Introduccion a tecnicas

Seminario Genética
Técnicas de Biología
Molecular
Contenidos
Extracción de ADN
 Enzimas de restricción
 PCR
 Southern Blot
 Secuenciación método de Sanger y
automática

1º Extracción de ADN
Se pueden tomar diferentes fuentes para extraer ADN humano:
Sangre, Saliva, Semen, hisopado vaginal, restos de fluidos en ropa, orina, piel, bulbo
piloso, muestras biospsias de órganos/tejidos, material cadavérico (ej huesos), etc
Se separa el ADN de otras
fases orgánicas celulares:
2º Almacenamiento
y conservación del ADN:

El ADN purificado refrigerado a 4 ° C
puede conservarse por lo menos un
máximo de 3 años.

Aquellas muestras que necesitan
mantenerse más de 3 años deberán
congelarse a -70 ° C.
Las técnicas desarrolladas utilizan:
•Fundamentos:
Complementariedad de bases
Replicación del ADN
•Herramientas:
Elementos de virus y bacterias
(Ejemplo: Transcriptasa Reversa, Enzimas de Restricción, Polimerasas, etc.)
Sólo veremos Técnicas Directas:
Fundamentos:
•Southern Blot
Complementariedad de bases
Replicación del ADN
•PCR
•Secuenciación
Directa
SOUTHERN BLOT
Edwin Southern desarrolló esta técnica en 1975
Southern Blot

Sirve para detectar por Hibridación la presencia de una
porción de ADN en una muestra

Fundamento: COMPLEMENTARIEDAD DE BASES

Se diseña una sonda con nucleótidos marcados que
sean complementarios al sector de ADN buscado.

El sector de ADN buscado puede ser un gen, o parte del
mismo u otras zonas del genoma. Se puede utilizar para
el diagnóstico molecular de patologías genéticas
Southern Blot
HIBRIDACIÓN:

La doble hebra de ADN se forma por
complementariedad SONDA-muestra (una de las
hebras es la sonda en simple cadena y la otra es la
muestra en simple cadena)

Los nucleótidos de la sonda está marcados P 32
(radiactivos): Si al revelar hay marcador radiactivo
presente, está en la muestra analizada la secuencia
complementaria a la sonda
Para poder realizar Hibridación
en una muestra de ADN
se necesitan realizar
los siguientes pasos
Fragmentación del ADN y Separación
 Inmovilización- Desnaturalización
 Transferencia
 Hibridación
 Revelado

Enzimas
de
restricción
ENZIMAS DE RESTRICCION
Los fragmentos
de restricción se
pueden separar
por tamaño
mediante
electroforesis
en gel.
Diferentes
condiciones de
hibridación permite
mayor o menor
estabilidad y
especificidad
Pasos: Previos a la Hibridación:
separación de fragmentos

Extracción de ADN

Fragmentar el ADN en porciones más pequeñas
(Enzimas de restricción)

Separo los fragmentos realizando una corrida
electroforética usando como sustrato de
migración un gel (separación por tamaño)
Pasos: Previos a la Hibridación:
Inmovilización de los fragmentos en soporte sólido

Desnaturalización (SIMPLE CADENA)

Transferencia a soporte sólido (membrana de nylon / nitrocelulosa): Por
capilaridad o por electroforesis: pasan del gel a la membrana
Sacado de los bocetos de Edwin Southern
antes de la publicación de la técnica
Pasos: Hibridación

Se agrega la sonda sobre la membrana y se
incuba

Se lava para quitar el máximo de hibridaciones
inespecíficas

Se revela por autoradiografía
Sólo veremos Técnicas Directas:
•Southern Blot
•PCR
•Secuenciación
PCR:
Reacción en cadena
de la polimerasa
Kerry Mullis en 1983 desarrolló esta técnica
PCR

Amplificación de un gran número de copias a
partir de un fragmento molde de ADN, utilizando
una reacción enzimatica simple de polimerizacion
in vitro
ADN molde
PCR
ADN resultante
PCR
Fundamento:
REPLICACION DEL ADN
COMPLEMENTARIEDAD DE BASES
 Herramientas:
POLIMERASA BACTERIANA
 Estrategia:
Utilizar cambios de temperatura para
desnaturalizar y renaturalizar las hebras de
ADN complementario

