Enzygnost* Anti-HBc/IgM Enzyme immunoassay for the qualitative detection of IgM antibodies to hepatitis B (core) antigen in serum or plasma Enzymimmunoassay zum qualitativen Nachweis von IgM-Antikörpern gegen das Hepatitis B (core)-Antigen in Serum oder Plasma Test immunoenzymatique pour la détection qualitative des anticorps IgM dirigés contre l’antigène de core de l’hépatite B dans le sérum ou le plasma Metodo immunoenzimatico per la determinazione qualitativa degli anticorpi IgM contro l’antigene «core» dell’epatite B nel siero o nel plasma Prueba inmunoenzimática para la determinación cualitativo de los anticuerpos de la IgM contra el antígeno de la hepatitis B (core) en el suero o en el plasma Teste imunoenzimático para determinação qualitativa de anticorpos IgM contra o antígeno „core“ da hepatite B no soro e no plasma English: Page 2 to 19 Deutsch: Seite 10 bis 17 Français: Pages 18 à 25 Italiano: Pagina 26 fino 33 Español: Pagina 34 hasta 41 Português: Páginas 42 a Test procedure and programming steps Testdurchführung und -programmierung Réalisation et programmation du test Esecuzione e programmazione de test Programación y realización del test Procedimento e programação Page Seite Page Pagina Página Página Bibliography/Literatur/Littérature/ Bibliografia/Bibliografía/Bibliografia Page/Seite/Pagina/Página 50 OWSE G13 C0541 (909) H/R 1 49 19 17 25 33 41 49 Edition February 2004 Enzygnost* Anti-HBc/IgM Intended Use Enzyme immunoassay for the qualitative detection of IgM antibodies to hepatitis B (core) antigen in serum or plasma. The enzyme immunoassay is processed on the BEP ® II, BEP® III and BEP® 2000 ELISA processors. The test was developed for investigation of individual samples, not pooled samples. The product is for in vitro diagnostic use only. Summary and Explanation In almost all cases of acute hepatitis B infection, IgM antibodies to hepatitis B core antigen (antiHBc IgM) are produced shortly after the onset of viral multiplication and remain in the circulation for about 7 to 17 weeks. For this reason, a relatively reliable diagnosis of acute hepatitis B infection can be derived solely on the basis of this parameter since HBsAg and HBeAg may also occur in the serum in chronic hepatitis and thus further parameters (anti-HBs, anti-HBe or anti-HBc) need to be evaluated for the differential diagnosis. In some cases of acute hepatitis B infection, the HBs and HBe antigens may have already disappeared before the onset of clinical symptoms, but the corresponding antibodies may still not be detectable. In such cases the assay of total anti-HBc would provide no clarification because these are long-term antibodies which may still be present in the circulation even years after an infection, possibly as the only antibodies. This gap in the diagnosis of acute hepatitis B can be filled by the assay of anti-HBc IgM 1. Principle of the Method The HBc/IgM Antibodies contained in the test sample bind to the anti-human IgM antibodies coated onto the wells of the microtitre plate. POD-labelled HBc antigen binds to the specific HBc/ IgM antibodies. After removing the excess conjugate and unbound sample constituents the enzyme reaction of the bound conjugate is determined (blue colour reaction). The enzymatic conversion of the chromogen is terminated by the addition of Stopping Solution POD (yellow colour reaction). The intensity of the colour reaction is proportional to the concentration of antibodies contained in the sample. Reagents Materials provided Enzygnost* Anti-HBc/IgM 1 x 96 Enzygnost* Anti-HBc/IgM test plate HBcAg/POD-Conjugate Conjugate Buffer (Anti-HBc/IgM) Sample Buffer (Anti-HBc/IgM) Control Serum, positive (Anti-HBc/IgM) Control Serum, negative (Anti-HBc/IgM) Washing Solution POD (concentrate)** Buffer/Substrate TMB** Chromogen TMB** Stopping Solution POD** Empty bottle for Working Chromogen Solution Adhesive foils PE bag for storing unused strips Barcode table Instruction for Use 1 pcs. 3 x 0.6 mL 3 x 6 mL 3 x 40 mL 1 x 0.3 mL 1 x 0.5 mL 1 x 100 mL 1 x 30 mL 1 x 3 mL 1 x 100 mL 1 pcs. 6 pcs. 1 pcs. 1 pcs. 1 pcs. ** These components are also included in the Supplementary Reagents for Enzygnost* TMB kit (code no. OUVP). OWSE G13 C0541 (909) H/R 2 Edition February 2004 Composition Enzygnost* Anti-HBc/IgM (test plate): Microtitration plate coated with monoclonal antibodies to human IgM. HBcAg/POD-Conjugate: Genetically engineered HBc antigen, conjugated with peroxidase (POD). Preservative: phenol (max. 1 g/L) Conjugate Buffer (Anti-HBc/IgM): Tris buffer containing Boviserin® and Tween 20. Preservative: phenol (max. 1 g/L) Sample Buffer (Anti-HBc/IgM): Tris buffer containing glycerol, Boviserin® and Tween 20. Preservative: phenol (max. 1 g/L) Anti-HBc/IgM Control Serum, positive: Stabilised human serum containing IgM antibodies to HBc antigen, diluted in Sample Buffer. Nominal absorbance: ≥ 0.7 Preservative: phenol (max. 1 g/L) Anti-HBc/IgM Control Serum, negative: Stabilised human serum without antibodies to HBc antigen, diluted in Sample Buffer. Nominal absorbance: ≤ 0.1 Preservative: phenol (max. 1 g/L) Washing Solution POD (concentrate): Phosphate buffer solution containing Tween. Preservative: phenol (max. 1 g/L) Buffer/Substrate TMB: Hydrogen peroxide (approx. 0.1 g/L) in acetate buffer solution. Preservative: n-butanol (max. 1%) Chromogen TMB: Tetramethylbenzidine dihydrochloride Stopping Solution POD: 0.5 N sulphuric acid Warnings and Precautions 1. For in vitro diagnostic use. 2. Each individual blood donation for use in manufacture of the control sera has been tested for HBsAg, anti-HIV1, anti-HIV2 and anti-HCV. Only donations with negative findings are used for the manufacture of Anti-HBc/IgM Control Serum, negative. Only donations with anti-HIV1, anti-HIV2 and anti-HCV negative findings are used for the manufacture of Anti-HBc/IgM Control Serum, positive. Nevertheless, since absence of infectious agents cannot be proven, all materials obtained from human blood should always be handled with due care, observing the precautions recommended for biohazardous material 2. This also applies particularly for the Anti-HBc/IgM Control Serum, positive, as the production procedure does not assure virus inactivation. 3. It is advisable to wear protective gloves throughout the entire test procedure. 4. For disposal, it is recommended that solid infectious materials should be autoclaved for at least one hour at +121 °C. All aspirated solutions should be collected in two receptacles connected in series, which should both contain a disinfectant suitable for inactivating pathogenic human viruses. The concentrations and reaction times specified by the manufacturer must be observed. Preparation of the Reagents Bring all the reagents and samples to +18 to +25 °C before beginning the test (without removing the test plate from its container/bag). For each test plate, dilute 20 mL of Washing Solution POD to 400 mL with distilled or deionized water. Working Chromogen Solution: For each test plate, dilute 1 mL of Chromogen TMB with 10 mL of Buffer/Substrate TMB in the empty plastic bottle supplied with the kit and store closed and protected from light. After use rinse the bottle thoroughly with distilled water. For technical reasons (overfill) it is not permissible to pour together the full contents of the Chromogen TMB vial and of the Buffer/Substrate TMB vial. Predilute all the test samples (but not the control sera) in tubes 1+100 with Sample Buffer (Anti-HBc/IgM) [e. g. 10 µL sample + 1000 µL Sample Buffer (Anti-HBc/IgM)]. Working Conjugate Solution: Withdraw the necessary amount from the vial of HBcAg/POD Conjugate and dilute 1+10 with the Conjugate Buffer (Anti-HBc/IgM). OWSE G13 C0541 (909) H/R 3 For half a test plate withdraw 0.6 mL of HBcAg/POD Conjugate and add to an original vial (6 mL) of the Conjugate Buffer (Anti-HBc/IgM) (= 1+10). Storage and Stability Stored unopened at the stated temperature all the components of the Enzygnost* Anti-HBc/IgM may be used up to the dates given on the labels. For details on the stability and storage of the opened and diluted reagents, see Table 1 in the Appendix. Equipment required: For automatic dispensing of reagent and washing BEP® II: BEP® III: For automatic processing of the test after dispensing the samples as well as for evaluation BEP® 2000: For fully automatic processing and evaluation of the test Pipettes: piston-type pipettes 25, 100 and 1000 µL Incubator: Covered water bath (+37 ± 1 °C) or comparable incubation methods All the equipment used in the test must have been validated. Specimens Suitable specimens are individual samples (human sera or EDTA/heparinized/citrated plasma) obtained by standard laboratory techniques. The samples should be stored for not more than 3 days at +2 to +8 °C. If the samples are to be stored for a longer period of time, they must be frozen. Procedure Test procedure using the BEP® II 1. Dispense samples: Fill 4 wells with 10 µL / well of Anti-HBc/IgM Control Serum, negative, and one well with 10 µL Anti-HBc/IgM Control Serum, positive; then fill the following wells with 10 µL / well of prediluted sample and, at the end of the set of samples or at the end of the test plate, fill one well with 10 µL of Anti-HBc/IgM Control Serum, positive. Then seal with foil. The pipetting steps must be performed within 15 min per test plate. 2. Incubate: Incubate at room temperature (+18 to +25 °C) for at least 15 min (max. 30 min). 3. Dispense conjugate: Remove the foil. Without washing the wells, add 100 µL of Working Conjugate Solution to each necessary well, cover with fresh foil and then place into the incubator. 4. Incubate: Incubate at +37 °C ± 1 °C for 60 ± 2 minutes, then proceed immediately to "5. Wash". 5. Wash: Remove the foil, aspirate all the wells and wash 4 or 5 times (see Note) with approx. 0.3 mL/well of Washing Solution POD. 6. Add substrate: Pipette 100 µL of Working Chromogen Solution into each well. Seal the plate with fresh foil. 7. Incubate: Incubate protected from light at +18 to +25 °C for 30 min ± 2 min. 8. Stop reaction: Remove foil, and add 100 µL of Stopping Solution POD to each well, keeping to the same timing as in "6. Add substrate". 9. Read: Read at 450 nm within one hour. It is recommended to use a photometer with two wavelengths (measurement and reference beams). Read the absorbances of the control and patient samples at 450 nm; the recommended wavelength for the reference measurement is 650 nm (if nesessary, between 615 and 690 nm). Test procedure using the BEP® III Before using the BEP® III, prepare the test plates and sample dispensing steps (Section 1 at "Test procedure with the BEP® II"). Immediately afterwards place the uncovered test plates (i.e. not covered with adhesive foil) into the BEP® III. Note that partially filled test plates need to be made up to at least half plates (6 test strips) by adding "water-filled strips". The test is then processed fully automatically (see BEP® III instruction manual). The settings for the incubation times in the BEP® III software may differ from the times on the BEP® II for technical reasons (system speed) but have been validated for Enzygnost* on the BEP® III. OWSE G13 C0541 (909) H/R 4 Test procedure using the BEP® 2000 The sample dispensing steps and subsequent processing steps in the test are performed fully automatically in the instrument (see instruction manual for the BEP® 2000). Test validation The individual values of the absorbances for the control sera are used to calculate the mean values if: -0.010 ≤ Aneg. ≤ 0.1 –0.010 ≤ Apos. ≥ 0.7 If one of the absorbance values of the Anti-HBc/IgM Control Serum is outside the specification, this value can be neglected. Both absorbance values of the positive control must comply with the specification. If these conditions are not fulfilled, the test is to be repeated. Evaluation On the BEP® 2000 and BEP® III the results are evaluated automatically. Please consult the instruction manuals for further details in this respect. The following sections apply if the results are evaluated without software assistance. Calculate the mean absorbance of the negative controls, then add 0.07 to obtain the cut-off value: – Aneg. + 0.07 = cut-off value In order to improve the reliability of results close to the cut-off the following retest range has been defined for the test: cut-off value ± 10% Based on the criteria of the test, the samples are classed as follows: Test result: ^ HBc/IgM antibody negative 1. Asample < cut-off - 10% = ^ HBc/IgM antibody positive 2. Asample > cut-off + 10% = ^ equivocal 3. cut-off – 10% ≤ Asample ≤ cut-off + 10% = If an equivocal result is obtained the sample is to be retested. If, after the retest, it is still not possible to class the samples as positive or negative, the result is considered „equivocal“. Limitations of the Procedure 1.Anticoagulants such as heparin, EDTA and citrate do not interfere with the test result. 2.Lipaemic, icteric or haemolytic samples do not interfere with the test. In isolated rare cases, samples with high levels of rheumatoid factor accompanied by high levels of anti-HBc may result in elevated signals. 3.Samples containing antibodies to CMV, HAV, HIV, HCV, rubella virus, as well as samples which are positive for anti-HBs, do not interfere with the test result. 4.Samples from patients with raised transaminase values as well as samples containing autoantibodies and ANA were not found to interfere with the test result. 5.Samples containing antibodies to EBV as well as samples from haemodialysis patients may exhibit elevated reactivity. 6.Inadequately coagulated sera, samples containing sodium azide, and microbially contaminated samples, should not be used. Any particulate constituents (e.g. fibrin clots) should be removed before the assay. 7.For thawed samples ensure good homogenisation of the material. 8.Reagents must not be interchanged with other kits unless the reagents are from an identical lot (i.e. they must display the required 6-digit lot numbers printed on the pack and given in the enclosed barcode table). Exceptions are Washing Solution POD, Stopping Solution POD and the Working Chromogen Solution (which is prepared from Chromogen TMB and Buffer/Substrate TMB using the required lots). 