Tipos de microscopios

TIPOS DE
MICROSCOPIOS
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TIPOS DE MICROSCOPIOS
ÍNDICE
1. El microscopio óptico
1.1. El microscopio óptico compuesto
1.2. El microscopio óptico de contraste de fases
1.3. El microscopio óptico de campo oscuro
1.4. El microscopio óptico de fluorescencia
2. El microscopio electrónico
2.1. El sombreado
2.2. La tinción negativa
2.3. Réplicas de carbono
2.4. Criocorrosión
2.5. El microscopio electrónico explorador
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1. TIPOS DE MICROSCOPIOS
1.1. El microscopio óptico
El microscopio óptico es un instrumento que sirve para aumentar el tamaño de un
objeto a través de un sistema de lentes. Puede conseguirse con este método un
aumento de hasta 2000 veces.
Las partes de las que se compone un microscopio se pueden dividir en parte
mecánica y en parte óptica (figura 1):
Parte mecánica:
™ Sistema de soporte:
¾
¾
¾
¾
¾
Pie: Sirve de apoyo y para darle estabilidad al microscopio. En él está
integrada la fuente luminosa.
Brazo: Es una columna que parte del pie sirve para sujetar el tubo.
Puede ser recto o arqueado.
Tubo: Es una cámara oscura que está unida al brazo. En su parte
inferior está el revolver son los objetivos y en su parte superior los
oculares.
Platina: Es una plataforma horizontal sobre la que se engancha con
dos pinzas el portaobjetos. Tiene en su zona central un orificio que
permite el paso de la luz y un sistema de cremallera manejado por
dos tornillos que permiten el movimiento de la muestra.
Revolver: Sujeta los objetivos y gira para permitir el cambio de
objetivo.
™ Sistema de ajuste:
¾
¾
Tornillo macrométrico: Tornillo de enfoque que mueve la platina
hacia arriba y hacia abajo de forma brusca y poco precisa.
Tornillo micrométrico: Tornillo de enfoque que mueve la platina hacia
arriba y hacia abajo de forma lenta y muy precisa.
Parte óptica:
™ Fuente de iluminación: Es una lámpara halógena que permite el encendido o
el apagado con un interruptor y cuya intensidad puede ser graduada. Puede
tener en su parte superior un anillo para permitir la colocación de filtros que
facilitan la visualización.
™ Condensador: Es un sistema de lentes situado bajo la platina que permite
concentrar la luz de la fuente de iluminación hacia la preparación.
™ Diafragma iris: Está en el interior del condensador y sirve para limitar el haz
de rayos que atraviesa el sistema de lentes eliminando los rayos demasiado
desviados (regula la luz y ajusta la apertura numérica).
™ Oculares: Están colocados en la parte superior del tubo y su función es
captar y ampliar la imagen obtenida por los objetivos. Actualmente se
suelen usar los microscopios binoculares que tienen dos oculares unidos por
un mecanismo que permite ajustar la separación interpupilar. Son
normalmente de x10 y x12.
™ Objetivos: Están colocados en la parte inferior del tubo insertados en el
revolver y obtienen la imagen real aumentada e invertida. Sobre su
superficie está indicado su aumento y su apertura numérica. Suelen llevar
dibujado un anillo de color que indica su aumento y suelen ser de x4 (rojo),
x10 (amarillo), x40 (azul) y x100 (blanco).
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Figura 1: Esquema de un moderno microscopio óptico.
1.1.1. El microscopio óptico compuesto
El microscopio compuesto ha sido de importancia crucial para la microbiología como
ciencia y es todavía, con ciertas variaciones, el principal apoyo de la investigación
microbiológica rutinaria.
Un microscopio compuesto tiene dos lentes o sistemas de lentes, el objetivo,
situado cerca del objeto que se observa, y el ocular, que está colocado cerca del
ojo. El aumento primario del objeto es producido por la lente objetivo y la imagen
se transmite al ocular, donde se realiza el aumento final. El aumento total de un
microscopio compuesto es el producto del aumento de su objetivo y de su ocular.
Con un objetivo que aumenta x40 y un ocular que aumenta x10 el aumento total es
de x400. El microscopio compuesto es pues capaz de conseguir aumentos
considerablemente mayores que el microscopio construido con una sola lente.
