre de gammaglobulinas anti-D de forma
sistemática al inicio del tercer trimestre, tras el parto en casos de recién nacido
de grupo positivo, y siempre que se produzca alguna situación de contacto
potencial de sangre materna y fetal (sangrado, procedimiento invasivo, etc.).
Esta estrategia preventiva ha minimizado la incidencia de enfermedad
hemolítica del recién nacido de un 5 % a menos de 1 / 200 fetos de madre Rh
negativa20. Pero sin embargo se estima que aproximadamente el 40 % de las
madres Rh negativo reciben gammaglobulina de forma innecesaria debido que
sus fetos son también Rh negativo y no es posible la inmunización anti-D.
La minimización de la administración innecesaria de gammaglobulina
anti-D no sólo tendría un beneficio económico evidente (cada dosis tiene un
coste de 30 €), sino que hay que olvidar que se trata de un material biológico
procedente de donantes vivos, y no es descartable la transmisión de
infecciones no conocidas en este momento.
La determinación no invasiva del Rh fetal mediante el estudio de ADN
fetal en sangre materna aporta la solución a este problema. Por otra parte, los
fetos de madres ya inmunizadas son sometidos a un programa de vigilancia en
Unidades de Medicina Fetal que incluyen realización de cordocentesis y
valoración periódica de la velocidad pico en arteria cerebral media para la
detección de la anemia fetal. En casos de fetos Rh negativo, este seguimiento
no sería necesario.
El procedimiento de laboratorio es similar al que se usa para determinar
el sexo fetal, y actualmente tiene una amplia utilización clínica tanto en Estados
Unidos como en Europa, con cifras de sensibilidad y especificidad entre el 95 y
el 100%21, habiéndose extendido también la técnica al primer trimestre22. Sin
embargo, aún no se ha dado el paso para sustituir la administración sistemática
de gammaglobulina en el embarazo por esta determinación a todas las
gestantes, aunque la prueba ha demostrado gran fiabilidad clínica23,24.
Detección de enfermedades monogénicas:
El diagnóstico prenatal no invasivo de trastornos monogénicos se limita
a la detección de mutaciones heredadas del padre, que no estarían presentes
en el genoma materno.
Para enfermedades autosómicas dominantes, el diagnóstico depende
únicamente de la identificación de este alelo paterno. Cuando el padre padece
la enfermedad, la detección en sangre materna del alelo responsable de la
misma significa que el feto también estará afecto por la enfermedad. Algunas
enfermedades autosómicas dominantes que han sido detectadas utilizando
ADN fetal en sangre materna incluyen la enfermedad de Huntington 25 , la
distrofia miotónica26, y la acondroplasia27.
Cuando la madre es la que padece la enfermedad, el diagnóstico fetal
no invasivo no es posible ya que los ácidos nucleicos fetales derivados de
alelos maternos no pueden distinguirse de los ácidos nucleicos maternos.
En el caso de enfermedades autosómicas recesivas en los que sólo uno
de los progenitores es portador de la mutación, no es necesario realizar
pruebas fetales pues el feto no padecerá la enfermedad. En las parejas en que
ambos son portadores heterocigotos para el gen mutado sí existe riesgo de
tener en su descendencia un hijo con la enfermedad, el alelo paterno mutado
puede ser investigado en el plasma de la embarazada. La ausencia de la
mutación paterna en ADN fetal descarta que el feto esté afectado de la
enfermedad en estudio. Si la mutación paterna está presente, no puede
diferenciarse si se trata de un feto afectado o portador, por ello estudios más
recientes han desarrollado técnicas de secuenciación para detectar un feto
homocigoto en una madre heterocigota para un determinado gen, sobre la
base de que la proporción entre gen anormal/normal se eleva28.
Detección de aneuploidías fetales:
En general, en las trisomías 1329 y 2130 se incrementan los niveles de
ADN fetal en la circulación materna, hecho que no ocurre en la trisomía 1829.
Pero, dado que el ADN fetal se pierde entre el ADN materno que es mucho
más abundante, una estrategia más eficaz para detectar ese ADN fetal es
buscar los genes que se acompañan de ARNm especifico del cromosoma 21
placentario. Para este propósito se emplea la secuencia PLAC4 del ARNm, y
se mide la relación entre la cantidad de los distintos alelos del ARNm en la
circulación sanguínea materna. El feto lleva un cromosoma 21 de cada
progenitor y, por lo tanto, un feto normal (disomía 21) debe generar cantidades
iguales de los dos alelos. Una proporción de 2:1 o 1:2 sugiere trisomía. Con
este enfoque en un estudio realizado en 2007 se identificaron 9 de cada 10
casos de síndrome de Down y se excluyeron 55 de 57 controles sanos31.
Otra forma de detectar la trisomía es aprovechar la diferencia en la
metilación del ADN entre los genes maternos y fetales. Uno de los genes del
cromosoma 18, el SERPINB5, está hipometilado en la placenta e hipermetilado
en la sangre materna. Si se analizan los alelos hipometilados se puede
distinguir a los fetos euploides de los fetos con trisomía9,32.
La tecnología disponible hasta el momento que ha demostrado ser más
fiable es la secuenciación masiva en paralelo (MPS), una técnica en la que se
secuencian los segmentos cortos de ADN libre del suero materno, analizando
millones de moléculas y calculando la distribución de ADN, materno y fetal, en
el plasma materno9,32.