9.Buffer/Substrate TMB, Working Chromogen Solution and Stopping Solution POD must not be allowed to come into contact with heavy metal ions or oxidizing substances (do not use pipettes with metal parts which are in direct contact with the liquid). Do not perform the OWSE G13 C0541 (909) H/R 5 substrate reaction in the proximity of disinfectants containing hypochlorite. If the Working Chromogen Solution has developed a blue colour before transferral into the test plate, this indicates that the solution is contaminated; in such cases prepare a fresh solution in a clean container. Skin contact with the above-mentioned solutions is to be avoided. 10.The test plate should be protected from vibration during the incubation phase (e.g. placed on a secured floatation aid, or in a non-circulating water bath); the wells of the plate must be in contact with the thermostated water. If stabilizers are used to prevent microbial contamination of the water, care must be taken that neither the surface of the test plate nor the wells come into contact with these solutions since such contamination can lead to unspecific reactions. 11. Highly reactive samples may cause precipitation of the dye during the stopping reaction. This does not interfere with the photometric evaluation. 12.The control sera have been prepared from native human sera. As a result, turbidity may occur but this has no effect on the test result. 13.Dade Behring has validated use of these reagents on various analyzers to optimize product performance and meet product specifications. User defined modifications are not supported by Dade Behring as they may affect performance of the system and assay results. It is the responsibility of the user to validate modifications to these instructions or use of the reagents on analyzers other than those included in Dade Behring Application Sheets or these instructions for use. 14.Results of this test should always be interpreted in conjunction with the patient’s medical history, clinical presentation and other findings. Specific Performance Characteristics Sensitivity and Specificity The results of the study on sensitivity and specificity are summarized in Tables 2 + 3 (see Appendix). To establish the sensitivity, a total of 192 anti-HBc/IgM-positive samples were investigated. All the tested samples were found to be positive as defined by the criteria of the Enzygnost* AntiHBc/IgM test. Nevertheless the possibility cannot be ruled out that isolated samples may escape detection when the test is used on a large scale. To establish the specificity, a total of 2559 anti-HBc/IgM-negatvie samples were investigated and the specificty was found to be 99.60% to 99.91% (initial testing) and 99.91% to 100% (retest result). Deviations from these findings may occur due to variations in sample population, test procedure, etc. Current knowledge indicates that a positive result in the anti-HBc/IgM test does not yield definite evidence of HBV infection, just as a negative test result also does not definitely exclude HBV infection. Reproducibility The results on intra-assay and inter-assay reproducibility are summarized in Table 4 (in the Appendix). The data shown below are typical results. Depending on various factors (procedure, etc), different values may well be obtained. * Enzygnost is a registered trademark of Dade Behring Marburg GmbH in Germany and other countries. BEP is a registered trademark of Dade Behring Marburg GmbH in the USA, in Germany and other countries. Boviserin is a registered trademark of Aventis Behring. Dade Behring Marburg GmbH Emil-von-Behring-Str. 76 D-35041 Marburg www.dadebehring.com USA Distributor: Dade Behring Inc. Newark, DE 19714 U.S.A. OWSE G13 C0541 (909) H/R 6 0197 Tab. 1 Stability and Storage Material/reagent State Storage Stability• diluted sample 1+100 diluted with Sample Buffer (Anti-HBc/IgM) +2 to +8 °C 24 hours Test plate (remaining strips) once opened +2 to +8 °C 6 weeks HBcAg/POD Conjugate once opened +2 to +8 °C 4 weeks Conjugate Buffer (Anti-HBc/IgM) once opened +2 to +8 °C 4 weeks Working Conjugate Solution 1+10 +2 to +8 °C 4 weeks +18 to +25 °C 1 week +2 to +8 °C 4 weeks +2 to +8 °C 4 weeks +2 to +8 °C 4 weeks in the bag with the desiccant Sample Buffer (Anti-HBc/IgM) once opened Anti-HBc/IgM Control Serum, positive once opened Anti-HBc/IgM Control Serum, negative Chromogen TMB once opened +2 to +8 °C expiry date Buffer/Substrate TMB once opened +2 to +8 °C expiry date Working Chromogen Solution 1+10 +2 to +8 °C +18 to +25 °C closed container, protected from light 5 days 8 hours Wash Solution POD (concentrate) undiluted once opened 1:20 1:20 +2 to +8 °C +2 to +8 °C +18 to +25 °C expiry date 1 week 1 day Stopping Solution POD once opened +2 to +8 °C expiry date • use each component by the expiry date at the latest OWSE G13 C0541 (909) H/R 7 Tab. 2 Sensitivity The sensitivity studies yielded the following data: Sample panel Number of samples Acute HBV Infection 192 Enzygnost* Anti-HBc/IgM Initially reactive Retest reactive 192 n.d. Tab. 3 Specificity The specificity studies at two independent centres (W, R) yielded the following data: Sample panel Number of sample (W) normal negative serum samples (W) normal negative plasma samples (R) patient panel 997 501 1061 Enzygnost* Anti-HBc/IgM Initially reactive Retest reactive 2 2 1 0 0 1 Tab. 4 Reproducibility Sample FP 1 FP 2 FP 3 FP 4 Sample FP 1 FP 2 FP 3 FP 4 Intra-assay Mean absorbance 0.236 0.182 0.155 0.159 Inter-assay Mean absorbance 0.158 0.113 0.125 0.104 OWSE G13 C0541 (909) % CV 4.3 6.8 6.3 5.7 % CV 10.9 5.9 5.8 16.9 H/R 8 In a study on intra-assay reproducibility the samples were each tested in 20-fold determinations (FP 2, n=18). In the study on inter-assay reproducibility the samples were each tested in 3-fold determinations in 5 independent runs. Tab. 5 Test procedure and programming Enzygnost* Anti-HBc/IgM Menu programming Test procedure (BEP® II, BEP® III, BEP® 2000) for the BEP® 2000 Prepare reagents BEP® II MENU NO 4 x 10 µL Control Serum, negative 2 x 10 µL Control Serum, positive 10 µL prediluted sample each OPERATE 1 NO OPERATE 2 YES Dispense conjugate ® ® BEP II 15 min (max 30 min) (+18 to +25 °C) BEP III in the case of partially filled plates: Add waterfilled strips to make up to half a plate 100 µL Working Conjugate Solution 100 1 NO OPERATE 3 YES Wash and dispense chromogen 60 min ± 2 min (37 ± 1 °C) Wash 4x: BEP® II Automatic processing WASHINGS ASPIRATE SOAKTIME DISP VOL CHANNEL NO PHOT 4 NO 0 100 4 NO OPERATE 4 YES Dispense Stopping Solution 100 µL Working Chromogen Solution 30 min ± 2 min (+18 to +25 °C protected from light) 100 µL Stopping Solution after max. 1 h Evaluate at 450 nm (Referencewavelength: 650 nm) Test result OWSE G13 C0541 (909) WASHINGS ASPIRATE SOAKTIME DISP VOL CHANNEL NO PHOT H/R 9 WASHINGS ASPIRATE SOAKTIME DISP VOL CHANNEL NO 0 NO 0 100 5 PHOT YES MEAS WL REF WL BLK COR EVAL MODE GEN CUT NEG CONT MAX NEG MIN NEG FACT NEG MAX POS THRESH CUT OFF 450 650 NO 1 NO 4 0.1 0.07 - Enzygnost* Anti-HBc/IgM Anwendungsbereich Enzymimmunoassay zum qualitativen Nachweis von IgM-Antikörpern gegen das Hepatitis B (core)-Antigen in Serum oder Plasma. Die Abarbeitung des Enzymimmunoassays erfolgt mit den ELISA Prozessoren BEP® II, BEP® III und BEP® 2000. Der Test wurde entwickelt für die Untersuchung von Einzelproben, nicht von gepoolten Proben. Das Produkt darf nur für in vitro diagnostische Zwecke angewendet werden. Diagnostische Bedeutung IgM-Antikörper gegen das Hepatitis B (core)-Antigen (Anti-HBc/IgM) werden in nahezu allen Fällen einer akuten Hepatitis-B-Infektion bereits kurz nach dem Beginn der Virusvermehrung gebildet und bleiben für ungefähr 7 bis 17 Wochen in der Zirkulation. Aus diesem Grunde kann die Anti-HBc/IgM-Bestimmung als einziger Parameter für eine relativ sichere Diagnose einer akuten Hepatitis-B-Infektion herangezogen werden, da HBsAg und HBeAg auch bei chronischen Hepatitiden im Serum auftreten können und somit für die Differentialdiagnose das Heranziehen weiterer Parameter (Anti-HBs, Anti-HBe oder Anti-HBc) notwendig machen. In einigen Fällen einer akuten Hepatitis-B-Infektion können die HBs- und HBeAntigene beim Auftreten von klinischen Symptomen bereits verschwunden, die entsprechenden Antikörper aber noch nicht meßbar sein. Eine Bestimmung von Gesamt-Anti-HBc würde in einem solchen Falle keine Aufklärung bringen, da es sich hierbei um Langzeit-Antikörper handelt, die auch noch Jahre nach einer Erkrankung möglicherweise als einzige Antikörper zirkulieren können. Die Anti-HBc/IgM-Bestimmung kann diese diagnostische Lücke schließen 1. Prinzip der Methode Die in der Untersuchungsprobe vorhandenen HBc/IgM-Antikörper binden sich an die auf der Oberfläche der Mikrotitrationsplatte fixierten Anti-Human-IgM-Antikörper. An die spezifischen HBc/IgM-Antikörper wird POD-markiertes HBc-Antigen gebunden. Nach Entfernung des überschüssigen Konjugates und der ungebundenen Probenbestandteile wird die Enzymreaktion des gebundenen Konjugates bestimmt (blaue Farbreaktion). Die enzymatische Umsetzung des Chromogens wird durch den Zusatz von Stopplösung POD unterbrochen (gelbe Farbreaktion). Die Farbintensität ist der in der Probe vorhandenen Antikörperkonzentration proportional. Reagenzien Inhalt der Handelspackung Enzygnost* Anti-HBc/IgM 1 x 96 Enzygnost* Anti-HBc/IgM Testplatte HBcAg/POD-Konjugat Konjugatpuffer (Anti-HBc/IgM) Proben-Puffer (Anti-HBc/IgM) Anti-HBc/IgM-Kontroll-Serum, positiv Anti-HBc/IgM-Kontroll-Serum, negativ Waschlösung POD (Konzentrat)** Puffer/Substrat TMB** Chromogen TMB** Stopplösung POD** Leerflasche für Chromogen-Gebrauchslösung Abklebefolien PE-Beutel zur Aufbewahrung nicht benötigter Riegel Barcode-Tabelle Packungsbeilage 1 Stück 3 x 0,6 ml 3 x 6 ml 3 x 40 ml 1 x 0,3 ml 1 x 0,5 ml 1 x 100 ml 1 x 30 ml 1 x 3 ml 1 x 100 ml 1 Stück 6 Stück 1 Stück 1 Stück 1 Stück ** Diese Komponenten sind auch Bestandteile der Packung Zusatz-Reagenzien für Enzygnost* TMB (Bestell-Nr. OUVP). OWSE G13 C0541 (909) H/R 10 Ausgabe Februar 2004 Zusammensetzung Enzygnost* Anti-HBc/IgM (Testplatte): Mit monoklonalen Antikörpern gegen Human-IgM beschichtete Mikrotitrationsplatte. HBcAg/POD-Konjugat: Gentechnologisch hergestelltes HBc-Antigen, Peroxidase (POD)-konjugiert. Konservierungsmittel: Phenol (max. 1 g/l) Konjugat-Puffer (Anti-HBc/IgM): Tris-Puffer mit Boviserin® und Tween 20. Konservierungsmittel: Phenol (max. 1 g/l) Proben-Puffer (Anti-HBc/IgM): Tris-Puffer mit Glycerin, Boviserin® und Tween 20. Konservierungsmittel: Phenol (max. 1 g/l) Anti-HBc/IgM-Kontroll-Serum, positiv: stabilisiertes Humanserum mit IgM-Antikörpern gegen HBc-Antigen, verdünnt in Proben-Puffer, Extinktionsrichtwert: ≥ 0,7. Konservierungsmittel: Phenol (max. 1 g/l). Anti-HBc/IgM-Kontroll-Serum, negativ: stabilisiertes Humanserum ohne Antikörper gegen HBc-Antigen, verdünnt in Proben-Puffer, Extinktionsrichtwert: ≤ 0,1. Konservierungsmittel: Phenol (max. 1 g/l). Waschlösung POD (Konzentrat): Tween-haltige Phosphat-Pufferlösung. Konservierungsmittel: Phenol (max. 1 g/l) Puffer/Substrat TMB: Wasserstoffperoxid (ca. 0,1 g/l) in Acetat-Pufferlösung. Konservierungsmittel: n-Butanol (max. 1%) Chromogen TMB: Tetramethylbenzidin-dihydrochlorid Stopplösung POD: 0,5 N Schwefelsäure Warnungen und Vorsichtsmaßnahmen 1. Nur zur in vitro diagnostischen Anwendung. 2. Jede individuelle Blutspende, die zur Herstellung der Kontroll-Sera vorgesehen ist, wurde auf HBsAg, auf Anti-HIV1, Anti-HIV2 und auf Anti-HCV untersucht. Für die Herstellung von AntiHBc/IgM-Kontroll-Serum, negativ wurden nur Spenden mit negativem Befund verwendet. Für die Herstellung von Anti-HBc/IgM-Kontroll-Serum, positiv wurden nur Spenden mit negativem Anti-HIV1-, Anti-HIV2- und Anti-HCV-Befund verwendet. Unabhängig davon sollten alle aus menschlichem Blut gewonnenen Materialien wegen nie auszuschließender Gefährdung durch Krankheitserreger mit angemessener Sorgfalt unter Einhaltung der bei Biogefährdung empfohlenen Sicherheitsmaßnahmen gehandhabt werden2. Dies gilt insbesondere auch für das Anti-HBc/IgM-Kontroll-Serum, positiv, da durch das Herstellungsverfahren eine Virusinaktivierung nicht garantiert werden kann. 3. Das Tragen von Untersuchungshandschuhen während der gesamten Testdurchführung wird angeraten. 4. Für die Entsorgung fester infektiöser Materialien empfiehlt sich eine Autoklavierung von mindestens 1 Stunde bei +121 °C. Alle abgesaugten Lösungen sind in zwei hintereinandergeschalteten Vorlagen zu sammeln. Die Vorlagen sollten ein Desinfektionsmittel enthalten, das geeignet ist, human-pathogene Viren zu inaktivieren. Die vom Hersteller angegebenen Konzentrationen und Einwirkungszeiten müssen beachtet werden. Vorbereitung der Reagenzien Alle Reagenzien und Proben vor Testbeginn auf +18 bis +25 °C erwärmen. Dabei die Testplatte nicht dem Behältnis entnehmen. Je Testplatte 20 ml Waschlösung POD mit destilliertem oder entionisiertem Wasser auf 400 ml verdünnen. Chromogen-Gebrauchslösung: Je Testplatte 1 ml Chromogen TMB mit 10 ml Puffer/Substrat TMB in der mitgelieferten Kunststoffflasche verdünnen und verschlossen unter Lichtschutz aufbewahren. Flasche nach Gebrauch sorgfältig mit destilliertem Wasser spülen. Wegen technisch bedingter Überfüllung ist das Zusammengießen der Flascheninhalte von Chromogen TMB und Puffer/Substrat TMB nicht zulässig. Alle zu untersuchenden Proben, nicht jedoch die Kontrollsera, werden in einem Röhrchen 1+100 mit Proben-Puffer (Anti-HBc/IgM) vorverdünnt (z. B. 10 µl) Proben + 1000 µl ProbenPuffer (Anti-HBc/IgM). Konjugat-Gebrauchslösung: Dem HBcAg/POD-Konjugat ist die benötigte Menge zu entnehmen und mit dem Konjugat-Puffer (Anti-HBc/IgM) 1+10 zu verdünnen. Für eine halbe Testplatte 0,6 ml HBcAg/POD-Konjugat zu einer Originalabfüllung (6 ml) Konjugat-Puffer (Anti-HBc/IgM) zupipettieren (1+10). OWSE G13 C0541 (909) H/R 11 Haltbarkeit und Lagerungsbedingungen Ungeöffnet sind alle Bestandteile der Kombinationspackung Enzygnost* Anti-HBc/IgM bei der angegebenen Lagertemperatur bis zu den auf den Etiketten angegebenen Daten verwendbar. Die Haltbarkeit und Lagerbedingungen der geöffneten bzw. gebrauchsverdünnten Reagenzien sind der Tabelle 1 im Anhang zu entnehmen. Erforderliche Geräte: Zur automatischen Durchführung der Reagenzien-Dosierung und der WaschBEP® II: schritte BEP® III: Zur automatischen Testabarbeitung nach der Probendosierung sowie Auswertung BEP® 2000: Zur vollautomatischen Testabarbeitung sowie Auswertung Pipetten: Kolbenhubpipetten 25, 100 und 1000 µl Inkubator: Bedecktes Wasserbad (+37 ± 1 °C) oder vergleichbare Inkubationsmethoden Alle zur Testdurchführung eingesetzten Geräte müssen validiert sein. Untersuchungsmaterial Zur Untersuchung können Einzelproben (Human-Seren oder -EDTA/Heparin/Citrat-Plasmen) verwendet werden, welche nach Standard-Labortechniken entnommen wurden. Die Proben sollten maximal 3 Tage bei +2 bis +8 °C gelagert werden. Zur längeren Lagerung sind die Proben einzufrieren. Testdurchführung Testdurchführung mit BEP® II 1. Proben-Dosierung: In 4 Vertiefungen je 10 µl Anti-HBc/IgM-Kontroll-Serum, negativ, in eine Vertiefung 10 µl Anti-HBc/IgM-Kontroll-Serum, positiv, in die folgenden Vertiefungen je 10 µl vorverdünnte Probe und am Ende der Serie bzw. Testplatte noch einmal 10 µl Anti-HBc/IgMKontroll-Serum, positiv dosieren, mit Folie abkleben. Die Pipettiervorgänge müssen innerhalb 15 min pro Testplatte durchgeführt werden. 