Documento descargado de http://www.elsevier.es el 18/11/2016. Copia para uso personal, se prohíbe la transmisión de este documento por cualquier medio o formato. Med Clin (Barc). 2013;141(3):106–110 www.elsevier.es/medicinaclinica Original breve Glucosa tetrasacárido como biomarcador diagnóstico de la enfermedad de Pompe: estudio en 35 pacientes Joaquı́n Bobillo Lobato a, Pilar Durán Parejo a, Pedro Tejero Dı́ez b y Luis M. Jiménez Jiménez a,* a b Servicio de Bioquı´mica Clı´nica, Hospital Universitario Virgen del Rocı´o, Sevilla, España Bio-Rad Laboratories S.A., Diagnostics Group, El Prat de Llobregat, Barcelona, España I N F O R M A C I Ó N D E L A R T Í C U L O R E S U M E N Historia del artı´culo: Recibido el 19 de septiembre de 2012 Aceptado el 7 de febrero de 2013 On-line el 5 de junio de 2013 Fundamento y objetivos: La enfermedad de Pompe es un trastorno originado por la deficiencia de la enzima alfa glucosidasa ácida (GAA). En esta afección se produce un acúmulo de glucógeno lisosomal en diferentes tejidos, estando especialmente implicados los músculos esquelético y cardı́aco. El diagnóstico de confirmación se realiza mediante identificación del déficit de GAA. Existen, además, otros biomarcadores diagnósticos secundarios, como la glucosa tetrasacárido (Glc4), que se muestra elevada en orina de estos pacientes. Ası́, con este trabajo queremos poner de manifiesto la utilidad de la Glc4 como biomarcador diagnóstico para la enfermedad de Pompe en sus diferentes formas de presentación, utilizando un método de high-performance liquid chromatography (HPLC, «cromatografı́a lı́quida de alta resolución») con detección ultravioleta (UV) adaptado para nuestro estudio. Pacientes y métodos: Hemos analizado un total de 75 individuos: 40 controles sanos y 35 pacientes diagnosticados de enfermedad de Pompe. Se han recogido muestras de orina de 24 h de todos ellos y se han determinado sus niveles de Glc4 mediante HPLC/UV. Resultados: La evaluación de la Glc4 urinaria muestra una gran capacidad de discriminación entre individuos sanos/enfermos. Además, los resultados obtenidos nos han permitido establecer el nivel de decisión o punto de corte más apropiado para la identificación de los enfermos. Coclusiones: Los niveles de Glc4 urinarios se encuentran elevados en los pacientes con enfermedad de Pompe, y aunque se encuentran incrementados en otras dolencias, la existencia de un déficit de GAA, junto a una clı́nica compatible, proporcionan una alta sensibilidad para el diagnóstico de esta grave enfermedad. ß 2012 Elsevier España, S.L. Todos los derechos reservados. Palabras clave: Enfermedad de Pompe Glucosa tetrasacárido Biomarcador diagnóstico Curva caracterı́stica operativa del receptor Tetra-saccharide glucose as a diagnostic biomarker for Pompe disease: A study with 35 patients A B S T R A C T Keywords: Pompe disease Tetra-saccharide glucose Diagnostic biomarker Receiver operating characteristic curve Background and objectives: Pompe disease is a disorder originating from an acid alpha-glycosidase (AAG) enzyme deficiency. This disease produces an accumulation of lysosomal glycogen in different tissues, whereby the skeletal and heart muscles are especially involved. The established diagnosis is achieved through the identification of the AAG deficiency. There are also other secondary diagnostic biomarkers, such as tetra-saccharide glucose (Glc4), which shows high levels in the urine of these patients. In this study it is highlighted the usefulness of Glc4 as a diagnostic biomarker for Pompe disease in its different forms of presentation, using a high-performance liquid chromatography with ultraviolet detection (HPLC/UV) adapted to the study. Patients and methods: A total of 75 individuals have been analyzed: 40 healthy controls and 35 patients diagnosed with Pompe disease. Twenty-four hour samples of urine were collected from all of the patients and their Glc4 levels were determined by means of HPLC/UV. * Autor para correspondencia. Correo electrónico: [email protected] (L.M. Jiménez Jiménez). 