Además del aumento una propiedad del microscopio es su poder resolutivo. Esta es
la capacidad de mostrar distintos y separados dos puntos muy cercanos y, por
tanto, cuanto mayor sea le poder resolutivo, mayor será la definición de un objeto.
Los microscopios de gran poder resolutivo son especialmente buenos para ver
pequeñas estructuras. El poder resolutivo de un microscopio compuesto depende de
la longitud de onda utilizada y de una propiedad óptica de la lente conocida como
apertura numérica. Como la longitud de onda habitualmente está fijada, la
resolución de un objeto es función de la apertura numérica: cuánto mayor sea la
apertura, el objeto resuelto será más pequeño. Hay una correspondencia
aproximada entre el aumento de un objetivo y su apertura numérica, de tal modo
que las lentes con mayores aumentos habitualmente tendrán mayores aperturas
numéricas (el valor de la apertura numérica está marcado al lado de la lente). El
poder resolutivo viene dado por la siguiente fórmula:
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siendo: d = poder resolutivo, λ = longitud de onda, N = índice de refracción del
medio, α = semiapertura del objetivo, N*senα = apertura numérica.
Para conseguir un aumento total máximo e idóneo este debe estar comprendido
entre 500 y 1000 veces la apertura numérica. Si se busca una mayor ampliación de
la imagen lo que se consigue es un mayor aumento, pero una nitidez baja.
Un factor que afecta a la apertura numérica además de la construcción de la lente
es el medio a través del cual pasa la luz. Mientras que el objetivo esté separado del
objeto por el aire, su apertura numérica nunca será mayor de 1’0. Para conseguir
aperturas numéricas mayores que ésta el objetivo debe estar inmerso en un líquido
de mayor índice de refracción que el aire. Se utilizan aceites de varios tipos, y las
lentes preparadas para usarse con aceite se denominan lentes de inmersión. La
apertura numérica de un objetivo de inmersión de alta calidad esta entre 1’2 y 1’4.
Aunque las lentes de inmersión en aceite tienen habitualmente mayores aumentos
que las lentes para observación en seco, esto no es siempre así. Una lente de
inmersión utilizada en el aire da una imagen muy poco satisfactoria, por lo que
nunca deberá emplearse sin aceite.
Aumento con un ocular de x10
Apertura numérica
Poder resolutivo, µm
Profundidad de campo aproximada, µm
Área de campo aprox. con un ocular de x10, mm
1
Lentes de inmersión
Aumento del objetivo
x10
x40
x901
x100
x400
x900
0’25
0’76
1’30
2’0
0’45
0’27
7’0
1’3
0’5
1’5
0’35
0’17
Tabla 1: Datos ópticos para los objetivos utilizados comúnmente.
De acuerdo con la teoría de la óptica, las mayores resoluciones posibles con un
microscopio óptico compuesto permitirán la observación de un objeto cuyo
diámetro sea de unos 0’2 µm (1 µm = 10-6 m). Si un objeto de 0’2 µm de diámetro
se aumenta 1000 veces, aparecerá a la vista como un objeto de 0’2 mm de
diámetro que puede apreciarse fácilmente. Con el microscopio compuesto pueden
obtenerse aumentos mayores de x1000 escogiendo los oculares adecuados, pero
con ello no se da mayor resolución del objeto (esto se denomina aumento ineficaz,
puesto que no añade nada a la resolución).
La mayor parte de los microscopios usados en microbiología tienen oculares de diez
aumentos (x10) y objetivos de aumentos diversos, habitualmente x10 (aumento
total x100), x40 (aumento total x400) y x90 o x100 (objetivos de inmersión,
aumento total x900 ó x1000). Las lentes de menor aumento se utilizan para
rastrear la preparación buscando objetos de interés, el objetivo de 40 aumentos
permite la observación detallada de los microorganismos grandes tales como algas,
protozoos y hongos, y los objetivos de 90 ó 100 aumentos se emplean para ver las
bacterias y los pequeños microorganismos eucarióticos.