2. Proben-Inkubation: Mind. 15 min (max. 30 min) bei Raumtemperatur (+18 bis +25 °C) inkubieren. 3. Konjugat-Dosierung: Folie abziehen und ohne vorher zu waschen, je 100 µl der KonjugatGebrauchslösung pro Bestimmung zupipettieren, mit neuer Folie abkleben und anschließend in den Inkubator stellen. 4. Konjugat-Inkubation: 60 min ± 2 min bei +37 °C ± 1 °C inkubieren, Waschvorgang unmittelbar anschließen. 5. Waschen: Folie abziehen, alle Vertiefungen aussaugen und mit je ca. 0,3 ml Waschlösung 4 bzw. 5mal (siehe Hinweis) waschen. 6. Substrat-Dosierung: In jede Vertiefung 100 µl der Chromogen-Gebrauchslösung einfüllen, Platte mit neuer Folie abkleben. 7. Substrat-Inkubation: 30 min ± 2 min bei +18 bis +25 °C lichtgeschützt inkubieren. 8. Stoppreaktion: Folie entfernen. Je Vertiefung 100 µl Stopplösung POD zugeben, dabei den gleichen Zeittakt wie bei Punkt 6. einhalten. 9. Messung: Innerhalb einer Stunde bei 450 nm photometrieren. Die Verwendung eines Photometers mit zwei Wellenlängen (Meß- und Referenzstrahl) ist empfehlenswert. Die Extinktionsmessung der Kontroll- und Patientenproben erfolgt bei 450 nm, als Wellenlänge der Referenzmessung wird 650 nm (ggfs. zwischen 615 und 690 nm) empfohlen. OWSE G13 C0541 (909) H/R 12 Testdurchführung mit BEP® III Bei der Abarbeitung mit BEP® III müssen die Testplatten einschließlich der Probendosierung (Punkt 1 der "Testdurchführung mit BEP® II") vorbereitet werden. Unmittelbar im Anschluss daran werden die Testplatten offen, d.h. nicht mit Folie abgeklebt, in den BEP® III eingegeben. Dabei ist zu beachten, dass teilbestückte Testplatten mit "Wasserriegeln" auf mindestens halbe Testplatten (6 Testriegel) zu ergänzen sind. Die anschließende Testabarbeitung erfolgt vollautomatisch (siehe BEP® III-Bedienungsanleitung). Die in der BEP® III Software eingestellten Inkubationszeiten können auf Grund der technischen Rahmenbedingungen (Gerätetaktung) von denen der BEP® II Prozessierung abweichen, sind jedoch in der Kombination BEP® III/Enzygnost* validiert worden. Testdurchführung mit BEP® 2000 Die Probendosierung und anschließende Testabarbeitung erfolgt vollautomatisch im Gerät (siehe BEP® 2000-Bedienungsanleitung). Testvalidierung Die Einzelwerte der Extinktionen für die Kontroll-Sera werden zur Berechnung der Mittelwerte eingesetzt, wenn -0,010 ≤ Eneg. ≤ 0,1 Epos. ≥ 0,7 Von den Extinktionswerten des Anti-HBc/IgM-Kontroll-Serums, negativ, kann ein außerhalb der Spezifikation liegender Wert vernachlässigt werden. Die Extinktionswerte der positiven Kontrolle müssen beide die Spezifikation erfüllen. Werden diese Bedingungen nicht erfüllt, ist der Test zu wiederholen. Testauswertung Die Auswertungen erfolgen mit BEP® 2000 und BEP® III automatisch. Bitte dazu die Bedienungsanleitungen heranziehen. Die nachfolgenden Kapitel sind bei Auswertung ohne Softwareunterstützung zu beachten. Aus den Extinktionswerten der negativen Kontrollen wird der Mittelwert gebildet. Zur Grenzwertberechnung wird zum Extinktionsmittelwert der negativen Kontrollen ein Wert von 0,07–addiert: Eneg. + 0,07 = Grenzwert (cut off) Um Ergebnisse nahe dem Grenzwert besser abzusichern, wurde eine grenzwertige Zone definiert: Grenzwert ± 10% Nach den Kriterien des Tests werden die Untersuchungsproben wie folgt klassifiziert: Testergebnis: ^ HBc/IgM-Antikörper-negativ 1. EProbe < cut off – 10% = ^ HBc/IgM-Antikörper-positiv 2. EProbe > cut off + 10% = ^ grenzwertig 3. cut off - 10% ≤ EProbe ≤ cut off + 10% = Untersuchungsproben mit einem grenzwertigen Testergebnis sollten erneut getestet werden. Ist auch danach keine Zuordnung der Proben als positiv oder negativ möglich, lautet das Testergebnis „grenzwertig“. Einschränkungen der Testdurchführung 1.Antikoagulantien wie Heparin, EDTA und Citrat beeinflussen das Testergebnis nicht. 2.Lipämische, ikterische oder hämolytische Proben führen zu keiner Testbeeinträchtigung. In seltenen Einzelfällen können Proben mit hohem Rheumafaktor- und gleichzeitig hohem antiHBc-Gehalt zu erhöhten Signalen führen. 3.Proben mit Antikörpern gegen CMV, HAV, HIV, HCV, Rubella-Virus sowie Anti-HBs positive Proben beeinflussen das Testergebnis nicht. 4.Mit Proben von Patienten mit erhöhten Transaminasen-Werten sowie mit Auto-Antikörperoder ANA-haltigen Proben wurde keine Beeinflussung des Testergebnisses beobachtet. 5.Proben mit Antikörpern gegen EBV sowie Proben von Hämodialyse-Patienten können erhöhte Reaktivität zeigen. 6.Ungenügend geronnene Seren, natriumazidhaltiges Probenmaterial und mikrobiell kontaminierte Untersuchungsproben sollten nicht eingesetzt werden. Eventuell vorhandene partikuläre Komponenten (z.B. Fibrin-Gerinnsel) sollten vor der Testdurchführung entfernt werden. 7.Bei aufgetauten Proben ist auf eine gute Homogenisierung des Materials zu achten. OWSE G13 C0541 (909) H/R 13 8.Die Reagenzien (ausgenommen Waschlösung POD, Stopplösung POD und die aus den chargengebundenen Reagenzien Chromogen TMB und Puffer/Substrat TMB hergestellte Chromogen-Gebrauchslösung) sind nur chargengebunden zu verwenden, d.h. nur in der Kombination der einzelnen 6-ziffrigen Chargen-Bezeichnung, die auf der Packung aufgedruckt bzw. der separat beigepackten Barcode-Tabelle zu entnehmen sind. 9.Puffer/Substrat TMB, Chromogen-Gebrauchslösung und Stopplösung POD dürfen nicht in Kontakt mit Schwermetallionen oder oxidierenden Substanzen kommen (keine Pipetten mit flüssigkeitsführenden Metallteilen verwenden). Die Substratreaktionen nicht in der Nähe von Hypochlorit-haltigen Desinfektionsmitteln durchführen. Eine spontane Blaufärbung der Chromogen-Gebrauchslösung vor der Übertragung in die Testplatte deutet auf Kontamination hin; eine frische Lösung ist in einem sauberen Gefäß anzusetzen. Hautkontakt mit den vorgenannten Lösungen ist zu vermeiden. 10.Die Testplatte soll während der Inkubation ruhig liegen (z.B. auf fixierter Schwimmhilfe oder im nicht zirkulierenden Wasserbad); die Kavitäten sind dabei in Kontakt mit dem temperierten Wasser. Werden Stabilisatoren zur Verhinderung der Verkeimung des Wassers verwendet, so ist sorgfältig darauf zu achten, dass weder die Testplattenoberfläche noch die Näpfchen mit diesen Lösungen in Kontakt kommen, da dadurch unspezifische Reaktionen hervorgerufen werden könnten. 11. Bei stark reaktiven Proben kann bei der Stoppreaktion der Farbstoff ausfallen. Die photometrische Auswertung wird dadurch nicht beeinflusst. 12.Die Kontrollsera sind unter Verwendung nativer Humansera hergestellt. Daher können Trübungen auftreten, die das Testergebnis jedoch nicht beeinflussen. 13.Dade Behring hat den Einsatz dieser Reagenzien auf verschiedenen Analysengeräten auf optimale Produktleistung und Einhaltung der Produktspezifikationen überprüft. Vom Benutzer vorgenommene Änderungen werden von Dade Behring nicht unterstützt, da sie die Leistung des Systems und die Testergebnisse beeinflussen können. Es liegt in der Verantwortung des Benutzers, Änderungen an diesen Anleitungen oder die Verwendung dieser Reagenzien auf anderen als in den Applikationsvorschriften von Dade Behring oder diesen Gebrauchsanweisungen genannten Analysengeräten zu validieren. 14.Resultate dieses Tests sollten stets in Verbindung mit der Vorgeschichte des Patienten, dem klinischen Bild und anderen Untersuchungsergebnissen interpretiert werden. Leistungsmerkmale des Tests Sensitivität und Spezifität Die Ergebnisse zur Prüfung der Sensitivität und Spezifität sind in den Tabellen 2 und 3 (im Anhang) zusammengefaßt. Bei der Ermittlung der Sensitivität wurden 192 anti-HBc/IgM positive Proben untersucht. Alle getesteten Proben wurden nach den Kriterien des Enzygnost* Anti-HBc/IgM positiv gefunden. Unabhängig davon kann nicht ausgeschlossen werden, dass sich bei breiter Anwendung des Tests einzelne Proben dem Nachweis entziehen können. Bei der Ermittlung der Spezifität wurden 2559 anti-HBc/IgM negative Proben untersucht und eine Spezifität von 99,60% bis 99,91% (initiale Testung) bzw. 99,91% bis 100% (Retestung) ermittelt. Bedingt durch das Untersuchungskollektiv, die Testdurchführung u.a., sind abweichende Werte möglich. Nach derzeitigem Kenntnisstand kann aus einem positiven Ergebnis der anti-HBc/IgM-Testung nicht mit Sicherheit eine HBV-Infektion abgeleitet werden, wie auch ein negatives Testergebnis keineswegs eine HBV-Infektion sicher ausschließt. Reproduzierbarkeit Die Ergebnisse zur Intra/Inter-assay-Reproduzierbarkeit sind in der Tabelle 4 (im Anhang) zusammengefaßt. Es handelt sich hierbei um beispielhaft ermittelte Daten. Abhängig von der Testdurchführung u.a. sind durchaus abweichende Werte möglich. * Enzygnost ist eine eingetragene Marke der Dade Behring Marburg GmbH in Deutschland und anderen Ländern. BEP ist eine eingetragene Marke der Dade Behring Marburg GmbH in den USA, Deutschland und anderen Ländern. Boviserin ist eine eingetragene Marke von Aventis Behring. Dade Behring Marburg GmbH Emil-von-Behring-Str. 76 D-35041 Marburg www.dadebehring.com OWSE G13 C0541 (909) H/R 14 0197 Tab. 1 Haltbarkeit und Lagerungsbedingungen Material/Reagenz Zustand Lagerung Stabilität• verdünnte Untersuchungsprobe 1+100 verdünnt mit Proben-Puffer (Anti-HBc/IgM) +2 bis +8 °C 24 Stunden Testplatte (restliche Riegel) nach Öffnen +2 bis +8 °C 6 Wochen HBcAg/POD-Konjugat nach Öffnen +2 bis +8 °C 4 Wochen Konjugat-Puffer (Anti-HBc/IgM) nach Öffnen +2 bis +8 °C 4 Wochen Konjugat-Gebrauchslösung 1+10 +2 bis +8 °C 4 Wochen +18 bis +25 °C 1 Woche +2 bis +8 °C 4 Wochen +2 bis +8 °C 4 Wochen +2 bis +8 °C 4 Wochen im Beutel mit Trockenkapseln Proben-Puffer (Anti-HBc/IgM) nach Öffnen Anti-HBc/IgM-Kontroll-Serum, positiv nach Öffnen Anti-HBc/IgM-Kontroll-Serum, negativ Chromogen TMB nach Öffnen +2 bis +8 °C bis Verfallsdatum Puffer/Substrat TMB nach Öffnen +2 bis +8 °C bis Verfallsdatum +2 bis +8 °C +18 bis +25 °C geschlossenes Gefäß, lichtgeschützt 5 Tage 8 Stunden Chromogen-Gebrauchslösung 1+10 Waschlösung POD (Konzentrat) unverdünnt nach Öffnen 1:20 1:20 +2 bis +8 °C +2 bis +8 °C +18 bis +25 °C bis Verfallsdatum 1 Woche 1 Tag Stopplösung POD nach Öffnen +2 bis +8 °C bis Verfallsdatum • in keinem Fall länger als bis zum Verfallsdatum OWSE G13 C0541 (909) H/R 15 Tab. 2 Sensitivität Bei den Untersuchungen zur Sensitivität wurden folgende Daten ermittelt: Probenkollektiv Probenanzahl akute HBV Infektion 192 Enzygnost* Anti-HBc/IgM initial reaktiv retest reaktiv 192 n.d. Tab. 3 Spezifität Bei den Untersuchungen zur Spezifität wurden an zwei unabhängigen Zentren (W, R) folgende Daten ermittelt: Probenkollektiv Probenanzahl (W) normal negative Seren (W) normal negative Plasmen (R) Patientenkollektiv 997 501 1061 Enzygnost* Anti-HBc/IgM initial reaktiv retest reaktiv 2 2 1 0 0 1 Tab. 4 Reproduzierbarkeit Probe FP 1 FP 2 FP 3 FP 4 Probe FP 1 FP 2 FP 3 FP 4 Intra-assay Extinktionsmittelwert 0,236 0,182 0,155 0,159 Inter-assay Extinktionsmittelwert 0,158 0,113 0,125 0,104 OWSE G13 C0541 (909) % VK 4,3 6,8 6,3 5,7 % VK 10,9 5,9 5,8 16,9 H/R 16 Bei der Untersuchung zur Intra-assayReproduzierbarkeit wurden die Proben in jeweils 20-fach-Bestimmung (FP 2, n=18) getestet. Bei der Untersuchung zur Inter-assayReproduzierbarkeit wurden die Proben in jeweils 3-fach-Bestimmung in 5 unabhängigen Läufen getestet. Tab. 5 Testdurchführung und -programmierung Enzygnost* Anti-HBc/IgM Testdurchführung (BEP® II, BEP® III, BEP® 2000) Vorbereitung der Reagenzien BEP® 2000 Menüprogrammierung für den BEP® II MENU NO 4 x 10 µl Kontroll-Serum, negativ 2 x 10 µl Kontroll-Serum, positiv je 10 µl vorverdünnte Probe OPERATE 1 NO OPERATE 2 YES Dosierung Konjugat BEP® II 15 min (max 30 min) (+18 bis +25 °C) BEP® III teilbestückte Platten mit „Wasserriegeln“ auf halbe Platten ergänzen 100 µl KonjugatGebrauchslösung 100 1 NO OPERATE 3 YES Waschen und Dosierung Chromogen 60 min ± 2 min (37 ± 1 °C) automatische Testabarbeitung 4x Waschen: BEP® II 100 µl Chromogen Gebrauchslösung WASHINGS ASPIRATE SOAKTIME DISP VOL CHANNEL NO PHOT 4 NO 0 100 4 NO OPERATE 4 YES Dosierung Stopplösung 30 min ± 2 min (+18 bis +25 °C lichtgeschützt) 100 µl Stopplösung nach maximal 1 h Auswertung 450 nm (Referenzwellenlänge: 650 nm) Testergebnis OWSE G13 C0541 (909) WASHINGS ASPIRATE SOAKTIME DISP VOL CHANNEL NO PHOT H/R 17 WASHINGS ASPIRATE SOAKTIME DISP VOL CHANNEL NO 0 NO 0 100 5 PHOT YES MEAS WL REF WL BLK COR EVAL MODE GEN CUT NEG CONT MAX NEG MIN NEG FACT NEG MAX POS THRESH CUT OFF 450 650 NO 1 NO 4 0.1 0.07 - Enzygnost* Anti-HBc/IgM Domaine d’utilisation Test immunoenzymatique pour la détection qualitative des anticorps IgM dirigés contre l’antigène de core de l’hépatite B dans le sérum ou le plasma. La réalisation du test immunoenzymatique se fait à l’aide des ELISA Processeurs BEP® II, BEP® III et BEP® 2000. Le test a été mis au point pour l'analyse d'échantillons individuels, et non de pools d'échantillons. Le produit ne doit être utilisé qu'à des fins de diagnostic in vitro. Intérêt diagnostique Des anticorps IgM anti-antigène de core de l’hépatite B sont formés dans presque tous les cas d’hépatite B aiguë peu de temps après le début de la réplication du virus, et persistent dans la circulation pendant environ 7 à 17 semaines. Le dosage de l’anti-HBc/IgM peut donc être utilisé comme seul paramètre pour un diagnostic relativement fiable d’hépatite B aiguë, dans la mesure où l’AgHBs et l’AgHBe peuvent également apparaître dans le sérum en cas d’hépatite chronique, rendant ainsi le dosage d’autres marqueurs (anti-HBs, anti-HBe ou anti-HBc) indispensables pour un diagnostic différentiel. Dans certains cas d’hépatite B aiguë, les antigènes HBs et HBe peuvent disparaître dès l’apparition des symptômes cliniques, alors que les anticorps correspondants ne sont pas encore mesurables. Un dosage d’anti-HBc total n’apporte alors aucun éclaircissement, dans la mesure où il s’agit d’un anticorps qui peut circuler à taux résiduel des années après la maladie. Le