Tecnología iFunnel para LC/MS una sensibilidad mejorada

Tecnología iFunnel para LC/MS una
sensibilidad mejorada en Tándem
Ahora disponible en el Nuevo sistema
Agilent 6490 de triple cuadrupolo LC/MS
Información general técnica
Autores
Paul Momoh, Anabel Fandino, Ed
Aisawa, Tim Schlabach, Ken Miller y
George Stafford
Agilent Technologies, Inc. Santa Clara,
CA EE. UU.
El sistema Agilent LC 1290
Infinity y el nuevo sistema
LC/MS Agilent 6490 de triple
cuadrupolo con tecnología
iFunnel
Resumen
Se ha comprobado que la ionización por impacto electrónico (ESI, del inglés electrospray
ionization) es sólida y ampliamente aplicable para el análisis de muchos tipos de
compuestos químicos. Los investigadores han documentado que normalmente menos del
1% de los iones analitos producidos por ESI entran en el espectrómetro de masas y solo
uno de entre 103 y 105 desencadena una respuesta a la señal en el detector MS1. Este
hecho limita en gran medida la sensibilidad de los sistemas LC/MS. La nueva tecnología
iFunnel de Agilent combina la alta generación y el enfoque de iones ESI de la tecnología
Agilent Jet Stream de con un conjunto de capilares de muestreo con seis orificios,
lo que permite que una mayor fracción de las columnas de gases de ESI entren en la
óptica iónica del espectrómetro de masas. Un embudo único de dos fases permite un
incremento de la transmisión iónica, al mismo tiempo que se evacua una mayor cantidad
de gas. Este diseño innovador reduce la contaminación y la neutraliza para mejorar todo
el sistema en general y reducir el ruido. Este resumen técnico pone de manifiesto la
tecnología iFunnel en el nuevo sistema LC/MS 6490 de triple cuadrupolo permitiendo por
primera vez una sensibilidad a nivel de zeptomoles (10-21 moles) en un espectrómetro de
masas en tándem basado en cuadrupolos a caudales de flujo convencionales.
Tecnología Agilent Jet Stream
atmosférica. La tecnología AJS
utiliza el calor para desolvatar de
forma efectiva las gotas que se crean
durante la nebulización en la fuente
de iones. Un preciso pulverizador
micromecanizado rodea las gotas con
una cubierta de gas supercalentado
originando dinámicas de flujo con
iones concentrados en una zona de
confinamiento termal bien determinada
para un muestreo efectivo del
espectrómetro de masas. Por medio
de un gas de flujo rápido calentado
a una temperatura superior a 400° C
se confina la zona rica en iones en
una región con una superficie de
aproximadamente un quinto de la
columna de gas producida por la
fuente estándar de ESI. El proceso de
confinamiento del gas se muestra en
la Figura 1 que compara la columna
estándar de ESI con una columna más
pequeña de AJS. La alta temperatura
se concentra en la cubierta gaseosa
y produce gotas sustancialmente más
pequeñas.
En el diseño del nuevo sistema
LC/MS 6490 de triple cuadrupolo,
Agilent ha adoptado un enfoque
dedicado íntegramente a mejorar
la sensibilidad, prestando especial
atención a la formación de iones en
fase gaseosa y su posterior transmisión
al espectrómetro de masas, mejorando
así también de la eficiencia en la
transferencia iónica y la reducción de
ruido en el sistema.
Las fotografías de la región de
la columna donde se produce la
ionización por impacto electrónico
revelan al menos dos razones por
las cuales muchos iones analitos se
pierden durante el proceso de ESI a
presión atmosférica: a) los analitos
quedan retenidos en gotas nebulosas
de espuma debido a una desolvatación
insuficiente y b) muchas gotas e iones
desolvatados se alejan del orificio de
entrada del espectrómetro de masas,
los iones están contenidos en gas
atmosférico, por lo tanto no es posible
capturarlos todos utilizando sólo un
campo electrostático.
Comparando las señales producidas por
ESI o AJS se ponen de manifiesto que
las intensidades de la señal son mucho
mayores con la concentración termal,
tal y como se muestra en la Figura 2.