El sistema de iluminación de un microscopio es también de considerable
importancia, especialmente cuando se utilizan grandes aumentos. La luz que entra
en el sistema debe enfocarse sobre la preparación y para esto se utiliza un sistema
de lentes llamado condensador. Elevando o bajando el condensador puede alterarse
el plano del foco de la luz y elegirse una posición que consiga el foco preciso. El
condensador tiene también un diafragma iris, que controla el diámetro del círculo
de luz que pasa por el sistema. Lo que se busca con este diafragma iris no es
controlar la intensidad de la luz que alcanza el objeto, sino asegurar que la luz que
pasa por el sistema condensador ocupe justamente el objetivo. Si el diafragma iris
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es demasiado grande parte de la luz pasará no sólo al objetivo sino también
alrededor de él y no se utilizará. Si la luz es demasiado brillante no deberá
reducirse alterando la posición del condensador o del diafragma iris, sino usando
filtros de neutralización o disminuyendo el voltaje de la lámpara. Nunca se insistirá
lo suficiente en que el ajuste apropiado de la luz es crucial para la buena
microscopia, especialmente a los mayores aumentos.
Otros dos factores relacionados con el sistema de lentes utilizado son la
profundidad de campo y el área de campo. Profundidad de campo significa el
espesor de la preparación enfocada en cualquier momento y es siempre mayor a
pequeño que a gran aumento. Con inmersión en aceite la profundidad de campo es
muy escasa, habitualmente menor de 1 µm. El área de campo se representa por el
diámetro de la parte de la preparación que se está viendo. El área de campo es
siempre mayor con pequeño que con gran aumento, y por esta razón las lentes de
pequeño aumento son útiles para rastrear la preparación.
Figura 2: (a) Recorrido de la luz en un microscopio de campo claro. (b) Microfotografía de campo
claro.
1.1.2. El microscopio óptico de contraste de fases
El microscopio de contraste de fases hace posible ver fácilmente pequeñas células,
incluso sin teñir. Las células tienen un índice de refracción distinto de su alrededor
y esta diferencia puede utilizarse para crear una imagen de mucho mayor contraste
que la que puede obtenerse con el microscopio óptico normal.
En este microscopio la fuente de luz es un cono hueco de luz que pasa a través de
un diafragma anular al condensador. En el objetivo un anillo de contraste de fases
desplaza la fase de luz que lo atraviesa en un cuarto de longitud de onda. La luz
que pasa retardada atraviesa el anillo y el ojo la ve como luz blanca normal. La luz
que pasa a través de una muestra con índice de refracción diferente del índice del
medio es retardada y tiene un recorrido más largo, llegando al ocular fuera de fase.
La interferencia entre la luz retardada y la no retardada produce una imagen de la
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muestra. En la mayoría de los microscopios de contraste de fases la imagen
aparece clara sobre un fondo oscuro. Puesto que la imagen depende de las
diferencias en el índice de refracción de la muestra y del medio circundante, la
imagen desaparece si la muestra es sumergida en un líquido de igual índice de
refracción. Para obtener mejores resultados con el microscopio de contraste de
fases es esencial que el sistema óptico esté cuidadosamente alineado y se emplea
un dispositivo especial, el telescopio controlador, para ajustar el diafragma anular
en relación con el anillo de contraste de fases.
La microscopia de contraste de fases hace posible observar células en estado vivo,
ayudándonos así a evitar la creación de artefactos tales como los introducidos por
la tinción. En muchos laboratorios de bacteriología el microscopio de contraste de
fases ha reemplazado prácticamente al microscopio óptico común como
instrumento de investigación. Pero hay que tener en cuenta que el objetivo de
contraste de fases es menos apropiado que el normal para la observación de
material teñido, por lo cual los objetivos de campo claro son todavía necesarios y
deberían emplearse siempre para observar muestras teñidas.
Figura 3: (a) Recorrido de la luz en un microscopio de contraste de fases. (b) Microfotografía de
contraste de fases.