dosage de l’anti-HBc/IgM permet de combler cette lacune 1. Principe de la méthode Les anticorps IgM anti-HBc présents dans l’échantillon à tester se lient aux anticorps anti-IgM humaine fixés à la surface de la plaque de microtitration. L’antigène HBc marqué à la POD se lie aux anticorps IgM anti-HBc spécifiques. Après élimination de l’excès de conjugué et des éléments non liés de l’échantillon, on mesure la réaction enzymatique du conjugué lié (réaction colorée bleue). La transformation enzymatique du chromogène est interrompue par l’addition de la Solution d’arrêt POD (réaction colorée jaune). L’intensité de la coloration est proportionnelle à la concentration d’anticorps dans l’échantillon. Réactifs Contenu du coffret Enzygnost* Anti-HBc/IgM 1 x 96 Enzygnost* Anti-HBc/IgM plaque-test Conjugué AgHBc/POD Tampon conjugué (Anti-HBc/IgM) Tampon échantillons (Anti-HBc/IgM) Sérum de contrôle positif anti-HBc/IgM Sérum de contrôle négatif anti-HBc/IgM Solution de lavage POD (concentrée)** Tampon/substrat TMB** Chromogène TMB** Solution d‘arrêt POD** Flacon vide pour solution d’emploi du chromogène Feuilles adhésives Sachet PE pour conservation des barrettes non utilisées Tableau de codes à barres Fiche technique 1 pièce 3 x 0,6 ml 3 x 6 ml 3 x 40 ml 1 x 0,3 ml 1 x 0,5 ml 1 x 100 ml 1 x 30 ml 1 x 3 ml 1 x 100 ml 1 pièce 6 pièces 1 pièce 1 pièce 1 pièce ** Ces éléments font également partie du Coffrert de réactifs complémentaries pour Enzygnost* TMB (code OUVP). OWSE G13 C0541 (909) H/R 18 Edition Février 2004 Composition Enzygnost* Anti-HBc/IgM (plaque-test) : plaque de microtitration recouverte d’anticorps monoclonaux anti-IgM humaine. Conjugué AgHBc/POD : antigène HBc obtenu par génie génétique, conjugué à la peroxydase (POD). Agent de conservation : phénol (max. 1 g/l) Tampon conjugué (anti-HBc/IgM) : tampon Tris additionné de Boviserin® et de Tween 20. Agent de conservation : phénol (max. 1 g/l) Tampon échantillons (anti-HBc/IgM) : tampon Tris additionné de glycérine, de Boviserin® et de Tween 20. Agent de conservation : phénol (max. 1 g/l) Sérum de contrôle anti-HBc/IgM positif : sérum humain stabilisé contenant des anticorps IgM anti-AgHBc, dilué en Tampon échantillons, valeur de D.O. indicative : ≥ 0,7. Agent de conservation : phénol (max. 1 g/l) Sérum de contrôle anti-HBc/IgM négatif : sérum humain stabilisé exempt d’anticorps antiAgHBc,dilué en Tampon échantillons, valeur de D.O. indicative : ≤ 0,1. Agent de conservation : phénol (max. 1 g/l) Solution de lavage POD (concentrée) : solution tampon phosphate additionnée de Tween. Agent de conservation : phénol (max. 1g/l) Tampon/substrat TMB : peroxyde d’hydrogène (0,1 g/l) en solution tampon acétate. Agent de conservation : n-butanol (env. 1%) Chromogène TMB : tétraméthylbenzidine-dihydrochlorure Solution d’arrêt POD : acide sulfurique 0,5 N Mises en garde et précautions d‘emploi 1. Ne doit être employé que pour un usage in vitro. 2. Tout don de sang prévu pour la préparation des sérums de contrôle est soumis à des tests de dépistage d’AgHBs, d’anti-VIH1, d’anti-VIH2 et d’anti-VHC. Pour la préparation du Sérum de contrôle Anti-HBc/IgM négatif, seuls les dons trouvés négatifs ont été utilisés. Pour la préparation du Sérum de contrôle Anti-HBc/IgM positif, seuls les dons trouvés négatifs en anti-VIH1, anti-VIH2 et anti-VHC ont été utilisés. Indépendamment de cela, tout produit obtenu à partir de sang humain doit etre manipulé avec les precautions nécessaires en cas de risque biologique, dans la mesure où on ne peut exclure tout risque d’infection 2. Ceci vaut particulièrement pour le Sérum de contrôle anti-HBc/IgM positif, dans la mesure où le procédé de fabrication ne permet pas de garantir l’inactivation virale. 3. Il est recommandé de porter des gants de protection pendant toute la réalisation du test. 4. Pour décontaminer le matériel de laboratoire infecté, l’autoclaver pendant au moins 1 heure à +121 °C. Toutes les solutions aspirées doivent être récoltées dans deux récipients reliés l’un à l’autre et contenant chacun un désinfectant spécialement prévu pour inactiver les virus pathogènes pour l’homme. Respecter les concentrations et temps d’incubation indiqués par le fabricant. Préparation des réactifs Porter tous les réactifs et échantillons à +18/+25 °C avant le début du test, sans sortir la plaquetest de son emballage. Pour une plaque, diluer 20 ml de solution de lavage POD avec de l’eau distillée ou désionisée en complétant à 400 ml. Solution d’emploi du chromogène : pour une plaque, diluer 1 ml de Chromogène TMB avec 10 ml de Tampon/substrat TMB dans le flacon plastique vide inclus dans le coffret (solution d’emploi du chromogène), et la conserver dans le flacon fermé à l’abri de la lumière. Après emploi, bien rincer le flacon avec de l’eau distillée. Pour des raisons de capacité de flacon, il est impossible de verser la totalité du contenu d’un flacon de Chromogène TMB dans un flacon de Tampon/substrat TMB. Prédiluer tous les échantillons à tester, mais pas les sérums de contrôle, au 1/101 à l’aide du Tampon échantillons (anti-HBc/IgM) dans des tubes (par ex. 10 µl d’echantillon + 1000 µl de Tampon échantillons (anti-Hbc/IgM). Solution d’emploi du conjugué : prélever la quantité nécessaire de Conjugué AgHBc/POD et la diluer au 1/11 à l’aide du Tampon conjugué (anti-HBc/IgM). OWSE G13 C0541 (909) H/R 19 Pour une demi-plaque, ajouter 0,6 ml de Conjugué AgHBc/POD au contenu d’un flacon (6 ml) de Tampon conjugué (anti-HBc/IgM) (dilution au 1/11). Stabilités et conditions de conservation Avant leur ouverture, tous les éléments du coffret Enzygnost* Anti-HBc/IgM se conservent à la température indiquée jusqu'à la date indiquée sur l'étiquette. Pour les stabilités et conditions de conservation après ouverture des flacons et préparation des réactifs à leur dilution d'emploi, se reporter au tableau 1 en annexe. Matériel nécessaire: pour la distribution automatique des réactifs et l'automatisation des étapes de BEP® II: lavage BEP® III: pour l'automatisation du test après la distribution des échantillons et de l'exploitation des résultats BEP® 2000 : pour l’entière automatisation du test et de l’ exploitation des résultats Pipettes: pipettes à embout de 25, 100 et 1000 µl Incubateur: bain-marie couvert (+37 ± 1 °C) ou méthode d'incubation équivalente Tout le matériel utilisé pour la réalisation du test doit être validé. Echantillons à tester Utiliser des échantillons (sérums humains ou plasmas citratés, héparinés ou prélevés sur EDTA) obtenus selon les techniques standard des laboratoires. Les échantillons peuvent être conservés 3 jours maximum à +2/+8 °C. Pour une conservation plus longue, les congeler. Réalisation du test Réalisation du test à l’aide du BEP® II 1. Distribution des contrôles et échantillons : distribuer 10 µl de Sérum de contrôle Anti-HBc/IgM négatif dans 4 cupules, 10 µl de Sérum de contrôle Anti-HBc/IgM positif dans 1 cupule, 10 µl de chacun des chantillons à tester prédilués dans les cupules suivantes, puis, à la fin de la série ou de la plaque, de nouveau 10 µl de Sérum de contrôle Anti-HBc/IgM positif dans 1 cupule. Couvrir la plaque d’une feuille adhésive. Ces étapes de pipetage ne doivent pas durer plus de 15 mn par plaque. 2. Incubation des contrôles et échantillons : laisser incuber au moins 15 min (max. 30 min) à la température ambiante (+18/+25 °C). 3. Distribution du conjugué : retirer la feuille adhésive, ajouter dans chaque cupule 100 µl de la solution d’emploi du conjugué, couvrir d’une nouvelle feuille adhésive et placer la plaque dans l’incubateur. 4. Incubation du conjugué : laisser incuber 60 ± 2 min à +37 °C ± 1 °C, et enchaîner immédiatement le processus de lavage. 5. Lavage : retirer la feuille adhésive, aspirer le contenu de toutes les cupules, et distribuer dans chacune d’elles env. 0,3 ml de Solution de lavage; faire 4 à 5 lavages (cf. Remarque) 6. Distribution du substrat : ajouter dans chaque cupule 100 µl de la solution d’emploi du chromogène, et couvrir d’une nouvelle feuille adhésive. 7. Incubation du substrat : laisser incuber 30 ± 2 minutes à +18/+25 °C a l’abri de la lumière. 8. Arrêt de la réaction : retirer la feuille adhésive et ajouter dans chaque cupule 100 µl de Solution d’arrêt POD en respectant le même rythme qu’en 6. 9. Mesure : faire une mesure photométrique dans l’heure qui suit a 450 nm. Il est recommandé d’utiliser un photomètre avec deux longueurs d’onde (une de mesure et une de référence). La mesure de la densité optique des contrôles et des échantillons de patients se fait à 450 nm. La longueur d’onde de référence doit être de 650 nm (com-prise entre 615 et 690). Réalisation du test sur le BEP® III Pour une utilisation sur le BEP® III, les plaques-tests doivent être préparées jusqu’y compris la distribution des échantillons (point 1 du paragraphe «Réalisation du test sur le BEP® II»). Immédiatement après cette étape, placer la plaque ouverte, c’est-à-dire non recouverte d’une OWSE G13 C0541 (909) H/R 20 feuille adhésive, dans le BEP® III. Si la plaque n’est pas totalement utilisée, la compléter au moins pour moitié (6 barrettes) avec des barrettes remplies d’eau. La suite du test est ensuite effectuée entièrement automatiquement (cf. Manuel d’utilisation du BEP® III). Les temps d’incubation prévus dans le logiciel du BEP® III peuvent, du fait de conditions techniques (cadence de l’appareil), diverger par rapport à ceux du BEP® II. Ils ont toutefois été validés dans la combinaison BEP® III/Enzygnost*. Réalisation du test sur le BEP® 2000 La distribution des échantillons ainsi que la réalisation du test sont effectuées entièrement automatiquement par l’appareil (cf. Manuel d’utilisation du BEP® 2000). Validation du test Calculer les valeurs moyennes des sérums de contrôle à partir des différentes valeurs mesurées si: -0,010 ≤ D.O.neg. ≤ 0,1 – 0,010 ≤ D.O.pos. ≥ 0,7 Pour le sérum de contrôle négatif, une valeur sortant du domaine indiqué peut être négligée. Pour le sérum de contrôle positif, les deux valeurs obtenues doivent correspondre au domaine indiqué. Si ces critères ne sont pas obtenus, le test doit être recommencé. Exploitation du test L’exploitation des résultats est effectuée automatiquement par le BEP® 2000 et le BEP® III. Respecter les instructions indiquées pour l’appareil utilisé. Ci-dessous le protocole d’exploitation du test en l’absence d’un logiciel. Calculer la valeur moyenne des densités optiques du contrôle négatif. Pour– obtenir la valeur-seuil, ajouter 0,07 à cette valeur moyenne : – D.O.nég. + 0,07 = valeur-seuil (cut off) Afin de rendre plus fiables les résultats trouvés proches de la valeur-seuil, une zone grise a été définie comme suit : zone grise ± 10% Selon les critères du test, les échantillons sont classés comme suit: Résultat du test ^ Anticorps anti-HBc/IgM-negatif 1. D.O.échantillon < cut off - 10% = ^ Anticorps anti-HBc/IgM-positif 2. D.O.échantillon > cut off + 10% = ^ douteux 3. cut off - 10% ≤ D.O.échantillon ≤ cut off + 10% = Les échantillons trouvés dans la zone grise doivent être retestés une deuxième fois. Si le résultat du deuxième test ne permet toujours pas d’interpréter l’échantillon comme positif ni comme négatif, le rendre «douteux». Limites du test et sources d'erreurs 1.Les anticoagulants, comme l’héparine, l’EDTA et le citrate, n’ont pas d’influence sur le résultat du test. 2.Les échantillons lipémiques, ictériques ou hémolytiques n’ont pas d’influence sur le test. Dans certains cas, les échantillons ayant un taux élevé de facteurs rhumatoïdes et simultanément d’anti-HBc peuvent donner des signaux augmentés. 3.Une étude effectuée avec des échantillons contenant des anticorps anti-CMV, anti-HAV, antiVIH, anti-VHC et anti-virus de la rubéole, ainsi qu’avec des échantillons anti-HBs-positifs n’a montré aucune influence sur le test. 4.Une étude effectuée avec des échantillons de patients ayant des valeurs de transaminases élevées, ou contenant des auto-anticorps ou des ANA, n’a montré aucune influence sur le test. 5.Les échantillons contenant des anticorps anti-EBV ainsi que ceux provenant de patients hémodialysés peuvent présenter une réactivité augmentée. 6.Ne pas utiliser de sérums insuffisamment coagulés, ni d’échantillons contenant de l’azide de sodium ou contaminés. Les éventuelles particules (par ex. caillot de fibrine) doivent être éliminées avant le test. 7.Si on utilise des échantillons décongelés, veiller à bien les homogénéiser avant emploi. 8.Les réactifs (à l’exception de la Solution de lavage POD, de la Solution d’arrêt POD et de la solution d’emploi du chromogène obtenue à partir des lots de réactifs indiqués pour le Chromogène TMB et le Tampon/substrat TMB) ne peuvent être utilisés que selon la combinaison des numéros de lots à 6 chiffres indiqués sur le coffret et dans le tableau des codes à barres joint. 9.Le Tampon/substrat TMB, la solution d’emploi de Chromogène et la Solution d’arrêt POD ne doivent pas entrer en contact avec des ions de métaux lourds ni des substances oxydantes (ne pas utiliser de pipettes à parties métalliques au niveau du passage des solutions). OWSE G13 C0541 (909) H/R 21 La réaction du substrat ne doit pas être effectuée à proximité de désinfectants contenant de l’eau de Javel. Une coloration bleue de la solution d’emploi du chromogène avant son transfert dans la plaque indique une contamination ; préparer une nouvelle solution dans un récipient propre. Eviter tout contact de la peau avec les solutions sus-mentionnées. 10.La plaque doit rester immobile pendant l’incubation (la placer par ex. sur un support fixe ou dans un bain-marie sans circulation d’eau) ; le fond des cupules doit être en contact avec l’eau thermostatée. Si l’eau contient des stabilisateurs pour éviter la contamination, bien veiller à ce que ni la surface supérieure de la plaque ni l’intérieur des cupules n’entrent en contact avec cette eau, au risque d’obtenir des réactions non-spécifiques. 11. En cas d’échantillons fortement réactifs, il peut y avoir absence de coloration au moment de l’arrêt de la réaction, sans que cela ait d’influence sur l’exploitation photométrique. 12.Les sérums de contrôle sont obtenus à partir de sérums humains natifs. Ils peuvent donc devenir trouble, sans que cela ait d’influence sur le résultat du test. 13.Dade Behring a validé l’utilisation de ces réactifs sur plusieurs analyseurs afin d’optimiser les performances du produit et répondre à ses spécifications. Les modifications apportées par l’utilisateur ne sont pas sous la responsabilité de Dade Behring dans la mesure où elles peuvent affecter les performances du système et les résultats des dosages. Il est de la responsabilité de l’utilisateur de valider toutes modifications apportées à ces instructions ou à l’utilisation des réactifs sur les analyseurs autres que ceux mentionnés dans les protocoles d’application Dade Behring ou dans la présente notice d’utilisation. 