La tecnología centrada en el gradiente
termal de Agilent Jet Stream (AJS)
ayuda a superar ambos problemas
y a mejorar el muestreo por ESI
x10
Figura 2. Comparación de
la intensidad de MRM para
cloranfenicol añadido a agua
potable analizada en modo iónico
negativo. El volumen inyectado
fue de 5 μl de una solución de
50 ppb.
Figura 1. Proceso de confinamiento del gas de
Agilent Jet Stream
Verde = ESI estándar
Naranja = Agilent Jet Stream
- MRM (321.00000 -> 152.00000)
2
Con la tecnología Agilent Jet Stream
Cloranfenicol
1
0,1
0
Con ESI estándar
2
Recuentos frente a tiempo de adquisición (min)
1,5
2
A pesar de estas ganancias en la
sensibilidad, una experimentación
posterior ha revelado que el
espectrómetro de masas no puede
capturar muchos de los iones
formados en la columna colimada. Los
experimentos se llevaron a cabo variando
la posición lateral de la columna de
AJS delante de la entrada capilar del
espectrómetro. Los datos de la Figura
3 muestran que la zona de máxima
generación iónica se da en una región
horizontal de unos 3-5 mm en el centro
de la columna. El muestreo de los iones
se realiza normalmente por una entrada
capilar al sistema del espectrómetro de
masas. Los capilares estándar de Agilent
tienen un diámetro interno de 600 µm.
Un mayor muestreo iónico sería posible
aumentando el área de interfase
de la entrada capilar en la zona de
confinamiento termal iónico. Los
sistemas anteriores de espectrómetros
de masas han intentado aumentar la
sensibilidad simplemente mediante el
aumento del diámetro de una de las
entradas. No es de extrañar que estas
propuestas hayan mostrado pocos
resultados positivos ya que no mejoran
significativamente el muestreo de iones
de forma eficiente, la mayoría de los
iones no son especialmente accesibles
y no se transmiten al espectrómetro.
Para capilares de diámetro mayor,
las dinámicas del gas cambian de un
flujo aerodinámico favorable a un flujo
turbulento, produciendo la pérdida de
iones. (Además, el gas cargado en
el espectrómetro de masas aumenta
proporcionalmente al diámetro capilar
hasta la 4º potencia, lo que significa
que incluso los aumentos nominales de
diámetro crean un aumento de la carga
de gas atmosférico y una necesidad
de nuevos sistemas de aspiración más
amplios).
Intensidad normalizada
Capilares de muestreo con seis
orificios
Distribución de la intensidad
1
400 °C
300 °C
0,5
200 °C
100 °C
33 °C
0
-6,5
-5,5
-4,5
-3,5
-2,5
-1,5
0,5
-0,5
Distancia (mm)
1,5
2,5
3,5
4,5
5,5
Figura 3. Intensidades iónicas normalizadas mientras la columna de gas de AJS se aleja
lateralmente del centro. La intensidad iónica de mayor grado tiene lugar en una banda de unos
3-5 mm de ancho delante del capilar de muestreo.
La opción alternativa es utilizar
múltiples capilares expandidos por
la zona central rica en iones de
la zona de confinamiento termal.
Se ha comprobado que el empleo
de múltiples capilares aumenta la
eficiencia del muestreo iónico y
mantiene un buen rendimiento del
proceso de desolvatación. Para la serie
6490 de triple cuadrupolo se eligió una
disposición circular de seis capilares,
como se muestra en la Figura 4.
Los capilares abarcan una distancia
horizontal de 3 mm y proporcionan
una interfase de muestreo de alto
rendimiento para los iones en fase
gaseosa en la zona de confinamiento
termal de AJS. Con el proceso ESI
también se obtienen resultados
positivos, pero las ganancias son
mucho más significativas en la zona de
concentración iónica creada por AJS.
Además de aumentar el número de
capilares, se acortó la longitud de
los capilares un 50% para disminuir
la resistencia de circulación del gas
por el capilar, minimizar la pérdida de
movilidad de los iones, y por tanto
mejorar el muestreo atmosférico.
El aumento del número de capilares
aumenta la carga de gas en el
espectrómetro de masas en una
proporción lineal con respecto al número
de capilares. El capilar de un único
orificio de la serie Agilent 6460 de triple
cuadrupolo conduce unos 2 l/min de gas
atmosférico. Los capilares de muestreo
con seis orificios pueden conducir unos
23 l/min. De esta forma pueden ser
muestreados muchos más iones de la
zona de confinamiento termal de AJS,
pero ahora es necesario separarlos de un
gran volumen de gas.