PCR: la reacción se divide en 3 pasos
1. Desnaturalización: 94°C - 96°C
2. Alineación: temperatura variable
3. Extensión: 68 - 72°C
LOS 3 PASOS FORMAN 1 CICLO Y EL CICLO PUEDE
REPETIRSE VARIAS VECES
Necesitamos en este proceso controlar
la temperatura: termociclador
Desnaturalización
95°C
Hibridización
50-60ºC
Extensión de la
cadena 75ºC
Primer Ciclo
Si repetimos el ciclo, tendremos cuatro copias
Múltiples ciclos darán un incremento
exponencial en el número de copias
2do Ciclo
95ºC
50 - 60ºC
75ºC
¿Qué elementos son necesarios para la
polimerización in Vitro?


1.
2.
3.
4.
5.
6.
Extracción del ADN molde
Preparado de la MIX:
Agua libre de nucleasas
􀁺 Catión divalente (MgCl2)
􀁺 Desoxinucleótidos (dNTP´s)
􀁺 Sol. amortiguadora y sales (Buffer 10X)
􀁺 Oligonucleótidos (Primers)
􀁺 Enzima termo-resistente (Ej: Taq Polimerasa)
¿Qué elementos son necesarios para la
polimerización in Vitro?
Para la polimerización de ADN es necesario:
Una polimerasa, primers y nucleótidos.
 Como se utiliza cambios de temperatura para
lograr la desnaturalización y renaturalización
de las hebras: la enzima tiene que ser
resistente a cambios de temperatura

PCR
Thermus aquaticus se
descubrió en el Parque
Yellowstone, inició el campo
de la biología de los
hipertermófilos.
 Thermus aquaticus, crece
a 70º grados (fuente de
la enzima taq polimerasa
usada en la PCR)

PCR

La taq polimerasa no es la única enzima usada en la
PCR. Hay muchas más

Ej: PFU (enzima extraída de Pynococus Furioso)
TAQ
No tiene actividad 3’
exonucleasa. Puede
copiar con errores
Velocidad 2000
nucleótidos/ min.
PFU
Tiene actividad 3’
exonucleasa
Velocidad 500
nucleótidos/ min.
PCR: Primers
Complementariedad durante la hibridación
en la fase de alineamiento
 Se unen zona donde la secuencia es
complementaria
 Son diseñados los primers: esto permite
seleccionar que porción amplificar

PCR:
Ejemplos de utilización PCR en diagnóstico:
1. Colocando primers Fw diferentes (una para
secuencia normal y otra mutada) y mismo Rw
en el mismo tubo
2. Combinando la PCR con cortes con enzimas de
restricción (si se generase o perdiera algun sitio de
restricción por la misma mutación)
concepto: Primers alelo específicos
El siguiente es el resultado en un gel de agarosa
En la calle (1) se sembró
el marcador de peso
molecular
En la calle (2) se sembró
una muestra conocida
para una mutación
homocigota
En la calle (3) se sembró
la muestra del paciente
El siguiente es el resultado en un gel de agarosa
¿Qué resultados
dieron las
muestras 1, 2, 3, 4?
En la calle (C1) muestra En la calle (C2) muestra
conocida homocigota conocida homocigota
gen mutado
gen normal
¿Qué elementos son necesarios para la
polimerización in Vitro?


1.
2.
3.
4.
5.
6.
Extracción del ADN molde
Preparado de la MIX:
Agua libre de nucleasas
􀁺 Catión divalente (MgCl2)
􀁺 Desoxinucleótidos (dNTP´s)
􀁺 Sol. amortiguadora y sales (Buffer 10X)
􀁺 Oligonucleótidos (Primers)
􀁺 Enzima termo-resistente (Ej: Taq Polimerasa)
Algunas aclaraciones…
Sol. amortiguadora PCR:
􀁺 Mantiene el pH óptimo para que la enzima actúe
􀁺 Sales
Proporcionan la fuerza iónica adecuada para una máxima actividad de la
enzima
Los iones de magnesio
estimulan a la enzima Taq Polimerasa
para que incorpore los dNTP´s.
Taq
Mg
PCR: cómo ve el observador el proceso
Herramientas:
POLIMERASA BACTERIANA que resista a los cambios Tº
 Estrategia:
Utilizar cambios de temperatura para desnaturalizar y
renaturalizar las hebras de ADN complementario