14.Les résultats de ce test doivent toujours être interprétés en rapport avec les antécédents médicaux du patient, les signes cliniques et autres constatation Caractéristiques du test Sensibilité et spécificité Les résultats des études de sensibilité et de spécificité sont résumés dans les tableaux 2 et 3 en annexe. Pour l’étude de sensibilité, 192 échantillons anti-HBc/IgM-positifs ont été testés. Tous ont été trouvés positifs selon les critères du test Enzygnost* Anti-HBc/IgM. Indépendamment de cela, on ne peut exclure que, dans le cadre d’une large utilisation du test, certains échantillons ne soient pas révélés. Pour l’étude de spécificité, 2559 échantillons anti-HBc/IgM-négatifs ont été testés, et ont donné une spécificité comprise entre 99.60% et 99.91% pour le test initial, et entre 99.91% et 100% pour le retest. Selon par ex. le collectif étudié ou la réalisation du test, d’autres valeurs peuvent être obtenues. Selon les connaissances actuelles, un résultat positif obtenu avec le test anti-HBc/IgM ne permet pas de déduire avec certitude une infection par le virus de l’hépatite B. De même, un résultat négatif ne permet en aucun cas d’exclure avec certitude une infection par le virus de l’hépatite B. Reproductibilité Les résultats de reproductibilité et de répétabilité sont résumés dans le tableau 4 en annexe. Les données doivent être considérées comme des exemples. Elles peuvent en effet diverger selon par ex. la réalisation du test. * Enzygnost est une marque déposée de Dade Behring Marburg GmbH en Allemagne et dans d’autres pays. BEP est une marque déposée de Dade Behring Marburg GmbH aux USA, en Allemagne et dans d’autres pays. Boviserin est une marque déposée de Aventis Behring. Dade Behring Marburg GmbH Emil-von-Behring-Str. 76 D-35041 Marburg www.dadebehring.com OWSE G13 C0541 (909) H/R 22 0197 Tab. 1 Stabilités et conditions de conservation Echantillons/réactifs état Conservation stabilité• échantillon à tester dilué dilué au 1/101 en Tampon échantillons (Anti-HBc/IgM) +2/+8 °C 24 heures Plaque (barrettes restantes) après ouverture +2/+8 °C 6 semaines Conjugué AgHBs/POD après ouverture +2/+8 °C 4 semaines Tampon conjugué (anti-HBc/IgM) après ouverture +2/+8 °C 4 semaines Solution d’emploi du conjugué 1/11 +2/+8 °C 4 semaines +18/+25 °C 1 semaine dans sachet avec capsule dessicative Tampon échantillons (anti-HBc/IgM) après ouverture +2/+8 °C 4 semaines Sérum de contrôle anti-HBc/IgM, positif après ouverture +2/+8 °C 4 semaines Sérum de contrôle anti-HBc/IgM, négativ après ouverture +2/+8 °C 4 semaines Chromogène TMB après ouverture +2/+8 °C date de péremption Tampon/substrat TMB après ouverture +2/+8 °C date de péremption Solution d’emploi du chromogène 1/11 +2/+8 °C +18/+25 °C dans récipient fermé à l’abri de la lumière 5 jours 8 heures Solution de lavage POD (concentrée) non diluée après ouverture +2/+8 °C 1/20 1/20 +2/+8 °C +18/+25 °C date de péremption 1 semaine 1 jour après ouverture +2/+8 °C Solution d’arrêt POD • jamais au-delà de la date de péremption OWSE G13 C0541 (909) H/R 23 date de péremption Tab. 2 Sensibilité Les études de sensibilité ont donné les résultats suivants : Collectif d‘échantillons nombre d‘échantillons Infection HBV aiguë 192 Enzygnost* Anti-HBc/IgM réactif réactif au test initial au retest 192 n.d. Tab. 3 Spécificité Les études de spécificité effectuées dans deux centres indépendants (W, R) ont donné les résultats suivants : Enzygnost* Anti-HBc/IgM Collectif d‘échantillons nombre réactif réactif d‘échantillons au test initial au retest (W) sérums négatifs normaux (W) plasmas négatifs normaux (R) collectif de patients 997 501 1061 2 2 1 0 0 1 Tab. 4 Reproductibilité Échantillon FP 1 FP 2 FP 3 FP 4 Échantillon FP 1 FP 2 FP 3 FP 4 Répétabilité Valeur moyenne de D.O. 0,236 0,182 0,155 0,159 Reproductibilité Valeur moyenne de D.O. 0,158 0,113 0,125 0,104 OWSE G13 C0541 (909) H/R % CV 4,3 6,8 6,3 5,7 % CV 10,9 5,9 5,8 16,9 24 Pour l‘étude de répétabilité, tous les échantillons ont été testés 20 fois (FP 2, n=18). Pour l‘étude de reproductibilité, tous les échantillons ont été testés 3 fois dans 5 séries différentes. Tab. 5 Réalisation du test et programmation Enzygnost* Anti-HBc/IgM Réalisation du test (BEP® II, BEP® III, BEP® 2000) préparation des réactifs BEP® 2000 Programmation du menu pour le BEP® II MENU NO 4 x 10 µl de Sérum de contrôle négatif 2 x 10 µl de Sérum de contrôle positif 10 µl de chaque échantillon non dilué OPERATE 1 NO OPERATE 2 YES Distribution du Conjugué BEP® II 15 min (max 30 min) (+18/+25 °C) BEP® III compléter éventuellement la plaque à mi-plaque avec des barrettes remplies d‘eau 100 µl Conjugué à la dilution d‘emploi 100 1 NO OPERATE 3 YES Lavage et distribution du Chromogène 60 min ± 2 min (37 ± 1 °C) réalisation automatique du test 4 lavages: BEP® II 100 µl de solution d‘emploi du chromogène WASHINGS ASPIRATE SOAKTIME DISP VOL CHANNEL NO PHOT 4 NO 0 100 4 NO OPERATE 4 YES Distribution de la Solution d‘arrêt 30 min ± 2 min (+18/+25 °C à l‘abri de la lumière) 100 µl de solution d‘arrêt après 1 h maximum exploitation à 450 nm (longueur d‘onde de référence: 650 nm) résultat du test OWSE G13 C0541 (909) WASHINGS ASPIRATE SOAKTIME DISP VOL CHANNEL NO PHOT H/R 25 WASHINGS ASPIRATE SOAKTIME DISP VOL CHANNEL NO 0 NO 0 100 5 PHOT YES MEAS WL REF WL BLK COR EVAL MODE GEN CUT NEG CONT MAX NEG MIN NEG FACT NEG MAX POS THRESH CUT OFF 450 650 NO 1 NO 4 0.1 0.07 - Enzygnost* Anti-HBc/IgM Settore d‘impiego Metodo immunoenzimatico per la determinazione qualitativa degli anticorpi IgM contro l’antigene «core» dell’epatite B nel siero o nel plasma. Il test immunoenzimatico viene impiegato sugli analizzatori BEP® II, BEP® III e BEP® 2000 ELISA. Il test è stato realizzato per la determinazione di campioni singoli, e non per pool di campioni. Il prodotto deve essere utilizzato solo per scopi diagnostici in vitro. Significato diagnostico Gli anticorpi IgM contro l’antigene «core» dell’epatite B (anti-HBc/IgM) si manifestano in quasi tutti i casi di una infezione acuta da virus dell’epatite B subito dopo l’inizio della moltiplicazione dei virus e rimangono in circolazione ca 7–17 settimane. Per questa ragione, la determinazione degli anticorpi HBc/IgM nel siero può essere presa come unico parametro per una diagnosi relativamente sicura dell’infezione acuta da virus dell’Epatite B, in quanto l’HBsAg e l’HBeAg possono comparire nel siero anche nei casi di epatiti croniche e quindi richiedono un ulteriore parametro (anti-HBs, anti-HBe o anti-HBc) per la diagnosi differenziale. In alcuni casi di infezione acuta da virus dell’Epatite B gli antigeni HBs e HBe possono scomparire già all’apparire dei sintomi clinici, mentre gli anticorpi relativi non sono ancora rilevabili. La determinazione degli anticorpi totali anti-HBc non sarebbe in questi casi di nessun aiuto, perchè si tratta di anticorpi persistenti che possono rimanere in circolo anche per anni. La determinazione degli anticorpi HBc/IgM può colmare questa lacuna diagnostica 1. Principio del metodo Gli anticorpi HBc/IgM presenti nel campione in esame si legano agli anticorpi anti-IgM umane fissati sulla superficie della micropiastra. L’antigene HBc marcato POD si lega agli anticorpi specifici HBc/IgM. Dopo l’eliminazione del coniugato in eccesso e delle componenti del campione non legate, viene valutata l’attività enzimatica del coniugato legato (reazione di colore blu). La trasformazione enzimatica del cromogeno viene interrotta mediante aggiunta della Soluzione bloccante POD (reazione di colore giallo). L’intensità del colore sviluppato è proporzionale alla concentrazione di anticorpi nel campione. Reagenti Materiali forniti Enzygnost* Anti-HBc/IgM 1 x 96 Enzygnost* Anti-HBc/IgM, piastra test Coniugato HBcAg/POD Tampone per il coniugato (Anti-HBc/IgM) Tampone per campioni (Anti-HBc/IgM) Siero di controllo, positivo (Anti-HBc/IgM) Siero di controllo, negativo (Anti-HBc/IgM) Soluzione di lavaggio POD (concentrata) Tampone/Substrato TMB Cromogeno TMB Soluzione bloccante POD Flacone vuoto per la soluzione d’uso di cromogeno Fogli adesivi Sacchetto in PE per le strip non utilizzate Tabella con i codici a barre Istruzioni per l‘uso 1 pz 3 x 0,6 mL 3 x 6 mL 3 x 40 mL 1 x 0,3 mL 1 x 0,5 mL 1 x 100 mL 1 x 30 mL 1 x 3 mL 1 x 100 mL 1 pz 6 pz 1 pz 1 pz 1 pz ** Questi componenti sono inclusi anche nel Kit Reagenti Supplementari per Enzygnost* TMB (codice OUVP). OWSE G13 C0541 (909) H/R 26 Edizione Febbraio 2004 Composizione Enzygnost* anti-HBc/IgM (piastra test): piastra per microtitolazione sensibilizzata con anticorpi monoclonali contro le IgM umane. Coniugato HBcAg/POD: antigene HBc prodotto con tecniche di ingegneria genetica, coniugato con perossidasi (POD). Conservante: fenolo (max. 1 g/L) Tampone per il coniugato (anti-HBc/IgM): tampone Tris contenente Boviserin® e Tween 20. Conservante: fenolo (max. 1 g/L) Tampone per i campioni (anti-HBc/IgM): tampone Tris contenente glicerolo, Boviserin® e Tween 20. Conservante: fenolo (max. 1 g/L) Siero di controllo anti-HBc/IgM, positivo: siero umano stabilizzato, contenente anticorpi IgM contro l’antigene HBc, diluito in tampone per campioni. Valore nominale di estinzione: ≥ 0,7 Conservanti: fenolo (max. 1 g/L) Siero di controllo anti-HBc/IgM, negativo: siero umano stabilizzato, privo di anticorpi contro l’antigene HBc, diluito in tampone per campioni. Valore nominale di estinzione: ≤ 0,1 Conservanti: fenolo (max. 1 g/L) Soluzione di lavaggio POD (concentrata): soluzione di tampone fosfato contenente Tween. Mezzo di conservazione: fenolo (max. 1g/L) Tampone substrato TMB: perossido di idrogeno (0,1 g/L) in soluzione tampone acetato. Mezzo di conservazione: n-butanolo (max. 1%). Cromogeno TMB: tetrametilbenzidina-cloridrato Soluzione bloccante POD: acido solforico 0,5 N Avvertenze e precauzioni 1. Solo per uso diagnostico in-vitro. 2. Ogni donazione di sangue utilizzata per la produzione dei sieri di controllo è stata esaminata per la ricerca dell‘HBsAg e degli anticorpi anti-HIV1, anti-HIV2 e anti-HCV. Per la produzione del siero di controllo anti-HBc/IgM negativo sono stati impiegati esclusivamente sieri che risultavano negativi. Per la produzione del siero di controllo anti-HBc/IgM positivo sono stati impiegati esclusivamente sieri che risultavano negativi all’anti-HIV1, all’anti-HIV2 e all’anti-HCV. Tuttavia, tutti i derivati da sangue umano devono essere trattati con le necessarie precauzioni rispettando le norme di sicurezza sul rischio biologico, in quanto non è possibile escludere con assoluta certezza il pericolo di agenti patogeni.2 In particolare, per il Siero di controllo-anti HBc/IgM positivo, il procedimento di produzione non può garantire l’inattivazione del virus. 3. Si consiglia l'uso di guanti di protezione durante l'intera esecuzione del test. 4. Per la distruzione del materiale solido infettivo si consiglia il trattamento in autoclave per almeno 1 ora a + 121 °C. Tutti i liquidi aspirati devono essere raccolti in due raccoglitori collegati in serie. I raccoglitori dovrebbero contenere un disinfettante adatto all'inattivazione dei virus patogeni umani. Osservare le concentrazioni ed i tempi di azione indicati dal produttore. Preparazione dei Reagenti Prima dell’inizio del test, portare tutti i reagenti ed i campioni in esame a +18/+25°C. Non togliere la piastra test dal sacchetto di alluminio. Per ogni piastra test diluire 20 mL di liquido di lavaggio POD con 400 mL di acqua distillata o deionizzata. Soluzione d’uso di cromogeno: per ogni piastra test diluire 1 mL di cromogeno TMB con 10 mL di tampone/substrato TMB nel flacone vuoto appositamente fornito (soluzione d’uso di cromogeno), e onservare ben chiuso al riparo dalla luce. Dopo l’uso, lavare accuratamente il flacone con acqua distillata. A causa della dimensione del flacone non è possibile versare il cromogeno TMB direttamente nel tampone/substrato TMB. Prediluire in una cuvetta tutti i campioni in esame, non però i sieri di controllo, 1+100 con il tampone per i campioni (anti-HBc/IgM), (es. 10 µL di campione + 1000 µL di tampone per i campioni (anti-HBc/IgM). OWSE G13 C0541 (909) H/R 27 Soluzione d’uso di coniugato: prelevare la quantità necessaria di Coniugato HBcAg/POD e diluire 1+10 con il tampone-coniugato (anti-HBc/IgM). Per ogni metà piastra test prelevare 0,6 mL di coniugato HBcAg/POD e diluire con una confezione originale (6 mL) di tampone-coniugato (anti-HBc/IgM) (1+10). Conservazione e validità Prima dell'apertura, tutte le componenti della confezione Enzygnost* Anti-HBc/IgM possono essere utilizzate fino alla data di scadenza indicata in etichetta, purché conservate alla temperatura indicata. La conservazione e la validità dei reagenti diluiti per l'uso, dopo l'apertura, sono riportate in appendice nella Tabella 1. Strumentazione necessaria: Per la dispensazione automatica dei reagenti e della soluzione di BEP® II: lavaggio BEP® III: Per l'esecuzione automatica e valutazione del test, dopo la distribuzione dei campioni BEP® 2000: Per l'esecuzione completamente automatica del test e la valutazione dei risultati Pipette: Pipette automatiche da 25, 100 e 1000 µL Sistema di incubazione: bagnomaria coperto (+37 ± 1 °C) o analoghi metodi di incubazione Tutta la strumentazione usata nel test deve essere validata. Campioni Si impiegano come campioni in esame quelli singoli (siero umano o plasma citratato/ eparinizzato/EDTA) ottenuti da tecniche standard di laboratorio. I campioni devono essere conservati a +2/+8 °C per non più di 3 giorni. Se i campioni devono essere conservati per un lungo periodo di tempo, devono essere congelati. Esecuzione del test Esecuzione del test con il BEP® II 1. Distribuzione dei campioni: distribuire 10 µL di Siero di controllo Anti-HBc/IgM, negativo in 4 pozzetti e 10 µL di Siero di controllo Anti-HBc/IgM, positivo in un pozzetto; quindi distribuire in ognuno dei successivi pozzetti 10 µL di campione prediluito e alla fine serie di campione o della piastra, distribuire 10 mL di Siero di controllo Anti-HBc/IgM positivo in un pozzetto. Chiudere con un foglio adesivo. L’operazione di distribuzione deve essere completata entro 15 minuti per ogni piastra. 