Tema IV. Genética Bacteriana

Tema IV.
Genética Bacteriana
¿Por qué podemos hablar de Genética Bacteriana?
• Las bacterias son haploides (Un cromosoma)
– No hay alelos dominantes y recesivos.
• Se reproducen de manera asexual
Tasa de mutación en E. coli
Escherichia coli
Genoma: 4.4 x 106 pares de bases. La replicación del genoma
implica la polimerización de 8.8 x 106 nts
La DNA polimerasa que replica el genoma de E. coli, en
cooperación con otros mecanismos, comete un error cada 1010
nucleótidos incorporados.
Sin embargo, hay una alta diversidad genética:
Se encuentra en una población resistencia a antibióticos,
resistencia a bacteriófagos, diversidad metabólica (síntesis
de aminoácidos, vitaminas etc.)
La principal fuente de variabilidad genética en bacterias es la
mutación.
¾ Mutación “espontánea”: cambios que ocurren durante la duplicación
del DNA
¾ Mutación inducida: cambios que ocurren por daño al DNA
Mutación “espontánea”: cambios que ocurren durante duplicación del DNA
Cadena de
Si cada genoma implica la incorporación de 8.8 x 106 nts, habría
un error aprox. cada 1136 divisiones (1010 / 8.8 x 106)
Un mL de un cultivo de bacterias en fase exponencial tiene:
1 x 109 células. Como habría un error cada 1136 replicaciones,
si se dividen todas las células, 1 x 109 / 1136 = 8.8 x 105
mutaciones en una generación.
Experimento de Luria y Delbrück. Prueba de fluctuación
Sin corrección
del error
DNA “nueva”
Escherichia coli sensible a
bacteriófagos
Siguiente ronda
de replicación
Diluir el cultivo
Cadena de
DNA molde
Corrección
del error
Inocular el
cultivo con el
fago
Muchos subcultivos
Mutación inducida: cambios que ocurren por daño al DNA
Determinar el número
de colonias resistentes
al fago:
Desaminación oxidativa del DNA
Una hipoxantina se aparea con una citosina
Inocular y determinar el # de
colonias resistentes al fago:
67/ 159/ 117/ 291/75/ 135/ 220/ 0
142/ 146/ 155/ 140/
132/ 123/138/149
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Experimento de Lederberg y Tatum
Experimento de Luria y Delbrück. Prueba de fluctuación
La resistencia al bacteriófago se debe a mutaciones en algún(os)
gen(es) de la bacteria.
E. coli
E. coli
Se observa mayor variabilidad en el número de colonias
resistentes al fago en los cultivos independientes: las mutaciones
ocurren espontáneamente, en ausencia del bacteriófago.
La alta variabilidad se
explica porque en cada
cultivo, la mutante
resistente se dio en
distintas generaciones.
Medio
mínimo
Genética Bacteriana. Análisis fenotípico en bacterias.
Experimento de Lederberg y Tatum
AUXOTROFÍA
Las cepas silvestres son protótrofas (crecimiento en medio
mínimo), se pueden identificar mutantes incapaces de sintetizar
algún metabolito esencial, por lo que este debe ser añadido al
medio (bio-, arg-, met-, ad-)
FUENTE DE ENERGÍA
Capacidad de las bacterias para utilizar determinados
sustratos como fuentes de energía, generalmente carbohidratos
(galactosa; gal-/gal+, lactosa; lac-/lac+, melobiosa,
RESISTENCIA/SUSCEPTIBILIDAD A ANTIBIÓTICOS
Capacidad de crecen en presencia de inhibidores, como
antibióticos (estreptomicina, ampicilina, kanamicina, etc.
Medio mínimo
strR/strS; ampR/ampS
Otras características como morfología colonial y pruebas
bioquímicas también se emplean.
Se requiere contacto físico entre las bacterias para que ocurra
este intercambio
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Mecanismos mediante los cuales las bacterias
adquieren nueva información genética
• Transformación
El transporte del DNA del medio extracelular al citoplasma es un
proceso muy complejo que todavía no está bien entendido.
Se requieren proteínas que están involucradas en los sistemas de
secreción, así como de una translocasa de DNA en la membrana.
• Conjugación
• Transducción
1. TRANSFORMACIÓN
En la transformación, DNA exógeno es introducido a la célula e
incorporado al DNA cromosomal por recombinación.
Una de las dos cadenas es hidrolizada y el DNA de cadena sencilla que
queda es protegido por SSB y está disponible para recombinarse con el
DNA cromosomal. También puede entrar la doble hebra de DNA.
CONJUGACIÓN
E. coli tiene dos tipos de células: donadores/machos y
receptoras/hembras. La diferencia radica en la presencia del
plásmido F (plásmido sexual/ factor de Fertilidad) F+/FEl plásmido F contiene unos 100 genes, algunos de ellos codifican
proteínas involucradas en la replicación del DNA. Otros genes
codifican proteínas tubulares que forman el pilus.