1.1.3. El microscopio óptico de campo oscuro
El microscopio de campo oscuro es un microscopio óptico ordinario cuyo sistema
condensador ha sido modificado para dirigir la luz a la preparación desde los lados
de tal modo que sólo la luz difractada por la preparación pasa al ocular y se hace
visible. A causa de esta disposición la muestra aparece iluminada sobre un fondo
oscuro. La microscopia de campo oscuro ha posible la observación en estado vivo
de partículas y células que de otra manera estarían por debajo de los límites de
resolución del microscopio óptico, aunque resulten visibles pocos detalles
estructurales. La microscopia de campo oscuro ha sido ampliamente usada en el
estudio de pequeñas células móviles tales como Treponema pallidum, la
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espiroqueta causante de la sífilis, que es invisible con la microscopia óptica
ordinaria.
Figura 4: (a) Recorrido de la luz en un microscopio de campo oscuro. (b) Microfotografía de campo
oscuro.
1.1.4. El microscopio óptico de fluorescencia
Se utiliza para poner de manifiesto muestras que tienen fluorescencia, bien a causa
de la presencia en su interior de sustancias materiales fluorescentes o que han sido
tratadas con colorantes fluorescentes. La fluorescencia es la propiedad que tienen
muchas sustancias químicas de emitir luz de un color después de excitarlas con luz
de otro color. En el microscopio de fluorescencia la luz de excitación es eliminada
con un filtro colocado entre el objetivo y el ocular, de modo que sólo se ve la luz
emitida.
Figura 5: Comparación entre los métodos microscópicos: (a) De campo claro. (b) De campo oscuro.
(c) De contraste de fases. (d) De fluorescencia.
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1.2. El microscopio electrónico
Para estudiar la estructura interna de los microorganismos es esencial el uso del
microscopio electrónico. En este microscopio se utilizan electrones en vez de rayos
de luz, y como lentes funcionan unos electroimanes. Todo el sistema opera en el
vacío. Cuando los electrones pasan a través de la preparación algunos son
difractados creando entonces una imagen que se hace visible en una pantalla
sensible a los electrones. La resolución obtenida con el microscopio electrónico es
mucho mayor que la conseguida con el microscopio óptico. Mientras que con
estructuras más pequeñas que pueden observarse tienen unos 0’2 µm, con el
microscopio electrónico pueden verse fácilmente objetos de 0’001 µm (= 1 nm =
10-9 m). Con el microscopio electrónico es posible ver muchas sustancias incluso de
tamaño molecular. Sin embargo, a causa de la naturaleza de este instrumento sólo
pueden examinarse objetos muy delgados. Si se está interesado en ver estructuras
internas, incluso una sola bacteria es demasiado gruesa para ser observada
directamente. Por consiguiente, para preparar muestras para el microscopio
electrónico se necesitan técnicas especiales de cortes ultrafinos. Para seccionar las
células primero deben ser fijadas y deshidratadas, realizándose habitualmente esto
último transfiriendo las células a un disolvente orgánico. Después de la
deshidratación la muestra es incluida en plástico y en este plástico se cortan
secciones finas utilizando un ultramicrótomo, por lo general equipado con una
cuchilla de diamante. Una sola célula bacteriana, por ejemplo, puede cortarse en
cinco o seis secciones muy finas, que son examinadas después individualmente con
el microscopio electrónico. Para obtener suficiente contraste, las preparaciones se
tratan con colorantes especiales de la microscopia electrónica, tales como ácido
ósmico, permanganato, uranio, lantano o plomo. Estos materiales están
compuestos por átomos de elevado peso molecular y, por ello, dispersan bien los
electrones. Las estructuras celulares teñidas con uno de esos materiales presentan
un contraste muy aumentado y, por tanto, se ven mejor.
Figura 6: Microscopio electrónico moderno.
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La fina sección es montada sobre una rejilla metálica recubierta de colodión y es
incorporada al instrumento, luego se aplica el alto vacío. Una vez es evacuada la
cámara de la muestra, se enfoca el haz electrónico y la imagen se observa en una
pequeña pantalla. Se toman fotografías de las imágenes interesantes, ya que sólo
en la placa fotográfica se obtiene la resolución última del microscopio electrónico. El
intenso haz electrónico causa el deterioro gradual de la muestra, de forma que no
es posible una observación a largo plazo.