2. Incubazione dei campioni: incubare la piastra coperta con un foglio adesivo a temperatura ambiente (+18/+25 °C) almeno 15 min (max. 30 min). 3. Distribuzione del coniugato: rimuovere il foglio adesivo senza effettuare prima alcun lavaggio e distribuire in ogni pozzetto 100 µL della soluzione d’uso del coniugato. Ricoprire con un nuovo foglio adesivo e quindi inserire nel sistema di incubazione. 4. Incubazione del coniugato: incubare per 60 ± 2 min, a +37 ± 1 °C; al termine procedere quindi immediatamente con la fase di lavaggio. 5. Lavaggio: rimuovere il foglio adesivo, aspirare tutti i pozzetti e lavare 4 - 5 volte con ca. 0,3 mL di soluzione di lavaggio (ved. nota). 6. Distribuzione del substrato: distribuire in ogni pozzetto 100 µL di soluzione d’uso di cromogeno e ricoprire la piastra con un nuovo foglio adesivo. 7. Incubazione del substrato: incubare la piastra per 30 ± 2 min, a +18/+25 °C al riparo dalla luce. 8. Arresto della reazione: rimuovere il foglio adesivo e aggiungere in ogni pozzetto 100 µL di soluzione bloccante POD, con lo stesso ordine seguito al punto 6. 9. Valutazione: leggere fotometricamente i risultati a 450 nm entro 1 ora. Si consiglia l’uso di un fotometro con due lunghezze d’onda (raggio di misura e raggio di riferimento).Effettuare la misurazione dei valori di estinzione dei campioni di controllo e dei pazienti a 450 nm. La lunghezza d’onda della misura di riferimento dovrebbe essere di 650 nm (evtl. fra 615 e 690 nm). OWSE G13 C0541 (909) H/R 28 Esecuzione del test con il BEP® III Prima di utilizzare il BEP® III, preparare le piastre test ed eseguire le operazioni di dispensazione del campione (paragrafo 1 - Esecuzione del test con il BEP® II). Subito dopo porre le piastre non coperte (senza foglio adesivo) nel BEP® III. Le piastre parzialmente riempite devono essere completate per almeno metà della piastra (6 strip) aggiungendo “strip riempite con acqua”. Il test viene quindi eseguito in modo completamente automatico (vedere Manuale d’uso del BEP® III). Per motivi tecnici, i settaggi dei tempi di incubazione nel software del BEP® III possono differire da quelli del BEP® II (velocità del sistema), ma sono stati validati per i reattivi Enzygnost* su BEP® III. Esecuzione del test usando BEP® 2000 Le fasi di dispensazione del campione e la successiva esecuzione del test sono eseguite in maniera completamente automatica dallo strumento (v. manuale d’uso del BEP® 2000). Validità del test I valori di estinzione dei controlli negativi vengono utilizzati per calcolare il valore medio, quando: -0,010 ≤ Eneg. ≤ 0,1 – 0,010 ≤ Epos. ≥ 0,7 Se uno dei valori di estinzione del siero di controllo anti-HBc/IgM, negativo, non rientra nell’ambito indicato, può non essere preso in considerazione. I valori di estinzione dei controlli positivi devono rientrare entrambi nell’ambito indicato. Se queste condizioni non vengono rispettate, il test deve essere ripetuto. Valutazione del test Sul BEP® 2000 e sul BEP® III il calcolo dei risultati viene eseguito automaticamente. Per maggiori informazione consultare il manuale d'uso. I seguenti capitoli permettono la valutazione dei risultati senza l'ausilio del software. Dai valori di estinzione dei controlli negativi si calcola il valore medio. Per calcolare il valore soglia si somma al valore medio di estinzione dei controlli negativi il valore di estinzione di 0,07. – Eneg. + 0,07 = Valore soglia (cut off) Per valutare con maggior sicurezza i risultati vicini al valore soglia, viene definita la seguente zona limite: Valore soglia ± 10% Secondo i criteri del test i campioni in esame vengono così classificati: Risultato del test: ^ Campioni anti-HBc/IgM negativi 1. Ecampione < cut off - 10% = ^ Campioni anti-HBc/IgM positivi 2. Ecampione > cut off + 10% = ^ Valore soglia 3. cut off -10% ≤ Ecampione ≤ cut off + 10% = I campioni con un risultato dubbio, devono essere ritestati. Se anche dopo ripetizione non è possibile valutare con sicurezza se un campione è positivo o negativo, allora il risultato deve essere classificato come «dubbio». Limitazioni del esecuzione del test 1.Anticoagulanti come l’eparina, EDTA e citrato non interferiscono con il risultato del test. 2.I campioni lipemici, itterici o emolitici non interferiscono con il test. In qualche raro caso, i campioni con elevati livelli di fattore reumatoide accompagnato da elevati livelli di anti-HBc possono dare segnali elevati. 3.I campioni contenenti anticorpi anti-CMV, HAV, HIV, HCV e rosolia, ed i campioni risultati positivi per l’anti-HBs, non interferiscono con il risultato del test. 4.I campioni di pazienti con elevati valori di transaminasi, ed i campioni contenenti autoanticorpi ed ANA non interferiscono con il risultato del test. 5.I campioni contenenti anticorpi anti-EBV ed i campioni di pazienti in emodialisi, possono presentare una reattività elevata. 6.I sieri non completamente coagulati, i campioni contenenti sodio azide o contaminati da microbi non devono essere usati. Eventuali particelle (ad es. coagulo di fibrina) devono essere rimosse prima del test. 7.Per i campioni scongelati assicurare una buona omogeneizzazione del materiale. 8.I reagenti non devono essere interscambiati con altri kit a meno che non siano dello stesso lotto (devono avere la combinazione ammessa dei numeri di lotto a 6 cifre stampati sulla confezione e riportata nell’allegata tabella dei codici a barre). Sono esclusi la Soluzione di lavaggio POD, la Soluzione bloccante POD e la Soluzione d’uso di cromogeno (preparata con il cromogeno TMB ed il Tampone/Substrato TMB appartenenti tutti allo stesso lotto). OWSE G13 C0541 (909) H/R 29 9.Il Tampone/Substrato TMB, la Soluzione d’uso di Cromogeno e la Soluzione Bloccante POD non devono venire in contatto con ioni di metalli pesanti o sostanze ossidanti (non usare pipette con parti metalliche a diretto contatto con il liquido). Non eseguire la reazione con il substrato in presenza di disinfettanti contenenti ipoclorito. Se la Soluzione d’uso di Cromogeno ha sviluppato un colore blu prima della dispensazione nella piastra test, questo indica che la soluzione è contaminata; in tal caso preparare una soluzione fresca in un contenitore pulito. Evitare il contatto delle suddette soluzioni con la cute. 10.Durante il periodo di incubazione la piastra deve essere protetta da vibrazioni (ad es. utilizzare un supporto fisso ed evitare bagnomaria a circolazione d’acqua); i pozzetti devono venire a contatto con l’acqua termostatata. Se vengono utilizzati conservanti per evitare la contaminazione dell’acqua, occorre fare attenzione che la superficie della piastra test ed i pozzetti non vengano a contatto con queste soluzioni, in quanto simili contaminazioni possono produrre reazioni aspecifiche. 11. Campioni altamente reattivi possono causare la formazione di un precipitato entro la soluzione colorata durante la reazione bloccante. Questo non interferisce con la valutazione fotometrica. 12.Il siero di controllo è stato ottenuto da siero umano nativo. Possono manifestarsi intorbidamenti, che però non interferiscono sui risultati del test. 13.Dade Behring ha validato l’uso di questi reagenti su vari analizzatori per ottimizzare le prestazioni e rispettare le specifiche dei prodotti. Le modifiche definite dall’utente non sono supportate da Dade Behring poiché possono influire sulle prestazioni del sistema e sui risultati del test. Pertanto è responsabilità dell’utente validare tutte le modifiche apportate a queste istruzioni, l’uso dei reagenti su analizzatori diversi da quelli inclusi nei fogli di istruzioni o nelle istruzioni d’uso fornite da Dade Behring. 14.I risultati di questo test devono essere sempre interpretati alla luce della anamnesi del paziente, della presentazione clinica e valutando contestualmente l’esito di altri accertamenti. Caratteristiche specifiche del test Sensibilità e specificità I risultati dello studio sulla sensibilità e specificità sono riassunti nelle Tabelle 2 + 3 (v. appendice). Per determinare la sensibilità sono stati analizzati un totale di 192 campioni anti-HBc/IgM, positivi. Tutti i campioni analizzati sono risultati positivi, così come definito dai criteri del test Enzygnost* Anti-HBc/IgM. Tuttavia non si può escludere che qualche campione possa sfuggire alla rilevazione, quando il test è utilizzato su larga scala. Per determinare la specificità sono stati analizzati un totale di 2559 campioni anti-HBc/IgM negativi ed è risultata una specificità di 99,60% - 99,91% (test iniziale) e 99,91% - 100% (ripetizione del test). Le deviazioni da questi risultati possono essere dovute ad una diversa popolazione esaminata, alla procedura del test, ecc. Secondo lo stato attuale delle conoscenze, un risultato positivo del test anti-HBc/IgM non costituisce una prova sicura di un’infezione da HBV, come pure un risultato negativo non esclude con assoluta certezza un’infezione da HBV. Riproducibilità I risultati della riproducibilità intra-serie e inter-serie sono riassunti nella Tabella 4 (nell’appendice). I dati indicati sono risultati tipici. Si possono avere risultati diversi, dovuti a fattori differenti (procedura, ecc.) * Enzygnost è un marchio registrato della Dade Behring Marburg GmbH negli Germania e altri paesi. BEP è un marchio registrato della Dade Behring Marburg GmbH negli Stati Uniti, Germania e altri paesi. Boviserin è un marchio registrato della Aventis Behring. Dade Behring Marburg GmbH Emil-von-Behring-Str. 76 D-35041 Marburg www.dadebehring.com OWSE G13 C0541 (909) H/R 30 0197 Tab. 1 Conservazione e validità Campioni/Reagenti Condizioni Conservazione Stabilità• campione diluito 1+100 diluito con Tampone per campioni (Anti-HBc/IgM) +2/+8 °C 24 ore Piastra test (pozzetti rimanenti) dopo apertura +2/+8 °C 6 settimane Coniugato HBcAg/POD dopo apertura +2/+8 °C 4 settimane Tampone per il coniugato (anti-HBc/IgM) dopo apertura +2/+8 °C 4 settimane Coniugato diluito per l’uso 1+10 +2/+8 °C 4 settimane +18/+25 °C 1 settimana (nel sacchetto con l’essiccante) Tampone per i campioni (anti-HBc/IgM) dopo apertura +2/+8 °C 4 settimane Siero di controllo anti-HBc/IgM, positivo dopo apertura +2/+8 °C 4 settimane Siero di controllo anti-HBc/IgM, negativo dopo apertura +2/+8 °C 4 settimane Cromogeno TMB dopo apertura +2/+8 °C data di scadenza Tampone/Substrato TMB dopo apertura +2/+8 °C data di scadenza Soluzione d’uso di cromogeno 1+10 +2/+8 °C +18/+25 °C (ben chiuso, protetto dalla luce) 5 giorni 8 ore Soluzione di lavaggio POD (concentrata) indiluito dopo apertura +2/+8 °C 1:20 1:20 +2/+8 °C +18/+25 °C data di scadenza 1 settimana 1 giorno dopo apertura +2/+8 °C Soluzione bloccante POD • In nessun caso oltre la data de scadenza. OWSE G13 C0541 (909) H/R 31 data di scadenza Tab. 2 Sensibilità Gli studi sulla sensibilità hanno fornito i seguenti dati : Panello dei campioni Numeri di campioni Infezione HBV acuta 192 Enzygnost* Anti-HBc/IgM Inizialmente Ripetutamente reattivi reattivi 192 n.d. Tab. 3 Specificità Gli studi sulla specificità, condotti da due diversi centri (W, R) hanno fornito i seguenti dati: Enzygnost* Anti-HBc/IgM Pannello dei campioni Numero di campioni Inizialmente Ripetutamente reattivi reattivi (W) siero negativo normale (W) plasma negativo normale (R) pannello dei pazienti 997 501 1061 2 2 1 0 0 1 Tab. 4 Riproducibilità Intra-serie Campione Estinzione media FP 1 0,236 FP 2 0,182 FP 3 0,155 FP 4 0,159 Inter-serie Campione Estinzione media FP 1 0,158 FP 2 0,113 FP 3 0,125 FP 4 0,104 OWSE G13 C0541 (909) % CV 4,3 6,8 6,3 5,7 % CV 10,9 5,9 5,8 16,9 H/R 32 In uno studio sulla riproducibilità intra-serie, i campioni sono stati analizzati in determinazioni ripetute 20 volte (FP 2, n = 18). In uno studio sulla riproducibilità inter-serie, i campioni sono stati analizzati in determinazioni ripetute 3 volte in 5 sedute indipendenti. Tab. 5 Esecuzione e programmazione del test Enzygnost* Anti-HBc/IgM Esecuzione del test (BEP® II, BEP® III, BEP® 2000) Preparazione dei reagenti BEP® 2000 Programmazione del menù per il BEP® II MENU NO 4 x 10 µl Siero di controllo, negativo 2 x 10 µl Siero di controllo, positivo 10 µl per campioni non diluiti OPERATE 1 NO OPERATE 2 YES Dispensazione Coniugato BEP® II 15 min (max 30 min) (+18/+25 °C) 100 µl coniugato diluito, pronto per l‘uso BEP® III Nel caso di piastre riempite parzialmente, aggiungere file di pozzetti con acqua fino a riempire mezza piastra test 100 1 NO OPERATE 3 YES Lavaggio e dispensazione Cromogeno 60 min ± 2 min (37 ± 1 °C) Esecuzione automatica del test 4 lavaggi BEP® II 100 µl Soluzione d‘uso del cromogeno WASHINGS ASPIRATE SOAKTIME DISP VOL CHANNEL NO PHOT 4 NO 0 100 4 NO OPERATE 4 YES Dispensazione Soluzione Bloccante 30 min ± 2 min (+18/+25 °C al riparo della luce) 100 µl Soluzione bloccante al massimo entro 1 ora Lettura a 450 nm (lunghezza d‘onda di riferimento: 650 nm) Risultati OWSE G13 C0541 (909) WASHINGS ASPIRATE SOAKTIME DISP VOL CHANNEL NO PHOT H/R 33 WASHINGS ASPIRATE SOAKTIME DISP VOL CHANNEL NO 0 NO 0 100 5 PHOT YES MEAS WL REF WL BLK COR EVAL MODE GEN CUT NEG CONT MAX NEG MIN NEG FACT NEG MAX POS THRESH CUT OFF 450 650 NO 1 NO 4 0.1 0.07 - Enzygnost* Anti-HBc/IgM Campos de aplicación Prueba inmunoenzimática para la determinación cualitativo de los anticuerpos de la IgM contra el antígeno de la hepatitis B (core) en el suero o en el plasma. La realización del ensayo inmunológico se lleva a cabo con los ELISA Procesadores BEP® II, BEP® III y BEP® 2000. El test fue dessarollado para la investigación de muestras aisladas, no para muestras en pool. El producto debe ser usado únicamente en diagnósticos in vitro. Importancia diagnóstica Los anticuerpos IgM contra el antígeno de la hepatitis B (core) (Anti-HBc/IgM) se forman en casi todos los casos de hepatitis B aguda ya poco tiempo después de comenzar la multiplicación de los virus y permanecen en la circulación durante unas 7 a 17 semanas. Por ese motivo, la determinación de Anti-HBc/IgM puede usarse como parámetro único para un diagnóstico relativamente seguro de una hepatitis B aguda, ya que tanto HBsAg como HBeAg pueden aparecer en el suero también en las hepatitis crónicas y con ello hacen necesaria la investigación de otros parámetros (Anti-HBs, Anti-HBe o Anti-HBc) para establecer el diagnóstico diferencial. En algunos casos de hepatitis B aguda, los antígenos HBs y HBe pueden haber ya desaparecido antes de presentarse los síntomas clínicos, momento en que los anticuerpos correspondientes todavía no pueden dosarse. En