Figura 4. Conjunto de capilares
de muestreo con seis orificios y
placa de orificio. Los capilares
de muestreo con seis orificios
abarcan la zona de confinamiento
termal de AJS para permitir un
muestreo de iones mucho mayor.
3
Embudo doble para iones
Este problema se ha solucionado
añadiendo un sistema de embudo para
iones – un elemento de óptica iónica
que puede utilizarse capa capturar de
forma eficaz y confinar iones altamente
dispersos así como dirigir el flujo de
iones en las fases iniciales del sistema
del espectrómetro de masas, que están
sometidos a altas cargas de gas.
Se seleccionó un embudo doble para
iones. Este dispositivo extrae el gas
en dos fases, como se muestra en la
Figura 5. El embudo inicial funciona
a alta presión y se bombea por medio
de un potente sistema de aspiración
al vacío, mientras que los voltajes del
embudo y el RF impulsan los iones
adelante, y centran sus trayectorias
para alinearse con la entrada del
segundo embudo de baja presión.
(Téngase en cuenta que el primer
embudo está desplazado con respecto
al capilar y la entrada del segundo
Capilares de muestreo
con seis orificios
embudo para evitar que especies
neutras entren en el flujo de la óptica
iónica.) El proceso se repite con un
segundo embudo para iones de baja
presión. Una cantidad reducida de
gas emerge del segundo embudo
comparada con un conjunto óptico
estándar de espumadera/Q0 y reduce
la carga en la bomba turbo, mejorando
el rendimiento del servicio.
La tecnología iFunnel combina
la tecnología Jet Stream con un
conjunto de capilares de muestreo
con seis orificios y un embudo
doble para iones aumentando el
muestreo de iones y la transmisión
desde la columna de gas de AJS
en la óptica iónica de la serie 6490.
La capacidad de concentración termal
de AJS colima la columna de gas
producida por ESI de forma que se
puedan capturar más iones por el
conjunto de capilares. El conjunto
de capilares de muestreo con seis
orificios captura un mayor ángulo
sólido de la columna de gas y trabaja
conjuntamente con el embudo doble
para iones, que separa el gas y los
neutrales de los iones. El resultado
combinado de los tres elementos de la
tecnología iFunnel supone una drástica
mejora de la sensibilidad.
Embudo de alta presión
Embudo de baja presión
Figura 5. El conjunto de embudo doble extrae gas atmosférico y especies neutras, y enfoca y dirige los iones en la óptica de baja
presión de la serie LC/MS Agilent 6490 de triple cuadrupolo.
4
Ganancias en la sensibilidad con
la tecnología iFunnel de la serie
6490 de triple cuadrupolo
x102
4
x103
S/N 1157.1
A
2
3
La nueva serie 6490 de triple cuadrupolo
con tecnología iFunnel muestra una
ganancia diez veces mayor en señal a
ruido para alprazolam relativo a la serie
6460 de triple cuadrupolo con AJS y
un único capilar de muestreo (Figura
6). Con la nueva serie 6490 de triple
cuadrupolo se han observado ganancias
significativas en la sensibilidad para
muchos compuestos en iones tanto
positivos como negativos.
1
2
1
0
1
0
2
1
Figura 6. Alprazolam, 1 pg en columna A. 6460 estándar con Agilent Jet Stream: S/N = 1.157:1 B.
Nueva serie 6490 con tecnología iFunnel: S/N = 11.640:1
seis veces superior en comparación al
modo positivo de ESI. Normalmente,
estas ganancias se corresponden con
todo el rango de masa de la serie 6490
de triple cuadrupolo.
Serie 6490 con tecnología iFunnel
5x10 6
Los aumentos de la intensidad iónica
son incluso más pronunciados para
iones negativos como se muestra en
la Figura 8. La ganancia media en la
intensidad de la señal fue diez veces
mayor en el rango de masas de la serie
6490 de triple cuadrupolo.
