antecedentes - tesis.uson.mx

ANTECEDENTES
Ferritina
Ferritina es un heteropolímero compuesto por 24 subunidades de 2 tipos, la
subunidad pesada (H) y la ligera (L). En su forma apo (sin Hierro) esta molécula
presenta un masa molecular de aproximadamente 450 kDa (Theil y col., 1990).
Su principal función es almacenar hierro (Fe), siendo capaz de captar hasta
4,500 átomos de este elemento, el cual es utilizado en procesos celulares
vitales posteriores, tales como trasporte de oxígeno, transferencia de
electrones, fijación de nitrógeno, síntesis de ácido desoxirribonucleico (ADN) y
producción de hemoproteínas como la hemoglobina, mioglobina y citrocromos.
Además al aumentar los niveles intracelulares de fierro, la ferritina cumple la
función de destoxificación celular, al secuestrar este elemento y evitar así la
producción de especies reactivas de oxigeno, generadas en presencia de Fe
libre en el citosol mediante la reacción de Fenton (Worwood, 1990; Harrison y
col., 1996; Koorts y col., 2007; Arosio y col., 2008).
La ferritina es una proteína altamente conservada evolutivamente, se
encuentra
expresada
tanto
en
procariotes
como
en
eucariotes.
Interesantemente esta biomolécula presenta una gran homología entre los
diferentes organismos, por ejemplo, la cadena L en humanos, cerdos, caballos
y ratas presenta una similitud de un 85%, mientras que la cadena H presenta un
90% de similitud entre el humano, rata y pollo (Levi y col., 1992; Harrison y col.,
1996).
Estructura de Ferritina
Es una proteína globular, con un diámetro exterior de 124-130 Å e interior de
70-80 Å; posee una masa molecular promedio de 450 kDa en su forma apo; en
su estado Holo (saturada de fierro) alcanza los 900 kDa de masa molecular
(Ford y col., 1984; Harrison y col., 1996; Forrellat y col., 2000; Koorts y col.,
4
2007) (Figura 1A). Las dos cadenas (H y L) presentan una homología de un
54% entre ellas. La subunidad H tiene una masa molecular de 21,226 Da,
conformada por 183 aminoácidos; por otro lado la subunidad L presenta una
masa relativa de 20,020 Da constituida por 175 aminoácidos (Uniprot) (Tabla I,
A y B) (Harrison y col., 1996: Koorts y col., 2007; Arosio y col., 2008).
La ferritina es una molécula muy estable ante condiciones de
desnaturalización térmica y química, característica atribuida principalmente a
los enlaces iónicos presentes en la subunidad ligera (Santambrogio y col., 1992;
Harrison y col., 1996), por tal razón, las isoformas que presentan mayor
proporción de cadenas L, como ferritina sérica, son más resistentes a la
desnaturalización (Finch y col., 1984; Santambrogio y col., 1992).
Almacenamiento de Fe por Ferritina
El proceso de captación y almacenamiento de Fe en ferritina ha sido bien
caracterizado. Este proceso sucede en tres etapas consecutivas: la primera es
la fase más rápida, y se lleva a cabo mediante interacciones electrostáticas del
Fe+2 y los ácidos glutámicos de la cara externa de la subunidad H (Harrison y
col., 1996; Santambrogio y col., 1996), comenzando inmediatamente después la
segunda etapa que consiste en la oxidación del Fe+2 a Fe+3, lo que se realiza en
el centro ferroxidasa presente en la subunidad H, pero ausente en la cadena L
(Wade y col., 1991; Chasteen y col., 1999). Finalmente la tercera etapa, y la
más lenta del proceso, tiene como finalidad la formación del núcleo de Fe,
requiriéndose la acción conjunta de las dos subunidades (Arosio y col., 1991;
Harrison y col., 1996). Una vez formado el núcleo, el fierro es almacenado como
cristales de hidróxido de fosfato férrico [(FeOOH8). FeO. PO3H2], y se considera
que la relación optima para que la ferritina adquiera la capacidad máxima de
almacenamiento, es del 70% de subunidad ligera (Forrellat y col., 2000; Arosio
y col., 2008).
5
Figura 1. Aspectos estructurales de la ferritina. A. Ferritina empaquetada en
24 subunidades. B. Cadenas dobladas en 4 α-hélices. (Arosio y col., 2008).
6
Tabla I. Secuencia de aminoácidos de ferritina humana. A. Subunidad ligera (L).
B. Subunidad pesada (H).
A.
10
20
30
40
50
60
MSSQIRQNYS TDVEAAVNSL VNLYLQASYT YLSLGFYFDR DDVALEGVSH FFRELAEEKR
70
80
90
100
110
120
EGYERLLKMQ NQRGGRALFQDIKKPAEDEW GKTPDAMKAA MALEKKLNQA LLDLHALGSA
130
140
150
160
170
RTDPHLCDFL ETHFLDEEVK LIKKMGDHLT NLHRLGGPEA GLGEYLFERL TLKHD
B.