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Conjugación es el proceso de apareamiento de bacterias mediante
el cual se transfiere información genética. Involucra el contacto
físico entre bacterias (F+ y F-)
Conjugación. Apareamiento entre bacterias (F+ y F-)
La célula F+ inicia la conjugación al
sintetizar y extender el pilus que se
adhiere a la superficie de la célula FEl pilus se retrae y acerca a las dos
células.
La célula F+
sintetiza el pilus
Conjugación
El pilus entra en
contacto con la
célula FEl plásmido es activado para
transferencia cuando una
endonucleasa corta una
cadena en el origen de
transferencia
El pilus se retrae
causando que las céls.
donadora y receptora se
unan. El plasmido F se
transfiere como DNA de
cadena sencilla
Una de las cadenas del DNA F es
cortada y se separa de la otra cadena.
Se transfiere esa cadena a la otra
célula, mientras que se comienza a
replicar el DNA de la cadena que se
quedó en la célula F+
La cadena de DNA recién
transferida también se replica.
Las dos células contienen un
plásmido F integro, por lo que
ambas son F+
La cadena
complementaria de
ambos plásmidos se
sintetiza
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Células Hfr (high frequency recombination). Otra propiedad
que tiene el plásmido F es su capacidad de integrarse al
cromosoma bacteriano, incrementando el tamaño de éste.
Episoma. Fragmento de DNA que
puede existir como plásmido y que se
puede integrar al cromosoma.
CONJUGACIÓN F’
En células Hfr ocurre con baja frecuencia que F se escinda del
cromosoma y forme un plásmido circular nuevamente. Cuando
esto ocurre, F acarrea consigo genes adyacentes del cromosoma
que ahora se encuentran formando parte del plásmido F.
Entonces, a éste se le llama plásmido F’.
La célula Hfr mantiene su
capacidad de conjugación, por
lo que se puede aparear con
una célula F-
CONJUGACIÓN F’
Ocurre transferencia de material
genético, sin embargo, no se
transfiere el cromosoma completo
pues las células se separan. La
secuencia correspondiente al plásmido
F no se transfiere.
Como se transfirió un fragmento del
DNA cromosomal, hay homología
con el cromosoma de la célula
receptora y ocurre recombinación
con alta frecuencia (Hfr)
Los plásmidos F’ también pueden
ser transferidos por conjugación
Con esta transferencia se pueden
crear células diploides parciales
(merocigotos).
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Una característica importante del apareamiento Hfr / F- es que la
transferencia del cromosoma Hfr ocurre a una tasa constante a
partir de un punto fijo determinado por el sitio donde está
insertado el episoma F.
Experimento de Conjugación a tiempos
controlados.
Cepa Donadora Hfr: thr+; leu+; azis; tons;
lac+; gal+; strs
Cepa receptora (F-): thr-; leu-; azir; tonr;
lac-; gal-; strr
1. Poner en contacto a las dos cepas
2. Interrumpir por agitación la
conjugación a distintos tiempos
Esta propiedad permite controlar la cantidad de información
genética transferida y mapear la posición de los genes
transferidos con respecto a la secuencia F de acuerdo al tiempo
de conjugación.
4. Evaluar el fenotipo de las bacterias
conjugantes
Resultados del Experimento
Mapeo de genes en E. coli por conjugación
Tiempo de
conjugación
(min)
• El tiempo que se requiere para que los genes entren en la
célula receptora está asociado con el ordenamiento en el
cromosoma bacteriano.
• El cromosoma Hfr es transferido linealmente a la célula F
receptora.
3. Sembrar en medio con streptomicina
(elimina a la cepa donadora)
% de colonias que sobreviven con los
genotipos indicados
thr+leu+
azis
tons
lac+
gal+
-
• Si se interrumpe la conjugación a distintos tiempos ocurrirán
transferencias parciales de los genes.
• El orden de los genes a lo largo del cromosoma se puede
deducir al determinar los genes transferidos durante
apareamientos cortos y comparados con apareamientos largos.
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Mapa genético del cromosoma de Escherichia coli
Punto de inicio
Las unidades son
minutos. Se refiere al
tiempo que tardan los
genes en entrar a una
bacteria F- receptora
durante el experimento
de conjugación
Clasificación de fagos por su estructura.
Icosahédricos sin cola (φX174)
Icosahédricos con cola (λ)
Filamentosos (M13)
Están formados por un ácido nucleico (DNA/RNA) y una cápside
de proteína
TRANSDUCCIÓN. Transferencia de material genético entre
bacterias a través de un bacteriofago.
Se adsorbe a la superficie de una bacteria susceptible, penetra el
ácido nucleico del fago, se replica su DNA, se expresan los genes
del fago, se sintetizan las proteínas y se ensamblan nuevas
partículas virales.
Ciclo lítico de un bacteriófago.
1. El bacteriófago se adhiere a la superficie
de la bacteria.
2. El DNA del bacteriófago penetra a la
célula.