6460 con Agilent Jet Stream
7x
3x10
11x
7x
4x10
2x10
6
14x
7x
6
2
Recuentos frente a tiempo de adquisición (min)
Recuentos frente a tiempo de adquisición (min)
Ganancias en la sensibilidad con la
tecnología iFunnel a través del espectro
de masas como se muestra en la
Figura 7. La ganancia media es unas
6
S/N 11640.1
B
3x10
5x
7x
6
10x
2x10 6
5x
1x106
Recuento
Recuento
1x10 6
0
5x105
Serie 6490 con tecnología iFunnel
622
4x105
0
6460 con Agilent Jet Stream
4x10
1334
602
5
922
118
3x10 5
3x105
322
302
1222
1034
2x10 5
2x105
1x10 5
1x105
0
10x
113
0
200
400
600
m/z
800
1000
1200
200
1400
Figura 7. Las intensidades de la señal para niveles estándar de calibración en ESI
positiva para la serie 6490 de triple cuadrupolo (parte superior) y la serie 6460 de
triple cuadrupolo (inferior) muestran aumentos a través de un amplio rango de
masas.
5
400
600
800
m/z
1000
1200
1400
Figura 8. Las intensidades de la señal para niveles estándar de
calibración en ESI negativa para la serie 6490 de triple cuadrupolo
(parte superior) y la serie 6460 de triple cuadrupolo (inferior)
muestran aumentos a través de un amplio rango de masas.
Las muestras en matrices complejas
como plasma y orina representan un
mayor desafío analítico. Una solución
para aumentar la especificidad en el
bioanálisis es reducir la ventana de
aislamiento del ión precursor para
excluir potenciales interferencias
químicas. Esto se muestra en la
Figura 10 para el análisis de 2,5
fg de propionato de fluticasona en
plasma. El límite de la detección (LOD,
del inglés limit of detection) con la
ventana de masa estrecha (0,4 m/z)
es dos veces mayor que con una
resolución más baja (0,7 m/z) debido
a una disminución considerable del
ruido químico. El LOD a 0,4 m/z es de
alrededor 1 fg.
x10 1
4,5
Recuentos
Las espectaculares ganancias en la
intensidad de la señal conseguidas
con la tecnología iFunnel se traducen
en una mejora significativa de los
límites de detección. La inyección de
tan sólo 100 atogramos de verapamil
en la columna produce una respuesta
que se distingue claramente del ruido
(Figura 9). El límite de detección en
este caso es de aproximadamente
100 zeptomoles de verapamil.
4,4
4,3
4,2
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0.9
0,9
Tiempo de adquisición (min)
Figura 9. 100 atogramos de verapamil, en la columna, analizados con la nueva serie 6490 de
triple cuadrupolo.
x101
Q1 Unidad (0,7 m/z)
Q2 Unidad (0,7 m/z)
7
Q1 Mejorada (0,4 m/z)
Q2 Unidad (0,7 m/z)
6
5
4
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
Recuentos frente a tiempo de adquisición (min)
2
2,2
2,4
Figura 10. 2,5 fg de propionato de fluticasona de una muestra de plasma. Datos de MRM utilizando una resolución de
aislamiento precursora de 0,7 m/z (rojo) y 0,4 m/z (azul). Un aislamiento más estrecho reduce la señal no específica y
mejora los límites de detección.
6
Resumen
Referencias
Nueva serie 6490 de triple cuadrupolo
con tecnología iFunnel
1.J. S. Page, R. T. Kelly, K. Tang, R. D.
Smith, “Ionization and transmission
efficiency in an electrospray
ionization-mass spectrometry
interface,” J. Am. Soc. Mass
Spectrom., 18:1582-1590, 2007.
• Ganancias importantes y estables en
la sensibilidad en tándem LC/MS
• Mejoras drásticas en la sensibilidad
de iones tanto positivos como
negativos
• Diseños robustos resistentes a la
contaminación
• Rango dinámico lineal de hasta
6 niveles de magnitud
• Resolución Q1 de 0,4 m/z para un
aislamiento precursor mejorado
• Los límites de detección en
zeptomoles para algunos compuestos
• Límites de detección en atogramos
para compuestos en matrices
7
www.agilent.com/chem/qqq
Este artículo está indicado para el uso en
investigaciones únicamente. No está indicado
para su uso en procedimientos de diagnóstico.
Agilent Technologies no se responsabiliza de
los errores contenidos en este manual o de
los daños ocasionales relativos al suministro,
prestaciones o uso de este material.
© Agilent Technologies, Inc. 2010
Impreso en los EE. UU. el 21 de mayo de 2010
5990-5891ES