En los últimos dos años se han publicado al menos 11 estudios que
analizan el rendimiento del diagnóstico de aneuploidía en poblaciones de alto
riesgo10,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44. En todos ellos se establece que ya desde las
10 semanas de gestación se puede detectar con fiabilidad la trisomía 21 en
embarazos únicos en poblaciones de alto riesgo con alta sensibilidad y
especificidad. La trisomía 18 y 13 también se pueden detectar pero con menor
exactitud. Recientemente se ha demostrado también que estos test pueden
realizarse en gestaciones de bajo riesgo, también con altos niveles de
sensibilidad y especificidad45,46,47 (Tabla 2).
Actualmente
hay
varios
kits
comercializados
con
certificación
internacional con excelente sensibilidad y especificidad, pero con mínimo
riesgo de falso positivo, por lo que los laboratorios recomiendan la confirmación
del resultado positivo mediante pruebas invasivas.
Aún no existe evidencia suficiente de la utilización de este técnica para
identificar otras aneuploidías menos comunes y mosaicismos con una
sensibilidad suficiente, y se necesitan más estudios al respecto.
Tabla 2: Resumen de los estudios de diagnostico prenatal usando ADN
fetal en sangre materna desde 2011
PUBLICACIÓN
N CARIOTIPO
ANORMAL
T 21
T 18
RESULTADOS
T 13
T 21
T 18
T 13
GESTACIONES ÚNICAS DE ALTO RIESGO
Palomaki33 (2011)
212
Palomaki34 (2012)
Sehnert35 (2011)
13
Ehrich36 (2011)
Chiu38 (2011)
59
12
8
1
Sens
Espec
98.6 %
99.8%
100 %
100 %
39
100 %
99.7 %
86
100 %
97.9 %
Sens
Espec
Sens
Espec
100%
99.7%
91.7 %
99.03%
100 %
100 %
Bianchi (2012)
37
89
36
14
100%
100 %
97.2 %
100 %
78.6 %
100 %
Ashoor (2012)
10
50
50
10
100%
100 %
98 %
100 %
80 %
99,95 %
43
36
8
100%
99,2 %
100 %
99,2 %
91,9 %
98 %
100 %
98,9 %
80%
99,9%
100%
100 %
Sparks (2012)
48
Chen (2011)
42
Norton (2012)
37
81
25
38
100%
99,97 %
97.4 %
99,9 %
GESTACIONES UNICAS DE BAJO RIESGO
46
Nicolaides (2012)
45
Dan (2012)
8
2
100%
99,9 %
66 %
99,9 %
139
41
100%
99,96 %
100 %
99,96 %
47
Ashoor (2012)
15
GESTACIONES MÚLTIPLES
49
Lau (2012)
1*
100%
5*
1*
100%
2**
1*
35
Sehnert (2011)
100%
1**
* Gemelos discordantes ** Gemelos concordantes
50
Canick (2012)
100 %
100 %
100 %
Diversas entidades internacionales, entre las que se encuentra la
Sociedad Internacional de Diagnóstico Prenatal (ISPD) y la Sociedad Nacional
de Consejeros Genéticos de los Estados Unidos (NSGC), sustentan que esta
prueba no es diagnóstica, y aunque constituye probablemente el test de
cribado más exacto que existe, no sustituye al gold standard, es decir, el
cariotipo fetal39, 51 . Aún esta por determinar su integración en los diversos
programas de cribado. Sin embargo en ningún caso debe sustituir a la
realización de ecografía de primer trimestre para la evaluación de la anatomía
fetal y búsqueda de marcadores de otras alteraciones como preeclampsia, CIR,
parto pretérmino, etc52.
Detección de otras complicaciones fetales:
El conocimiento de la concentración de ADN fetal en embarazos sanos
ha permitido estudiar sus variaciones en embarazos patológicos. La magnitud
de la transfusión feto-materna de células y ADN es un indicador del estado de
la placenta, habiéndose observado que un nivel elevado de células y ADN fetal
en la circulación materna se asocia con una disrupción de la barrera
placentaria y complicaciones del embarazo. Dado que la principal fuente de
ADN fetal son las células trofoblásticas, es lógico que los niveles del mismo en
plasma materno se encuentren elevados en patologías placentarias con
procesos de apoptosis aumentados y áreas de infarto.
Así, se han detectado aumentos cuantitativos significativos de ADN fetal
en plasma materno en asociación con desprendimiento de la placenta 53 ,
preeclampsia 54,55,56 , trabajo de parto prematuro 57 , hiperemesis gravídica 58 y
polihidramnios59.
CONCLUSIONES
•
El ADN fetal libre se pueden detectar en la sangre materna desde el primer
trimestre de gestación. Se elimina de forma rápida tras el parto.
•
La mayoría de las pruebas no invasivas de detección de ADN fetal se basan
en la detección de alelos heredados del padre que no están presentes en el
genoma materno.
•
Se han desarrollado test comerciales para el diagnóstico del sexo y también
para pruebas de paternidad en sangre de la madre. Esta información es útil
en fetos que están en riesgo de padecer enfermedades ligadas al
cromosoma X o en casos en los que hay antecedentes familiares de
hiperplasia suprarrenal congénita.
•
La utilización de estas pruebas no invasivas en mujeres Rh negativas
permitiría evitar la administración innecesaria de inmunoglobulina y realizar
una vigilancia del embarazo como en las mujeres isoinmunizadas en el caso
de que el feto también sea Rh negativo.
•
El papel de las pruebas no invasivas para la trisomía 21, trisomía 18 y la
trisomía 13 en la práctica clínica está evolucionando. Actualmente se
realizan pruebas no invasivas a modo de screening con sensibilidad por
encima del 95% y falsos positivos del 0,1%. Los casos positivos deben
confirmarse con procedimiento invasivo.
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