estos casos la determinación de los anticuerpos totales Anti-HBc no aclararía la situación, ya que se trata aquí de anticuerpos de larga permanencia que pueden encontrarse en la circulación, como únicos anticuerpos, aún años después de la enfermedad. En cambio, la determinación de Anti-HBc/IgM permite establecer este diagnóstico 1. Principio del método Los anticuerpos HBc/IgM existentes en la muestra a investigar se unen a los anticuerpos AntiIgM humana fijados sobre la superficie de la placa de microtitulación. A los anticuerpos HBc/IgM específicos se va a unir el antígeno HBc marcado con POD. Después de eliminar el exceso de conjugado y los componentes de la muestra no enlazados, se determina la actividad enzimática del conjugado fijado (reacción cromática azul). La transformación enzimática del cromógeno se interrumpe por adición de la solución de detenimiento POD (reacción cromática amarilla). La intensidad del color es proporcional a la concentración de anticuerpo presente en la muestra. Reactivos Contenido del envase comercial Enzygnost* Anti-HBc/IgM 1 x 96 Enzygnost* Anti-HBc/IgM placa de prueba Conjugado HBcAg/POD Tampón para conjugado (Anti-HBc/IgM) Tampón para muestras (Anti-HBc/IgM) Suero control, positivo (Anti-HBc/IgM) Suero control, negativo (Anti-HBc/IgM) Solución de lavado POD (concentrado)** Tampón/Sustrato TMB** Cromógeno TMB** Solución de detenimiento POD** Frasco vacío para la solución de uso cromógeno Láminas adhesivas Bolsa de PE para guardar los elementos no necesarios Tabla Barcode Boletín informativo 1 unidad 3 x 0,6 ml 3 x 6 ml 3 x 40 ml 1 x 0,3 ml 1 x 0,5 ml 1 x 100 ml 1 x 30 ml 1 x 3 ml 1 x 100 ml 1 unidad 6 unidades 1 unidad 1 unidad 1 unidad ** Estos componentes también vienen includíos en el kit de Reactivos adicionales para Enzygnost* TMB (N° de pedido OUVP). OWSE G13 C0541 (909) H/R 34 Edición Febrero 2004 Composición Enzygnost* Anti-HBc/IgM (placa de prueba): Placa de microtitulación recubierta con anticuerpos monoclonales contra la IgM humana. Conjugado HBcAg/POD: Antígeno HBc obtenido por tecnología genética, conjugado con peroxidasa (POD). Agente de conservación: Fenol (máx. 1 g/l) Tampón para conjugado (Anti-HBc/IgM): Tampón Tris con Boviserin® y Tween 20. Agente de conservación: Fenol (máx. 1 g/l) Tampón para muestras (Anti-HBc/IgM): Tampón Tris con glicerina, Boviserin® y Tween 20. Agente de conservación: Fenol (máx. 1 g/l) Suero de control Anti-HBc/IgM, positivo: Suero humano estabilizado, con anticuerpos IgM contra el antígeno HBc, diluido con tampón para muestras; valor teórico de extinción: ≥ 0,7. Agentes de conservación: Fenol (máx. 1 g/l) Suero de control Anti-HBc/IgM, negativo: Suero humano estabilizado, sin anticuerpos contra el antígeno HBc, diluido con tampón para muestras; valor teórico de extinción: ≤ 0,1. Agentes de conservación: Fenol (máx. 1 g/l) Solución de lavado POD (concentrado): Solución de tampón de fosfato con adición de Tween. Agente de conservación: Fenol (máx. 1 g/l) Tampón/sustrato TMB: Peróxido de hidrógeno (aprox. 0,1 g/l) en solución tampón de acetato. Agente de conservación: n-butanol (máx. 1%) Cromógeno TMB: Diclorhidrato de tetrametilbenzidina Solución de detenimiento POD: Acido sulfúrico 0,5 N Advertencias y medidas de seguridad 1. Sólo para ser utilizado en diagnósticos in-vitro. 2. Cada donación individual de sangre destinada a la preparación de sueros de control ha sido investigada para detectar la presencia del HBsAg, anti-HIV1, anti-HIV2 y anti-HCV. Para la elaboración del suero control anti-HBc/IgM, negativo se usaron solamente donaciónes con resultado negativo. Para la elaboración del suero control anti-HBc/IgM, positivos se usaron solamente donaciones con resultados negativos para anti-HIV1, anti-HIV2 y anti-HCV. Independientemente de esto, todos los materiales obtenidos a partir de sangre humana deben ser manipulados con las precauciones necesarias, siguiendo las medidas de seguridad recomendadas en caso de riesgo biológico, puesto que nunca se puede excluir la existencia de agentes patógenos2. Esto también rige especialmente para el Suero de control Anti-HBc/IgM, positivo, pues mediante el procedimiento de elaboración no se puede garantizar una inactivación del virus. 3. Se aconseja utilizar guantes de seguridad durante el desarrollo del test. 4. Para la eliminación del material infeccioso sólido se recomienda colocarlo en el autoclave por lo menos 1 hora a + 121 °C. Las soluciones aspiradas se deben recoger en dos recipientes conectados uno con el otro. Los recipientes deben contener un medio de desinfección apropiado para inactivar virus patógenos humanos. Deben observarse la concentración y el tiempo de acción dados por el fabricante. Preparación de reactivos Llevar todos los reactivos y las muestras a una temperatura entre +18 y +25 °C antes de iniciar la prueba, sin sacar del recipiente la placa de prueba. Para cada placa de prueba diluir 20 ml de solución de lavado POD con agua destilada o desionizada hasta obtener 400 ml. Solución de uso del cromógeno: Para cada placa de prueba diluir 1 ml de cromógeno TMB con 10 ml de tampón/sustrato TMB en el frasco plástico adjunto (solución de uso del cromógeno) y conservar el frasco cerrado al abrigo de la luz. Después de su uso, lavar cuidadosamente el frasco con agua destilada. Para evitar la repleción no está permitido verter el contenido total del frasco de cromógeno TMB en el frasco de tampón/sustrato TMB. Prediluir todas las muestras a investigar, pero no los sueros de control, en un tubo de ensayo en proporción 1+100 con tampón para muestras (Anti-HBc/IgM) (por ej. 10 µl de muestra + 1000 µl de tampón para muestras (Anti-HBc/IgM)). Solución de uso del conjugado: Extraer la cantidad necesaria del conjugado HBcAg/POD y diluirlo 1+10 con el tampón para conjugado (Anti-HBc/IgM). Para media placa de prueba pipetear 0,6 ml de conjugado HBcAg/POD en el frasco original (6 ml) de tampón para conjugado (Anti-HBc/IgM) (1+10). OWSE G13 C0541 (909) H/R 35 Estabilidad y almacenaje Todos los componentes del envase combinado Enzygnost* Anti-HBc/IgM aún cerrados, conservados a la temperatura indicada, son utilizables hasta las fechas de vencimiento dadas en las etiquetas. La estabilidad y las condiciones de almacenamiento de los envases ya abiertos o de los reactivos ya diluidos listos para el uso se pueden tomar de la Tabla 1 del apéndice. Equipo necesario: BEP® II: Para el desarollo automático de la dosificación de reactivos y de las etapas de lavado BEP® III: Para la realización completamente automática del test después de la distribución de las muestras, así como para la evaluación Para la realización completamente automática del test BEP® 2000: Pipetas: Pipetas a émbolo 25, 100 y 1000 µl Incubadora: Baño de agua cubierto (+37 ± 1 °C) u otros métodos de incubación similares Todos los instrumentos utilizados para el desarrollo del test deben estar validados. Material a investigar Para la investigación se pueden utilizar muestras aisladas (sueros humanos o plasma con EDTA/heparina/citrato), las cuales hayan sido tomadas según las técnicas estándar de laboratorio. Las muestras se pueden almacenar máximo 3 días entre +2 y +8 °C. Para tiempos más largos de almacenamiento las muestras se deben congelar. Procedimiento Procedimiento con el BEP® II 1. Dosificación de las muestras: Colocar en 4 pocillos 10 µl de suero de control Anti-HBc/IgM, negativo, por c/u; luego en el siguiente pocillo 10 µl de suero de control Anti-HBc/IgM, positivo. En los siguientes pocillos dosificar 10 µl de cada una de las muestras prediluidas y al final de la serie o de la placa de prueba colocar otra vez 10 µl de suero de control Anti-HBc/ IgM, positivo. Cubrir con lámina adhesiva. El proceso de pipeteo no debe durar más de 15 minutos por placa de prueba. 2. Incubación de las muestras: Incubar no menos de 15 min (máx. 30 min) a la temperatura ambiente (entre +18 y +25 °C). 3. Distribución del conjugado: Retirar la lámina adhesiva y, sin lavar previamente, pipetear 100 µl de solución de uso del conjugado en cada pocillo, cubrir con una nueva lámina adhesiva y a continuación colocar en el incubador. 4. Incubación del conjugado: Incubar durante 60 ± 2 min a +37 ± 1 °C y a continuación lavar de inmediato. 5. Lavado: Retirar la lámina adhesiva, aspirar el contenido de todos los pocillos y lavar cada uno de ellos con aprox. 0,3 ml de solución de lavado 4 ó 5 veces (ver Advertencia). 6. Distribución del sustrato: Colocar en cada pocillo 100 µl de la solución de uso del cromógeno y cubrir la placa con una nueva lámina adhesiva. 7. Incubación del sustrato: Incubar 30 ± 2 min entre +18 y +25 °C al abrigo de la luz. 8. Reacción de parada: Retirar la lámina adhesiva. Agregar a cada pocillo 100 µl de solución de parada POD manteniendo el mismo ritmo que en el punto 6. 9. Medición: Valorar fotométricamente a 450 nm dentro del término de una hora. Es recomendable utilizar un fotómetro con dos longitudes de onda (rayo de medida y rayo de referencia). La medida de la extinción de las muestras de control y de las muestras de pacientes debe realizarse con una longitud de onda de 450 nm; como longitud de onda de la medida de referencia se recomienda 650 nm (o entre 615 y 690). OWSE G13 C0541 (909) H/R 36 Procedimiento con el BEP® III Para el desarrollo del test en el BEP® III, las placas de prueba se deben preparar hasta la distribución de las muestras (punto 1 del "Procedimiento en el BEP® II"). Directamente después de esto, colocar las placas de prueba abiertas, esto es, sin lámina adhesiva en el BEP® III. Aquí es importante observar que las placas de prueba que no estén llenas se deben completar con "elementos con agua" hasta por lo menos la mitad de la placa de prueba (6 elementos). Todas las etapas subsiguientes van a ser realizadas de forma completamente automática por el aparato (ver manual de funcionamiento del BEP® III). Los tiempos de incubación ajustados en el software del BEP® III pueden desviarse de los del procedimiento en el BEP® II debido a condiciones técnicas básicas (ritmo del aparato), están sin embargo validados en la combinación BEP® III/Enzygnost*. Procedimiento con el BEP® 2000 La dosificación de las muestras y la subsiguiente realización del test se efectúan de forma completamente automática en el aparato (ver manual de funcionamiento del BEP® 2000) Valoración del test Los valores de las extinciones de los sueros de control se pueden utilizar para calcular el valor medio cuando: -0,010 ≤ Eneg. ≤ 0,1 –0,010 ≤ Epos. ≥ 0,7 Si uno de los valores de extinción del suero de control Anti-HBc/IgM, negativo, se halla fuera del límite especificado, se puede no tenerlo en cuenta para el cálculo. Los valores de extinción de los controles positivos, en cambio, deben estar ambos dentro del límite especificado. Si no se cumplen estos requisitos, hay que repetir la prueba. Valoración de la prueba Las valoraciones se efectúan automáticamente con el BEP® 2000 y el BEP® III. Para esto consultar, por favor, los manuales de funcionamiento. Los siguientes capítulos son para tener en cuenta en caso de evaluaciones sin la ayuda del software. Obtener el valor medio de las extinciones de los controles negativos. Para calcular el valor límite, sumar 0,07 al valor medio de extinción de los controles negativos: – Eneg. + 0,07 = valor límite (cut off) Para determinar mejor los resultados próximos al valor límite, se ha establecido una zona límite: Valor límite ± 10% Según los criterios de la prueba, las muestras se clasifican de la siguiente manera: Resultado de la prueba: ^ Anticuerpo HBc/IgM negativo 1. Emuestra < cut off - 10% = ^ Anticuerpo HBc/IgM positivo 2. Emuestra > cut off + 10% = ^ valor límite 3. cut off - 10% ≤ Emuestra ≤ cut off + 10% = Las muestras cuyos resultados son de valor límite deben ser analizadas nuevamente. Si después de ello tampoco se puede catalogar la muestra como positiva o negativa, el resultado de la prueba se expresa como de «valor límite». Limitaciones del Procedimiento 1.Los anticoagulantes como heparina, EDTA y citrato no influyen sobre los resultados del test. 2.Las muestras lipémicas, ictéricas o hemolíticas no alteran el desarrollo del test. En algunos casos aislados, muestras que presentan un factor reumatoideo alto junto con un contenido alto de anti-HBc pueden producir una señal elevada. 3.Las muestras con anticuerpos contra CMV, HAV, HIV, HCV, Virus de la rubéola, así como, las muestras con Anti-HBs positivo, no influyen en los resultados del test. 4.En muestras de pacientes con un valor elevado de transaminasas, así como, con autoanticuerpos o en muestras conteniendo ANA, no se observo ninguna influencia sobre los resultados del test. 5.Muestras con anticuerpos contra EBV, así como muestras de pacientes en hemodiálisis, pueden mostrar un aumento en la reactividad. 6.Los sueros que no estén completamente coagulados, el material que contenga azida sódica y las muestras a investigar contaminadas microbiológicamente no deben ser utilizadas. Las partículas existentes (por ej., coagulo de fibrina) deben ser retiradas antes de empezar con el test. OWSE G13 C0541 (909) H/R 37 7. En las muestras descongeladas se debe observar que haya una buena homogenización del material. 8.Los reactivos (con excepción de la solución de lavado POD, la solución de detenimiento POD y la solución de uso del cromógeno elaborada a partir de los reactivos dependientes del lote, cromógeno TMB y Tampón/sustrato TMB) sólo se pueden utilizar juntos si provienen del mismo lote, esto es, con el mismo número de 6 cifras (Nr. de Lote) que está impreso en el envase o que se puede tomar de la Tabla Barcode incluida. 9.El tampón substrato TMB, la solución de uso del cromógeno y la solución de detenimiento POD no deben entrar en contacto con iones de metales pesados ni con sustancias oxidantes (no utilizar pipetas con partes metálicas que entren en contacto con el líquido). No efectuar la reacción del sustrato en la proximidad de sustancias desinfectantes que contengan hipoclorito. Una coloración espontánea azul de la solución de uso del cromógeno antes de colocarla en la placa de prueba indica una contaminación; en este caso, se deberá preparar una solución fresca en un recipiente limpio. Evite el contacto cutáneo con las soluciones arriba mencionadas. 