0025-7753/$ – see front matter ß 2012 Elsevier España, S.L. Todos los derechos reservados. http://dx.doi.org/10.1016/j.medcli.2013.02.035 Documento descargado de http://www.elsevier.es el 18/11/2016. Copia para uso personal, se prohíbe la transmisión de este documento por cualquier medio o formato. J. Bobillo Lobato et al / Med Clin (Barc). 2013;141(3):106–110 107 Results: The evaluation of the urinary Glc4 shows a high discrimination ability between healthy/sick individuals. In addition, the results obtained have allowed to establish the most appropriate level of decision or cut-off point for the identification of sick people. Conclusions: Glc4 urinary levels are found to be high in patients suffering from Pompe disease and even though increased levels are also found in other conditions, the existence of a AAG deficiency together with a compatible clinical symptoms, prove very helpful for a correct diagnosis of this serious disease. ß 2012 Elsevier España, S.L. All rights reserved. Introducción Pacientes y métodos La enfermedad de Pompe (déficit de maltasa ácida o glucogenosis tipo II) es un trastorno autosómico recesivo causado por la deficiencia de la enzima lisosomal alfa glucosidasa ácida (GAA)1. En esta afección se produce un acúmulo de glucógeno lisosomal en diferentes tejidos, estando especialmente implicados los músculos esquelético y cardı́aco. Presenta un espectro continuo de sı́ntomas que dependen de la edad de inicio, los órganos afectados y el grado de miopatı́a existente2. Tiene 2 formas principales de presentación: a) forma infantil, con una rápida progresión de la enfermedad, existencia de cardiomegalia prominente, debilidad e hipotonı́a, y muerte debida a fallo cardiorrespiratorio durante el primer año de vida, se trata de la forma más grave de la enfermedad, y b) forma del adulto, constituida por un grupo heterogéneo de pacientes con inicio desde la infancia tardı́a hasta edades adultas, con afección muscular variable de progresión lenta y centrada en el músculo esquelético, no incluyendo la miocardiopatı́a grave entre sus sı́ntomas. El diagnóstico se confirma mediante ausencia (forma infantil) o marcada reducción (forma adulta) de la actividad GAA en diferentes muestras biológicas: fibroblastos, biopsia muscular, leucocitos totales o linfocitos aislados3. Recientemente, la determinación de GAA en sangre seca recogida sobre papel ha supuesto un gran avance en el diagnóstico3. No obstante, otros biomarcadores secundarios pueden contribuir al diagnóstico de la enfermedad. Entre ellos se encuentra la glucosa tetrasacárido (Glc4), que se eleva en la orina de los enfermos Pompe4, y se está postulando como un parámetro diagnóstico de gran relevancia. La Glc4 (Glca1-6Glca1-4Glca-4Glc) es una dextrina producida por la digestión del glucógeno y otros polı́meros de glucosa ramificados con enlaces glucosı́dicos alfa 1-4 y alfa 1-65. Diferentes estudios han demostrado que este tetrasacárido se encuentra incrementado en condiciones asociadas con aumento del almacenamiento de glucógeno: glucogenosis (GSD II, GSD III, GSD VI y GSD IX), distrofia muscular de Düchenne y otras enfermedades con afectación muscular. De esta forma, la hipótesis predominante en la actualidad considera que la Glc4 es producto de la degradación intravascular del glucógeno liberado del tejido muscular afectado en diferentes procesos patológicos5. Ası́, en los últimos años, la Glc4 urinaria se ha ido consolidando como un biomarcador no invasivo de gran interés para el diagnóstico y seguimiento de los pacientes con enfermedad de Pompe, ya que pone de manifiesto la elevación del almacenamiento muscular de glucógeno en este trastorno6,7. Se han desarrollado diferentes metodologı́as para la determinación de la Glc4 incluyendo inmunoensayos, cromatografı́a de afinidad con anticuerpos especı́ficos, high-performance liquid chromatography (HPLC, «cromatografı́a lı́quida de alta resolución») con detección ultravioleta (UV) o electroquı́mica, ultra performance liquid chromatography (UPLC, «cromatografı́a gaseosa/lı́quida») con detección mediante espectrometrı́a de masas (MS/MS), cromatografı́a lı́quida de ultra resolución con detección mediante espectrometrı́a de masas, etc. Nuestro grupo tiene experiencia en la utilización de este metabolito como parámetro analı́tico de apoyo en el diagnóstico de enfermedad de Pompe. Con este trabajo pretendemos mostrar la eficiencia que representa la cuantificación de este compuesto en el diagnóstico de la enfermedad. Sujetos y muestras Se analizó un grupo control (n = 40) constituido por sujetos normales con edades comprendidas entre los 2 meses de edad y los 60 años. El grupo de pacientes Pompe (n = 35) estuvo constituido por 7 pacientes con la forma infantil clásica, 2 de presentación infantil no-clásica y 26 pacientes de presentación en la edad adulta. Las muestras de orina se recogieron durante un perı́odo de 24 h, y se conservaron a -20 8C hasta la determinación analı́tica. Preparación de las muestras La cuantificación mediante HPLC requiere un proceso previo de derivatización de las muestras realizado según el método de Poulter y Burlingame modificado8. El reactivo de derivatización se prepara como se indica a continuación: - N-butil-4-aminobenzoato: 54 mg. Cianoborohidruro sódico: 47 mg. Ácido acético: 110 ml. Metanol: 1.760 ml. La derivatización de muestras/calibradores se realiza del siguiente modo: - 50 ml de orina/calibrador. - 10 ml de solución del estándar interno (1,2 mmol). - 140 ml de reactivo de derivatización. Se procede a continuación a incubar las muestras/calibradores en termobloque a 80 8C durante 45 min, y posteriormente se diluyen con 900 ml de una mezcla de acetonitrilo/agua (15/85 v/v). La fase de extracción de muestras/calibradores se lleva a cabo mediante cromatografı́a de intercambio iónico usando cartuchos LiChrolut1 RP-18 (40-63 mm) 100 mg previamente acondicionados mediante lavados sucesivos con metanol, agua y una mezcla de acetonitrilo/agua (15/85 v/v). Los oligosacáridos derivatizados son eluidos finalmente mediante la adición de 1 cc de una mezcla de acetonitrilo/agua (30/70 v/v). El eluido está ya preparado para inyectar directamente en el sistema de HPLC. Análisis y cuantificación mediante cromatografı´a lı́quida de alta resolución Los oligosacáridos derivatizados son separados en una columna Synergi1 4 m Hydro-RP 80A 250 4,6 mm con un flujo de 1,1 ml/min y detección UV a 304 nm. La fase móvil está formada por: - Solución A: tetrabutilamonio cloruro 10 mM en acetonitrilo/agua 20/80 (v/v). - Solución B: acetonitrilo puro. Se utiliza una separación en gradiente lineal que deberá pasar de 92 a 86% de la solución A respecto a la solución B en un espacio de tiempo de 20 min. Documento descargado de http://www.elsevier.es el 18/11/2016. Copia para uso personal, se prohíbe la transmisión de este documento por cualquier medio o formato. J. Bobillo Lobato et al / Med Clin (Barc). 2013;141(3):106–110 108 Las áreas de los picos de Glc4 y estándar interno (cetopentosa) se calculan automáticamente con corrección de la lı́nea base, usando la ratio de ambas áreas para la cuantificación de la Glc4. se normalizaron respecto a las concentraciones de creatinina urinaria. La figura 1 muestra, a su vez, la descripción estadı́stica de los resultados obtenidos agrupados según rangos de edad, debido a que los valores de este metabolito van disminuyendo con esta9,10, observándose esta tendencia tanto en los controles sanos como en los individuos con enfermedad. Para evaluar la importancia de este metabolito como biomarcador diagnóstico decidimos construir una curva ROC. Esta es una herramienta útil que pone de manifiesto la exactitud diagnóstica y aporta un criterio unificador en el proceso de evaluación de una prueba. La estimación cuantitativa de esta exactitud se obtiene mediante el cálculo del área bajo la curva ROC. La figura 2 ejemplifica la curva ROC obtenida para los pacientes de la forma adulta de presentación de la enfermedad. Como hemos indicado, el área bajo la curva nos permite cuantificar