3. Se sintetiza el DNA
y proteínas del
bacteriófago.
4. Se ensamblan los
componentes del
bacteriófago formando
nuevas partículas.
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Ciclo lítico de un bacteriófago.
Integración del DNA del fago al
cromosoma bacteriano
El cromosoma del bacteriófago
lambda (λ) en estado libre es circular.
El sitio de integración λ es una región
del cromosoma que se alinea en un
sitio del cromosoma bacteriano (entre
los genes gal y bio).
Ocurre un entrecruzamiento recíproco
entre el fago circular y el cromosoma
bacteriano resultando en la
integración. Esta integración es
mediada por los genes del
bacteriofago y no por el sistema de
recombinación de la bacteria.
5. La célula se lisa y
se liberan las
partículas virales
Al DNA del fago integrado al
cromosoma se le llama profago.
Ciclo lisogénicode un bacteriófago.
TRANSDUCCIÓN
Plásmidos.
Son moléculas de DNA circulares extracromosomales que se
encuentran en la mayoría de las bacterias y en algunas células de
eucariontes.
Inducción
del ciclo
lítico
La escición del DNA
del fago acarrea
DNA cromosomal
Replicación
del fago
Lísis celular y
liberación del fago
La célula receptora
adquiere nuevos
genes.
El fago infecta a la
Integración del DNA del
fago al cromosoma
célula receptora
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Muchos plásmidos usan la misma maquinaria de replicación del
DNA cromosomal y contienen un origen de replicación que es
reconocido.
En general, los plásmidos se clasifican en aquellos que se
encuentran en un bajo número de copias por célula (1-10) y los
que están presentes en un alto número de copias (10-100).
Mecansimos de resistencia a antibióticos y su
transmisión
Impermeabilidad y eflujo. Gram+ (peptidoglicano); Gram- (capa de
LPS). Proteínas de eflujo. Los genes responsables pueden estar en
plásmido o en cromosoma.
Modificación e inactivación del antibiótico. β-lactamasa, enzimas
modificadoras de aminoglicósidos, cloramfenicol acetil transferasa.
Modificación del blanco. Dominios de transpeptidasa con menor afinidad
por las β-lactamas.
Los plásmidos autoregulan su número de copias a través de un
represor (proteína o RNA) que impide que se repliquen muchas
copias del plásmido.
Vías alternativas de síntesis. Síntesis de tetrahidrofolato insensible a
sulfonamidas.
Estos represores también pueden actuar sobre otros plásmidos
relacionados, excluyéndolos así de la célula.
Los plásmidos codifican una diversidad importante de funciones
que le permiten a la bacteria que los contiene sobrevivir en
tipos de habitats muy variables.
1. Propiedades de Resistencia.
•
Antibióticos (aminoglicósidos, cloramfenicol, β-lactamas)
•
Metáles pesados (Hg, Ni, Co, Pb, Cd, Bi)
•
Aniones tóxicos (arsenato, arsenito, boratos, cromatos)
2. Propiedades metabólicas.
•
Producción de bacteriocinas
•
Metabolismo de carbohidratos
•
Metabolismo de compuestos carbonados
Transposones
• La transposición es otro tipo de recombinación de
DNA en el cual un elemento transponible o
transposón se mueve de una molécula de DNA a
otra.
Fueron descubiertos originalmente en maíz por
Barbara Mc Clintock, y su presencia se ha
documentado también en otras especies, desde
bacterias a humanos.
3. Factores que intervienen en la interacción con hospedero.
•
Enterotoxina y hemolisinas (Escherichia coli)
•
δ- endotoxina (Bacillus thuringiensis)
•
Neurotoxina (Clostridium tetani)
•
Infección y nodulación de leguminosas (Bradirhizobium sp.)
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Transposones
Mecanismo de Transposición (Tn5)
El tamaño de los transposones varía entre 103 a 104 pb
dependiendo del tipo de transposón.
La secuencia integra del transposón se puede insertar en un sitio
particular del cromosoma.
La transposición involucra recombinación entre secuencias no
relacionadas que son los extremos flanqueantes del transposón y
el sitio del cromosoma donde se insertó.
Unión de la transposasa a la región flanqueante
Formación del asa (complejo sináptico). Los
extremos del transposón se acercan.
Corte del DNA y escición del transposón
Unión del transposón al DNA blanco
La transposasa cataliza la inserción del
transposón al DNA blanco.
Transposasa. Enzima que corta al DNA blanco en sitios al azar y
une los extremos del transposón.
Secuencias repetidas invertidas. Funcionan como el sitio de
reconocimiento de la transposasa. Como las secuencias son
invertidas, son idénticas.
Marcador de selección. La inserción del transposón confiere una
ventaja ecológica a la célula, que puede ser la resistencia a algún
antibiótico. KanS Æ KanR
Transposón Tn5: 5,800 pb y regiones flanqueantes de 1,530 pb.
Genes de resistencia a Kan, Bleo, Strp.
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