10
20
30
40
50
60
MTTASTSQVRQNYHQDSEAAINRQINLELYASYVYLSMSY YFDRDDVALK NFAKYFLHQS
70
80
90
100
110
120
HEEREHAEKL MKLQNQRGGR IFLQDIKKPD CDDWESGLNA MECALHLEKN VNQSLLELHK
130
140
150
160
170
180
LATDKNDPHL CDFIETHYLN EQVKAIKELG DHVTNLRKMG APESGLAEYLFDKHTLGDSD
NES
(Uniprot).
7
Liberación de Fe de la Ferritina
Aún no se conoce completamente el proceso de liberación de fierro por ferritina.
Estudios in vitro sugieren que la liberación se lleva a cabo a través de los
canales presentes en la molécula, mismos que le sirven tanto de entrada como
salida. Reportes previos han sugerido que en el proceso de liberación, la
reducción del estado férrico a ferroso es la etapa inicial del proceso.
Posteriormente, este elemento debe ser transportado hacia el exterior de la
proteína a través de una molécula transportadora/acarreadora, como un agente
quelante, liberando así al fierro de ferritina (Yang y col., 2000). Otros trabajos
sugieren que la subunidad H presenta actividad intrínseca de reductasa, por lo
que tiene la capacidad de oxidar y reducir el Fe, según las necesidades de la
célula. Estudios in vivo, no han establecido la existencia de un mecanismo de
liberación de fierro de ferritina (Thiel, 1990, Harrison y col, 1996).
Ferritina sérica. La isoforma de ferritina más estudiada, y por lo tanto
mejor caracterizada, es la citosólica, a diferencia de la isoforma sérica, que a
pesar de presentar alta semejanza con su homóloga intracelular (alrededor de
un 80%), no se ha caracterizado a detalle (Cai y col., 1997, Orino y col., 2008;
Arosio y col., 2008; Wang y col., 2010). La función de la ferritina sérica se
desconoce, aunque actualmente se utiliza ampliamente como marcador clínico
de varias patologías relacionadas con procesos inflamatorios, y en alteraciones
en los niveles de Fierro (Harrison y col., 1996; Arosio y col., 2008; Wang y col.,
2010).
Al igual que la ferritina citosólica, la ferritina sérica está conformada por
24 subunidades, en su gran mayoría cadenas ligeras (23 a 24 subunidades L
por molécula), siendo capaz de captar niveles traza de fierro. Interesantemente,
la ferritina sérica se encuentra glicosilada con N-oligosacáridos, siendo los
monosacáridos manosa, glucosa y ácido siálico las moléculas principales; así
mismo, es importante mencionar que el perfil de glicosilación de la ferritina
8
sérica no ha sido caracterizado a detalle (Arosio y col., 1991; Arosio y col.,
2008).
La concentración fisiológica de ferritina sérica oscila entre 15 y 300 µg/L
(Covell y col., 1984; Worwood, 1990). Su origen se desconoce, sin embargo
algunos investigadores han propuesto que dicha molécula es un producto de la
excreción celular (Arosio y col., 2008), por otro lado, se plantea la hipótesis de
que es un producto de liberación originado por la lisis celular de tejidos
(Worwood, 1990).
Algunos autores han descrito la relación directa de los niveles
intracelulares de fierro con los niveles de ferritina sérica (Finch y col., 1984), por
otro lado, se ha observado relación entre el nivel de ferritina plasmática y el
fierro almacenado, por el grupo de Cazzola y cols., quienes sugieren que la
sobrecarga de Fe aumenta la expresión intracelular de subunidad L, siendo este
evento directamente proporcional a los niveles de expresión de ferritina sérica
(Halliday y col., 1979; Cazzola y col., 1986).
Algunas patologías inducen desequilibrio en los niveles de ferritina
sérica, como es el caso de la necrosis tisular de algunos órganos (como hígado
y bazo), neoplasias, osteoartritis y diabetes mellitus (Hershko y col., 1984;
Cazzola y col., 1986; Torti y col., 1994; Arosio y col., 2008). En estas patologías
se ha propuesto al incremento en los niveles de Fe como factor de riesgo, sin
embargo, se desconoce la posible asociación y/o participación de la ferritina
sérica en estos procesos dismetabólicos, así como la función y origen de esta
biomolécula (Niitsu y col., 1984; Koorts y col., 2007), siendo por estas razones
la importancia de purificar la ferritina sérica para así poder estudiarla a detalle.
9
Técnicas de purificación para ferritina sérica. Son pocos los trabajos
que describen métodos para purificar ferritina, siendo el método de referencia el
propuesto por Worwood y col. en 1976, el cual consiste en una cromatografía
de intercambio iónico, bajo las siguientes condiciones: La muestra se carga en
una matriz de Sephadex A-50, equilibrada con buffer veronal (barbital sódico
0.05 M y HCl 0.05 M) a un pH de 6.8. Posteriormente las proteínas se eluyen al
aumentar la fuerza iónica, con NaCl, del buffer anterior. La concentración de
ferritina se determina espectrofotométricamente a 280 nm o por ensayo
inmunoradiométrico. La presencia de ferritina sérica se determina mediante
geles de poliacrilamida en condiciones nativas, desnaturalizantes y reductoras.