La fijación, la inclusión y la tinción son tratamientos potencialmente perjudiciales y
pueden alterar grandemente las estructuras celulares. Por esta razón debe tenerse
gran cuidado en la interpretación de las imágenes obtenidas con el microscopio
electrónico. Los artefactos o creaciones artificiales son mucho más comunes que en
la microscopia óptica. Procedimientos que van bien con ciertos organismos pueden
fallar con otros. En general, se utilizan métodos diferentes para los organismos
procarióticos y para los eucarióticos.
La microscopia electrónica es un arte altamente desarrollado y con esta técnica
somos capaces de observar estructuras celulares que no pueden verse de ninguna
otra manera. La resolución mucho mayor que puede obtenerse justifica el cuidado,
el tiempo y el gasto que representa la preparación de micrografías electrónicas.
Figura 7: (a) Recorrido de los electrones en un microscopio electrónico. (b) Microfotografía de músculo
atrial aumentado x20000.
1.2.1. El sombreado
Si sólo tiene que observarse el contorno de un organismo, no son necesarias
secciones finas y sobre la rejilla metálica pueden montarse células enteras. Para
aumentar el contraste de las células entras se recurre generalmente al sombreado.
Esto implica el recubrimiento de la muestra con una fina capa de metal como, por
ejemplo, paladio, cromo u oro. El metal se deposita sobre el objeto por un lado de
forma que se crea una sombra. De esta manera el objeto aparece con grosor y
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forma. El sombreado se utiliza a menudo para observar apéndices superficiales en
las bacterias.
Figura 8: Micrografía electrónica de una célula sombreada mostrando los flagelos.
1.2.2. La tinción negativa
Otro modo de conseguir contraste con el microscopio electrónico es la tinción
negativa. Se aplica el mismo principio que en la tinción negativa del microscopio
óptico. Se utiliza una sustancia que no penetra la estructura pero que dispersa los
electrones. Una de las tinciones negativas más comúnmente utilizadas en la
microscopia electrónica se realiza con ácido fosfovolfrámico (fosfotúngstico).
Figura 9: Micrografía electrónica con tinción negativa.
1.2.3. Réplicas de carbono
Para examinar las superficies celulares pueden prepararse réplicas de carbono
evaporando sobre la superficie de las células una fina capa de carbono que se
adapta a los contornos de la superficie celular y que cuando es desprendida resulta
suficientemente delgada para poder observarse directamente al microscopio
electrónico.
Figura 10: Micrografía electrónica de una réplica de carbono de una aleación de niquel.
1.2.4. Criocorrosión
Otra técnica de la microscopia electrónica recientemente desarrollada es la de
criocorrosión (“freeze-etching”), que evita la formación de artefactos al eliminar la
fijación química y la inclusión. La muestra que va a examinarse es congelada sin
tratamiento químico y el bloque congelado se corta con una cuchilla de diamante,
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de tal modo que quedan expuestas porciones de las superficies de las células. Se
hacen y se examinan entonces réplicas en carbono de esas superficies, pudiéndose
observar estructuras superficiales o internas de las células. La mayoría de las
estructuras celulares vistas en secciones ultrafinas de preparaciones fijadas
químicamente se ven también en material congelado, lo que sugiere que esas
estructuras no son artefactos.
Figura 11: Micrografía electrónica de una réplica celular por criocorrosión.
1.2.5. El microscopio electrónico explorador
Otro instrumento reciente para examinar las estructuras superficiales es el
microscopio electrónico explorador (“scanning electron microscope”). El material
que se estudia es recubierto con una película fina de un metal pesado tal como el
oro. El rayo de electrones es dirigido sobre la preparación y la va recorriendo y
explorando por todas la superficie. Los electrones dispersados por el metal pesado
activan una pantalla de observación produciendo una imagen. Con el microscopio
electrónico explorador pueden observarse incluso muestras muy grandes, siendo
muy buena la profundidad de campo. El aumento que puede obtenerse oscila entre
uno tan bajo como x15 y uno tan alto como x100000, pero sólo puede observarse
la superficie de un objeto.
Figura 12: (a) Recorrido de los electrones en un microscopio electrónico explorador.
(b) Microfotografía de la cabeza de una hormiga.
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