MIX +
ADN
Sólo veremos Técnicas Directas:
•Southern Blot
•PCR
•Secuenciación
Secuenciación:
Método enzimático 1977:
Frederick Sanger desarrolló esta técnica
Método de los terminadores de cadena o dideoxi
Secuenciación
Fundamento:
REPLICACION DEL ADN
COMPLEMENTARIEDAD DE BASES
 Herramientas:
Dideoxinucleotidos
 Estrategia:
Cuando se agrega un dideoxinucleotido
a la cadena en formación se
interrumpe la polimerización

En la polimerización
del ADN
OH
Fosfato
HO P O
Base
N
O
N
CH2
5’
4’
N
O
Azúcar2’
N
1’
3’
OH
H
Jerárquico OH
del carbono 3
Secuenciación: utiliza deoxinucleotidos
y dideoxinucleotidos
Fosfato
HO
OH
O
P
Base
NH2
N
O
N
CH2
5’
4’
3’
N
N
O
Azúcar2’
OH
1’
H
deoxinucleotido
monofosfato
Fosfato
HO
OH
O
P
Base
NH2
N
O
N
5’CH2
4’
3’
N
N
O
Azúcar2’
OH
H
1’
H
2’3’-dideoxinucleótido
monofosfato
Cuando se incorpora un dideoxinucleótido se
interrumpe la polimerización
Fosfato
HO
OH
O
P
Base
NH2
N
O
N
5’CH2
4’
3’
N
N
O
Azúcar2’
OH
H
1’
H
2’3’-dideoxinucleótido
monofosfato
Se realizan 4 reacciones de síntesis (4 tubos
separados)


1.
2.
3.
4.
5.
Se incluyen pequeñas cantidades de
dideoxinucleotidos ddNTP que
A ddNTP
compiten con los dNTP.
En cada tubo se colocan:
dNTP (4 tipos),
un solo tipo de ddNTP por tubo,
primer o cebador marcado,
G ddNTP
ADN molde a secuenciar,
Polimerasa
C ddNTP
T ddNTP
Secuenciación: Separación de fragmentos
ddATP
Los productos de las 4
reacciones, cada una
conteniendo una pequeña
cantidad de uno de los cuatro
dideoxinucleótidos, son
cargadas en el gel y sometidas
a electroforesis
 Como la polimerización es solo
en dirección 5’ a 3’, los
fragmentos más cortos estarán
en 5’ y los más largos que se
encontrarán en la dirección 3’
ddCTP
ddGTP
ddTTP
Lectura 5’ a 3’ desde la basa al tope

SECUENCIACION AUTOMATICA empleando
método enzimático
►Alternativa del método Sanger
►Se marca cebador con fluorescencia y se activa la reacción
►Los productos se detectan durante electroforelectroforésis al
pasar por un láser que excita los fluorocromos y se detecta
fluorescencia emitida
►Se realizan 4 reacciones de secuencia distintas
Se coloca el cebador marcado, polimerasa , dNTP y ddNTP
►Al finalizar las cuatro reacciones se mezclan en único tubo
ATTGC A
Capilar
Pol.
líquido
…..
Laser
Placa caliente
Prisma
Detectores
+
Ventana
Reacción
Secuencia
-
¿Cómo se ve el resultado?
En el electroferograma se observa dos picos en
la posición 152 (C / T)
A–A–T–G –G-T- C- C–A–N -T - T- G- G- C
A–A–T–G –G-T- C- T–A–N -T - T- G - G - C
Repeticiones en tandem
La variación en el número de repeticiones de los
distintos mini y microsatélites es un polimorfismo
muy frecuente.
Estos polimorfismos se generan por errores durante la
replicación
Dado que las repeticiones se encuentran en forma diploide:
Cada uno de nosotros posee dos variantes para una repetición
determinada.
VNTR
(Número
variable de
repeticiones
en tandem)
micro
satélites
hiper
variables
Obtención de
DNA a partir de
RNA.
Rt-PCR.
Transcriptasa
reversa