Este método cromatográfico presenta algunas desventajas, como una baja
afinidad hacia ferritina sérica, la cual es reflejada en los bajos porcentajes de
recuperación proteica (Worwood y col., 1975; Worwood y col., 1976).
En 1981, este mismo grupo de investigadores modificó su método para
purificar ferritina sérica, proponiendo el procedimiento experimental siguiente:
La muestra (2.5 L de suero, en promedio) es pre-tratada con un volumen igual
de acetato de sodio 0.05 M, posteriormente se ajusta el pH a 4.8 con ácido
acético 1 M, se calienta a 70°C por 10 min, y después de reposar en hielo, se
centrifuga a 10,000xg durante 30 min. Al sobrenadante obtenido se ajusta el pH
a 6.8 con NaOH 1 M, y se concentra el volumen de muestra mediante
centrifugación (membrana Amicon XM 100A). Posteriormente, la muestra se
somete a una cromatografía de afinidad con anticuerpos anti-ferritina de bazo
de humano (Worwood y col., 1976); la fracción de elución obtenida se concentra
de igual forma. Inmediatamente después la fracción de elución se aplica a una
cromatografía de intercambio iónico en DEAE-Sephadex A-50, y finalmente se
somete a una cromatografía de filtración en gel con Sephadex G-200 (Worwood
y col., 1981). Los resultados generados por este grupo mostraron alrededor de
un 20% de recuperación de ferritina. La pureza se evaluó mediante
electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes (SDS10
PAGE), en gradiente del 4 al 15%, observándose la presencia de cadenas tanto
ligeras como pesadas, siendo esta última apenas detectada. También aparece
una tercera banda la cual la denominaron subunidad G, con masa molecular de
23 kDa, la cual se encuentra glucosilada (Worwood y col., 1981). Este método
se considera el de referencia, y ha sido ampliamente utilizado por diversos
investigadores desde su publicación en la década de los ochenta.
Cromatografía
La Unión Internacional de Química Pura y Aplicada (IUPAC) define a la
cromatografía de forma general, como un método empleado principalmente
para la separación de los componentes de una muestra, en el cual los
componentes son distribuidos entre dos fases: una estacionaria, y otra móvil. La
fase estacionaria puede ser compuesta de un sólido o un líquido, el cual es
soportado en un sólido o en un gel (matriz) (Skoog y col., 2001), y puede ser
empaquetada en una columna, extendida en una capa o distribuida como una
película, de tal forma que cada componente de la muestra interactúa en forma
diferente con la fase móvil. Si las características de ambas fases y la longitud
de la columna son las óptimas, se logrará la separación completa de todos los
componentes de la muestra (Skoog y col., 2001). La cromatografía presenta
algunas ventajas tales como la capacidad de utilizarse desde microescala hasta
escalas industriales, la de mantener la muestra en condiciones nativas, además
de ser una técnica de bajo costo y ampliamente probada (Hage 1999).
Las características de interés de la muestra son directrices para la
elección del método cromatográfico a utilizar, con la finalidad de optimizar el
proceso de purificación de proteínas. Por ejemplo, si la separación es en base a
su masa molecular se utilizará cromatografía de filtración en gel, si se desea
separar proteínas con carga se empleará cromatografía de intercambio iónico,
si se requiere la separación de biomoléculas hidrofóbicas la cromatografía de
hidrofobicidad es la mejor opción. Por otro lado se cuenta con la cromatografía
11
de afinidad, la cual se basa en el bioreconocimiento específico de la molécula
de interés (ligando especifico) (Amersham Biosciences, 2001a).
Cromatografía de Afinidad
Esta cromatografía tiene como fundamento al reconocimiento de biomoléculas
de manera específica, característica que se logra incorporando en una matriz
cromatográfica, un ligando con alta afinidad y especificidad hacia la proteína de
interés, por ejemplo, anticuerpos (Cuatrecasas y col., 1970; Amersham
Biosciences, 2001a; Lee y col., 2003). Debido a su alta especificidad, este
método de separación es ampliamente utilizado, ya que presenta altos
porcentajes de recuperación, además de minimizar pasos para la purificación.
Lo anterior implica entonces un óptimo uso del tiempo, y en el caso específico
de la cromatografía de afinidad donde se utilizan anticuerpos (monoclonales o
policlonales) como ligandos (inmunopurificación), el método cromatográfico se
optimiza (Cuatrecasas y col., 1968; Hage y col, 1999; Amersham Biosciences.,
2001a; Gottstein y col., 2002). En la cromatografía de afinidad, la selección del
anticuerpo es pieza clave para optimizar el método, y la constante de afinidad
presente en ellos es la característica más importante para perfeccionar el
proceso de purificación de proteínas.
La mayor parte de los trabajos enfocados para la purificación de ferritina
sérica han sido basados en cromatografía de afinidad, utilizando anticuerpos
que reconocen específicamente a ferritina, obteniendo buenos resultados
(Lorraine, 1977; Lee y col., 1987; Chou y col., 2001).
12