cuán buena es la capacidad de discriminación de un biomarcador entre individuos sanos/enfermos. Además, las Elaboración de la curva caracterı´stica operativa del receptor Con los resultados obtenidos tras la cuantificación de los niveles de Glc4 en las 2 poblaciones analizadas, construimos sendas curvas receiver operating characteristic (ROC, «caracterı́sticas operativas del receptor») utilizando el software estadı́stico IBM1 SPSS1 Statistics 20.0,0. Resultados Siguiendo este protocolo se calcularon las concentraciones de Glc4 urinarias correspondientes a todos los sujetos de los grupos control y enfermos Pompe (fig. 1). En todos los casos, los resultados Valores de Glc4 Gl c4 (m mol/molcreeatinina) 65 60 Pacientes pompe 55 Sujetos control 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 0 10 20 30 40 50 60 Edad SUJETOS CONTROL PACIENTES POMPE Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3 Grupo 4 Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3 Grupo 4 0a3 4 a 10 11 a 25 > 25 0a3 4 a 10 11 a 25 > 25 6 8 9 17 7 0 12 16 Media 4,14 1,67 0,64 0,79 29,54 - 16,42 6,88 D.S. 1,40 1,25 0,29 0,21 20,88 - 14,68 9,93 P5 2,15 0,84 0,32 0,43 5,66 - 1,84 0,73 P95 5,38 3,76 1,10 1,06 58,30 - 38,41 27,31 Valor Mínimo 1,49 0,79 0,31 0,33 4,92 - 1,19 0,64 Valor Máximo 5,53 3,96 1,22 1,15 65,63 - 46,49 37,14 Grupos de e dad n Figura 1. Distribución de los valores de glucosa tetrasacárido (Glc4) tanto en la población de controles sanos como en la de pacientes con enfermedad de Pompe. Asimismo, se muestra la descripción estadı́stica de los resultados obtenidos distribuidos en grupos según rangos de edad. Documento descargado de http://www.elsevier.es el 18/11/2016. Copia para uso personal, se prohíbe la transmisión de este documento por cualquier medio o formato. J. Bobillo Lobato et al / Med Clin (Barc). 2013;141(3):106–110 109 CURVA ROC Curva COR 1,0 Forma adulta de la enfermedad de Pompe Susceptibilidad 0,8 Área bajo la curva 0,6 0,4 Valor de corte establecido 1,025 Sensibilidad 1-Especificidad 0,893 0,115 0,949 0,2 Sensibilidad: 89,3% Especificidad: 88,5% 0,0 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1-Especificidad Figura 2. Curva receiver operating characteristic (ROC, «caracterı́sticas operativas del receptor») para la valoración de la glucosa tetrasacárido en el diagnóstico de la forma adulta de la enfermedad de Pompe. coordenadas de cada uno de los puntos que componen la curva y sus correspondientes valores de sensibilidad / 1 - especificidad permiten establecer el nivel de decisión o punto de corte más apropiado para la clasificación de los enfermos. Los resultados obtenidos para la forma infantil muestran una curva ROC de área de 0,980, y entre las coordenadas de valores sensibilidad / 1 - especificidad, destacamos el valor de 4.925 mmol/ mol de creatinina con una sensibilidad y especificidad del 85,7%. Para la forma del adulto obtuvimos un área de 0,949, fijando el valor 1.025 mmol/mol de creatinina como el punto de corte, con una sensibilidad del 89,3% y una especificidad del 88,5%. Con el fin de evaluar la repetibilidad y buen desarrollo de la metodologı́a empleada, se realizaron mediciones por triplicado de diferentes niveles de Glc4, obteniéndose un coeficiente de variación siempre inferior a 1,5%, y un error porcentual siempre inferior a 2,5%, asegurando de este modo la veracidad de los resultados (datos no mostrados). Discusión Los resultados obtenidos apoyan los antecedentes existentes que hablan de la Glc4 como biomarcador de gran utilidad para el diagnóstico de los enfermos Pompe. Por un lado, la curva ROC es un sistema eficaz para evaluar la significación diagnóstica de nuestro biomarcador. El trazado de la curva, las coordenadas de su recorrido, ası́ como el área bajo la curva, nos proporcionan información muy valiosa. El área bajo la curva, para ambas formas de presentación, muestra resultados cercanos a la unidad, observándose una alta capacidad de discriminación entre individuos sanos y enfermos. Representando cada punto de la curva un