Práctica 2

PRÁCTICAS DE FISIOLOGÍA VEGETAL
MEDIDA DE LOS ESPECTROS DE ABSORCIÓN DE CLOROFÍLIDAS Y CAROTENOIDES
1. INTRODUCCIÓN
Para comprender el mecanismo a través del cual los pigmentos del cloroplasto captan la energía
luminosa en el proceso de la fotosíntesis es importante conocer el espectro de absorción de estos
compuestos. Un espectro de absorción es la representación gráfica del grado en el que un
determinado pigmento capta las diferentes longitudes de onda de la radiación luminosa.
% de absorción
Longitud de onda (λ
λ) expresada en nm
Espectro de absorción de los pigmentos fotosintéticos. Imagen tomada de Biology of plants .
Peter H. Raven, Ray F. Evert, Susan E. Eichhorn.. Freeman and Company Worth Publishers. 1999
Las clorofilas presentan dos máximos de absorción, uno en la zona del azul y otro en la zona del
rojo con ligeras diferencias entre clorofila a y clorofila b. Los carotenoides absorben fundamentalmente
las radiaciones azules y violetas.
La exacta localización de los máximos de absorción depende del disolvente en el que se
encuentren y en esta práctica hay también que considerar que los pigmentos que se utilizan proceden de la
extracción realizada en una práctica anterior en la que recordemos que lo que se obtenían finalmente eran
clorofílidas. Por último no se deben descartar posibles contaminaciones debido a una no muy buena
separación.
2. MATERIAL
Soluciones de pigmentos obtenidos en la práctica de separación mediante disolventes químicos y
conservados en condiciones de oscuridad en el frigorífico.
Espectrofotómetro y cubetas de vidrio
Pipetas de 1 y 5 ml
Gradilla
Tubos de ensayo
Agua
Éter etílico
Éter de petróleo
Solución de KOH en metanol
1
3. METODOLOGÍA
En primer lugar se prepara un blanco para cada uno de los pigmentos con la siguiente
composición.
Clorofílidas. En un tubo de ensayo se mezclan 1ml de solución de KOH al 30% en metanol y 2 ml
de agua destilada y se agita hasta que se mezclen bien
Carotenos. Éter de petróleo
Xantofilas. Éter etílico
El blanco se prepara porque los distintos compuestos químicos en que están disueltos los
pigmentos, absorben también y es necesario conocer cual es su absorbancia a cada una de las longitudes
de onda para poder restársela a la solución de pigmentos, de modo que tengamos la absorbancia debida al
pigmento.
En la práctica se medirá la absorbancia de cada uno de los pigmentos entre 350 y 700 nm a
intervalos de 25 nm, es decir a 350, 375, 400 ....... 700 nm. Cuando se esté cerca de un máximo de
absorción, las lecturas se harán de 5 en 5 nm.
En primer lugar se mide la absorbancia de la solución de pigmento y se procede del siguiente
modo:
a) Se selecciona la longitud de onda
b) Se introduce la cubeta con la solución de pigmento y se toma la lectura de absorbancia
c) Se selecciona una nueva longitud de onda y así sucesivamente
A continuación se repite el mismo procedimiento pero con el blanco (previamente se habrá lavado
la cubeta con el propio disolvente para eliminar restos de pigmento). Se procede como con el pigmento y
se anotan las lecturas de absorbancia.
4. RESULTADOS
A la absorbancia obtenida en la solución de pigmento a cada una de las longitudes de onda se le
resta la absorbancia del blanco a esa misma longitud de onda.
Los resultados se representan en papel milimetrado utilizando una misma gráfica para los cuatro
pigmentos
Dis.= Absorbancia de la disolución
Blco.=Absorbancia del blanco
Pig.=Absorbancia del pigmento = Absorbancia de la disolución - Absorbancia del blanco
Longitud de onda
Clorofílida a
Clorofílida b
Xantofila
Carotenos
Dis.
Dis
Dis.
Dis.
Blco. Pig.
Blco. Pig.
Blco. Pig.
Blco. Pig.
2
3