par sensibilidad / 1 - especificidad correspondiente a un nivel de decisión determinado, fijamos para la forma infantil el valor de 4,925 mmol/mol de creatinina (sensibilidad y especificidad = 85,7%) y para la forma adulta 1,025 mmol/mol de creatinina (sensibilidad = 89,3% y especificidad = 88,5%) como puntos discriminatorios. El establecimiento de estos valores de corte tiene como resultado la posibilidad de aparición de falsos negativos y positivos, situación que puede observarse en la descripción estadı́stica de nuestras poblaciones (fig. 1). Los falsos negativos aparecen en individuos de edades más avanzadas, con formas adultas más leves de la enfermedad y, en consonancia con ello, mostraban también una menor excreción de Glc4. Y en relación con los falsos positivos, hemos preferido apostar por una sensibilidad que nos asegure que ningún verdadero positivo se pierda y quede sin diagnosticar. En relación con la metodologı́a, la HPLC es una técnica de alta especificidad, observándose que para este metabolito no existen señales interferentes en el tiempo de retención de la Glc4 a lo largo del recorrido cromatográfico, ni en controles sanos ni en pacientes con enfermedad. Se trata, además, de un sistema a disposición de muchos laboratorios clı́nicos debido a su versatilidad, alto rendimiento y costes no excesivamente elevados, utilizado ya para la determinación de muchos metabolitos en la práctica rutinaria. Este método puede, por tanto, incorporarse y/o adaptarse con relativa facilidad y eficiencia a la práctica clı́nica de muchos laboratorios. Asimismo, la reproducibilidad, estudiada mediante análisis por triplicado de soluciones de diferentes concentraciones, muestra coeficientes de variación y porcentajes de error óptimos que hacen que la técnica empleada cumpla los requisitos para su uso en la práctica clı́nica. La metodologı́a empleada por nosotros es similar a la utilizada por An et al.7, y nuestros resultados están en concordancia con los publicados por este grupo, y con los obtenidos mediante otras metodologı́as más recientes (UPLC-MS/MS)10. Con este estudio podemos concluir que los niveles de Glc4 urinarios se encuentran elevados en los pacientes Pompe y, en mayor medida, en los pacientes con presentación infantil de la enfermedad, debido tanto a la mayor excreción en edades más precoces como a la mayor gravedad de esta forma de la enfermedad. Y aunque este oligosacárido puede, asimismo, aparecer elevado en otras enfermedades de almacenamiento de glucógeno, la existencia de un déficit de la enzima GAA especı́fica, junto a una clı́nica compatible, proporcionan una alta sensibilidad para el diagnóstico de esta grave enfermedad. Financiación La investigación ha sido financiada por la Fundación Genzyme dentro del ámbito del Foro Español para el estudio de las Enfermedades Lisosomales. Documento descargado de http://www.elsevier.es el 18/11/2016. Copia para uso personal, se prohíbe la transmisión de este documento por cualquier medio o formato. 110 J. Bobillo Lobato et al / Med Clin (Barc). 2013;141(3):106–110 Conflicto de intereses Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses, excepto los reflejados en las filiaciones. Bibliografı́a 1. Hischhorn R, Reuser AJ. Glycogen storage disease type II: Acid alpha-glucosidase (acid maltase) deficiency. En: Scriver CR, Beaudet AC, Sly WS, Valle E, editors. The metabolic and molecular basis of inherited diseases. 8 th ed., New York: MacGraw Hill; 2001. p. 3389–420. 2. Kishnani PS, Steiner RD, Bali D, Berger K, Byrne BJ, Case LE, et al.; ACMG Work Group on Management of Pompe Disease. Pompe disease diagnosis and management guideline. Genet Med. 2006;8:267–88. 3. Winchester B, Bali D, Bodamer OA, Caillaud C, Christensen E, Cooper A, et al. Methods for a prompt and reliable laboratory diagnosis of Pompe disease: Report from an international consensus meeting. Mol Genet Metab. 2008; 93:275–81. 4. Hallgren P, Hansson G, Henriksson KG, Häger A, Lundblad A, Svensson S. 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