10.Durante la incubación debe mantenerse la placa de ensayo quieta (p. ej. sobre un flotador fijo o en un baño de agua no circulante); los pocillos permanecen de esta manera en contacto con el agua. En el caso de usar medios de conservación en el agua, para evitar su contaminación, debe observarse cuidadosamente que ni la superficie de la placa de prueba ni los pocillos entren en contacto con estas soluciones, ya que una contaminación de este tipo puede ocasionar reacciones inespecíficas. 11. Para muestras con reactividad alta puede, durante la reacción de detenimiento, precipitarse el colorante. Esto no afecta el resultado de la valoración fotométrica. 12.Los sueros de control son fabricados a partir de sueros humanos nativos. Por esta razón puede aparecer turbidez, la cual no influye sobre los resultados del test. 13.Dade Behring ha validado el uso de los reactivos en varios analizadores para optimizar el rendimiento del producto y cumplir con las especificaciones del mismo. Las modificaciones definidas por el usuario no están garantizadas por Dade Behring dado que pueden afectar al rendimiento del sistema y a los resultados del ensayo. Es responsabilidad del usuario validar las modificaciones realizadas a estas instrucciones o el uso de los reactivos en analizadores distintos a los incluidos en las hojas de aplicaciones de Dade Behring o en estas instrucciones de uso. 14.Los resultados de esta prueba deberán interpretarse siempre de acuerdo con la historia clínica del paciente, la sintomatologia clínica y otras observaciones. Características del test Sensibilidad y especificidad Los resultados de los ensayos para la sensibilidad y la especificidad están resumidos en las Tablas 2 y 3 (en el anexo). Para determinar la sensibilidad se estudiaron 192 muestras con anti-HBc/IgM positivo. Todas las muestras estudiadas fueron encontradas positivas según los criterios del Enzygnost* AntiHBc/IgM. Independiente de esto, no se puede excluir que al utilizar el test en un rango mucho más amplio, algunas muestras aisladas no puedan ser reconocidas. Para la determinación de la especificidad se estudiaron 2559 muestras con anti-HBc/IgM negativo y se encontró una especificidad del 99,60% al 99,91% (ensayo inicial) y del 99,91% al 100% (repetición del ensayo). Dependiendo, entre otros, de la colectividad estudiada y del desarrollo del test, es posible que aparezcan valores discrepantes. De acuerdo con el estado actual de los conocimientos de un resultado positivo para el ensayo de anti-HBc/IgM no se puede deducir con seguridad una infección con HBV, así como tampoco, un resultado negativo puede excluir definitivamente una infección. Reproducibilidad Los resultados de los ensayos de reproducibilidad intra/inter-assay están resumidos en la Tabla 4 (en el anexo). En este caso se trata de un datos obtenidos de un ejemplo. Debido a la diferencias, entre otras, en el desarrollo del test es posible que aparezcan valores discrepantes. * Enzygnost es una marca registrada de Dade Behring Marburg GmbH en Alemania y en otros países. BEP es una marca registrada de Dade Behring Marburg GmbH en USA, Alemania y en otros países. Boviserin es una marca registrada de Aventis Behring. Dade Behring Marburg GmbH Emil-von-Behring-Str. 76 D-35041 Marburg www.dadebehring.com OWSE G13 C0541 (909) H/R 38 0197 Tabla 1 Estabilidad y almacenaje Material/reactivo Estado Almacenaje Estabilidad• Muestra diluida 1+100 diluido entre +2 y +8 °C con Tampón para muestras (Anti-HBc/IgM) 24 horas Placa de prueba (elementos restantes) abierto 6 semanas Conjugado HBcAg/POD abierto entre +2 y +8 °C 4 semanas Tampón para conjugado (Anti-HBc/IgM) abierto entre +2 y +8 °C 4 semanas Solución de uso del conjugado 1+10 entre +2 y +8 °C 4 semanas entre +18 y +25 °C 1 semana entre +2 y +8 °C 4 semanas entre +2 y +8 °C 4 semanas entre +2 y +8 °C 4 semanas entre +2 y +8 °C en envase con cápsulas deshidratantes Tampón para muestras (Anti-HBc/IgM) abierto Suero de control Anti-HBc/IgM, positivo abierto Suero de control Anti-HBc/IgM, negativo Cromógeno TMB abierto entre +2 y +8 °C Fecha de caducidad Tampón/sustrato TMB abierto +2 bis +8 °C Fecha de caducidad Solución de uso del cromógeno 1+10 entre +2 y +8 °C entre +18 y +25 °C en recipiente cerrado, al abrigo de la luz 5 días 8 horas Solución de lavado POD (concentrado) sin diluir abierto entre +2 y +8 °C 1:20 1:20 entre +2 y +8 °C entre 18 y + 25 °C Fecha de caducidad 1 semana 1 día abierto entre +2 y +8 °C Solución de detenimiento POD • En ningún caso más allá de la fecha de caducidad OWSE G13 C0541 (909) H/R 39 Fecha de caducidad Tab. 2 Sensibilidad En los estudios de la sensibilidad se encontraron los siguientes datos: Enzygnost* Anti-HBc/IgM Colectividad de muestras Número de Reactividad Reactividad muestras inicial repetida Infección HBV aguda 192 192 n.d. Tab. 3 Especificidad En los estudios de la sensibilidad se encontraron en dos centros independientes (W, R) los siguientes datos: Enzygnost* Anti-HBc/IgM Colectividad de muestras Número de Reactividad Reactividad muestras inicial repetida (W) Sueros negativos normales (W) Plasmas normales negativos (R) Colectividad de pacientes 997 501 1061 2 2 1 0 0 1 Tab. 4 Reproducibilidad Muestra FP 1 FP 2 FP 3 FP 4 Muestra FP 1 FP 2 FP 3 FP 4 Intra assay Promedio de extinción 0,236 0,182 0,155 0,159 Inter assay Promedio de extinción 0,158 0,113 0,125 0,104 OWSE G13 C0541 (909) % CV 4,3 6,8 6,3 5,7 % CV 10,9 5,9 5,8 16,9 H/R 40 En los estudios de reproducibilidad intra assay las muestras fueron determinadas 20 veces c/u (FP 2, n = 18). En los estudios de reproducibilidad inter assay las muestras fueron determinadas 3 veces c/u en 5 carreras diferentes. Tab. 5 Realización de la prueba y programación Enzygnost* Anti-HBc/IgM Programación Procedimiento (BEP® II, BEP® III, BEP® 2000) Preparación de los reactivos para el BEP® 2000 BEP® II MENU NO 4 x 10 µl de suero control, negativo 2 x 10 µl de suero control, positivo 10 µl de muestra no diluida OPERATE 1 NO OPERATE 2 YES Dosificación del conjugado ® ® BEP II BEP III 15 min (max 30 min) (entre +18 y +25 °C) fraccionadas a medias placas con «elementos con agua» 100 µl de conjugado diluido listo para el uso 100 1 NO OPERATE 3 YES Lavado y dosificación del cromógeno 60 min ± 2 min (37 ± 1 °C) Procesamiento automático 4 lavar: BEP® II WASHINGS ASPIRATE SOAKTIME DISP VOL CHANNEL NO PHOT 4 NO 0 100 4 NO OPERATE 4 YES Dosificación solución de detenimiento 100 µl de solución de uso del cromógeno 30 min ± 2 min (entre +18 y +25 °C protegido de la luz) 100 µl de sol. de detenimiento máximo 1 h después Valoración a 450 nm (longitud de onda de referencia: 650 nm) Resultado de la prueba OWSE G13 C0541 (909) WASHINGS ASPIRATE SOAKTIME DISP VOL CHANNEL NO PHOT H/R 41 WASHINGS ASPIRATE SOAKTIME DISP VOL CHANNEL NO 0 NO 0 100 5 PHOT YES MEAS WL REF WL BLK COR EVAL MODE GEN CUT NEG CONT MAX NEG MIN NEG FACT NEG MAX POS THRESH CUT OFF 450 650 NO 1 NO 4 0.1 0.07 - Enzygnost* Anti-HBc/IgM Campo de aplicação Teste imunoenzimático para determinação qualitativa de anticorpos IgM contra o antígeno “core” da hepatite B no soro e no plasma. O processamento do teste imunoenzimático efectuase com os processadores ELISA BEP® II, BEP® III e BEP® 2000. O teste foi desenvolvido para o exame de amostras singulares, não de amostras em pool. O produto só pode ser utilizado para fins de diagnóstico in vitro. Significado diagnóstico Anticorpos IgM contra o antígeno “core” da hepatite B (anti-HBc/IgM) formam-se em quase todos os casos de infecção aguda de hepatite B, já pouco depois do início da multiplicação do vírus, e permanecem aprox. 7 a 17 semanas na circulação. Por este motivo, a detecção de anti-HBc/IgM é o único parâmetro ao nosso alcance para um diagnóstico relativamente seguro de uma infecção aguda de hepatite B, uma vez que o HbsAg e o HbeAg também podem ocorrer no soro em hepatites crónicas, tornando-se pois necessário lançar mão de outros parâmetros para um diagnóstico diferencial (anti-HBs, anti-HBe ou antiHBc). Em alguns casos de infecção aguda de hepatite B pode ocorrer que os antígenos Hbs e Hbe, ao manifestarem-se os sintomas clínicos, já tenham desaparecido, e os anticorpos correspondentes não sejam ainda mensuráveis. Uma determinação do anti-HBc total nada esclareceria neste caso, pois os anticorpos em questão são anticorpos de longa vida, talvez os únicos que podem ainda circular durante anos, mesmo, depois da doença 1. Princípio do método Os anticorpos contra a HBc/IgM existentes na amostra a examinar, associam-se aos anticorpos contra a IgM anti-humana fixados na superfície da placa de microtitração. Aos anticorpos específicos HBc/IgM associa-se o HBc-Antígeno marcado com POD. Depois do excedente do conjugado e dos componentes não associados terem sido removidos, a reacção enzimática do conjugado combinado é determinada (reacção cromática azul). A transformação enzimática do cromógeno é interrompida através da adição de solução de bloqueio POD (reacção cromática amarela). A intensidade da cor é proporcional à concentração de anticorpos existentes na amostra. Reagentes Conteúdo da embalagem Enzygnost* Anti-HBc/IgM 1 x 96 Enzygnost* Anti-HBc/IgM Placa de ensaio Conjugado HBcAg/POD Tampão de conjugado (Anti-HBc/IgM) Tampão para amostras (Anti-HBc/IgM) Soro de controlo, positivo (Anti-HBc/IgM) Soro de controlo, negativo (Anti-HBc/IgM) Solução de lavagem POD (concentrado)** Tampão/substrato TMB** Cromógeno TMB** Solução de paragem POD** Frasco vazio para a solução de uso do cromógeno Folhas adesivas Bolsa de PE, para guardar as barras não utilizadas Tabela de código de barras Folheto da embalagem 1 unidade 3 x 0,6 ml 3 x 6 ml 3 x 40 ml 1 x 0,3 ml 1 x 0,5 ml 1 x 100 ml 1 x 30 ml 1 x 3 ml 1 x 100 ml 1 unidade 6 unidades 1 unidade 1 unidade 1 unidade ** Estes componentes também são uma parte integrante da embalagem dos reagentes acidionais para Enzygnost* TMB (ref. OUVP). OWSE G13 C0541 (909) H/R 42 Edição Fevereiro 2004 Composição Enzygnost* Anti-HBc/IgM (Placa de ensaio): placa de microtitulação recoberta com anticorpos monoclonais contra IgM humana. Conjugado HBcAg/POD: antígeno Hbc, obtido por tecnologia genética, conjugado com peroxidase (POD). Conservante: fenol (máx. 1 g/l) Tampão para conjugado (anti-HBc/IgM): Tampão Tris com Boviserin® e Tween 20. Conservante: fenol (máx. 1 g/l) Tampão para amostras (anti-HBc/IgM): Tampão Tris com glicerina, Boviserin® e Tween 20. Conservante: fenol (máx. 1 g/l) Soro de controlo anti-HBc/IgM, positivo: soro humano, estabilizado, com anticorpos IgM contra o antígeno HBc, diluído em tampão para amostras; valor indicativo de extinção: ≥ 0,7. Conservante: fenol (máx. 1 g/l) Soro de controlo anti-HBc/IgM, negativo: soro humano, estabilizado, sem anticorpos contra o antígeno HBc, diluído em tampão para amostras; valor indicativo de extinção: ≤ 0,1 Conservante: fenol (máx. 1 g/l) Solução de lavagem POD (concentrado): solução tampão de fosfato com teor de Tween. Conservante: fenol (máx. 1 g/l) Tampão/substrato TMB: peróxido de hidrogénio (aprox. 0,1 g/l) em tampão de acetato. Conservante: n-butanol (aprox. 1%) Cromógeno TMB: diidrocloreto de tetrametilbenzidina Solução de paragem POD: ácido sulfúrico 0,5 N Advertências e medidas de precaução 1. Só para uso diagnóstico in-vitro. 2. Cada dádiva individual de sangue destinada à preparação de soros de controlo foi previamente examinada com vista à detecção de HBsAg, Anti-HIV1, Anti-HIV2 e Anti-HCV. Na elaboração do Soro de controlo anti-HBc/IgM, negativo, só são utilizadas dádivas com resultado negativo e na de Soro de controlo anti-HBc/IgM, positivo, só dádivas com resultados anti-HIV1, anti-HIV2 e anti-HCV negativos. No entanto, todos os materiais obtidos de sangue humano devem ser manuseados com as precauções devidas, seguindo as medidas de segurança recomendadas em caso de risco biológico 2. O aviso vale sobretudo para o Soro de controlo anti-HBc/IgM, positivo, porque, em virtude do processo de elaboração, não se pode garantir uma inactivação do vírus. 3. Recomenda-se utilizar luvas para análise durante toda a realização do teste. 4. Para desinfecção de materiais sólidos, convém colocá-los na autoclave durante pelo menos 1 hora a uma temperatura de, pelo menos, +121 °C. Todas as soluções aspiradas devem ser recolhidas em dois receptáculos ligados em série, que devem conter um desinfectante apropriado para inactivação de vírus patogénicos humanos. Devem observar-se a concentração e o tempo de acção indicados pelo fabricante. Preparação dos reagentes Levar previamente todos os reagentes e amostras à temperatura de +18 a +25 °C, mas sem tirar a placa de ensaio do seu recipiente. Para cada placa de ensaio, diluir 20 ml da solução de lavagem POD com água destilada ou desionizada até obter 400 ml. Solução de uso do cromógeno: diluir, por placa, 1 ml de cromógeno TMB com 10 ml de tampão/substrato TMB no frasco de plástico vazio adjunto à embalagem e conservar este fechado e ao abrigo da luz. Lavar bem o frasco com água destilada depois do uso. Dada a capacidade dos frascos, não vazar todo o cromógeno TMB para o frasco de tampão/ substrato. Pré-diluir num tubo todas as amostras a examinar, não porém os soros de controlo, a 1+100 com tampão para amostras (anti-HBc/IgM): por ex. 10 µl de amostra + 1000 µl de tampão para amostra (anti-HBc/IgM). OWSE G13 C0541 (909) H/R 43 Solução de uso do conjugado: retirar ao Conjugado HbcAg/POD a quantidade necessária e diluir 1+10 com Tampão para conjugado (anti-HBc/IgM). Adicionar com a pipeta, para meia placa, 0,6 ml de Conjugado HbcAg/POD a um frasco original (6 ml) de Tampão para conjugado (anti-HBc/IgM) (1+10). Estabilidade e condições de conservação Antes de abertos, e enquanto conservados à temperatura de armazenagem indicada, todos os componentes da embalagem combinada Enzygnost* Anti-HBc/IgM mantêm-se utilizáveis até ao termo do prazo de validade indicado nos rótulos. A estabilidade e condições de conservação dos reagentes abertos ou diluídos para uso podem depreender-se da tabela 1 em anexo. Aparelhos necessários: para a execução automática da dosagem dos reagentes e das fases BEP® II: de lavagem BEP® III: processamento automático do ensaio e interpretação após dosagem das amostras BEP® 2000: para o processamento automático e avaliação do teste Pipetas: pipetas com êmbolo 25, 100 e 1000 µl Incubador: banho-maria tapado (+37 ± 1 °C) ou outros métodos de incubação comparáveis Todos os aparelhos utilizados no ensaio têm de estar validados. Material a investigar Para a análise podem ser utilizadas amostras individuais (soros humanos e plasmas EDTA/ Heparina/Citrato), colhidos de acordo com as técnicas do laboratório. As amostras poderão ser conservadas durante de 3 dias, no máximo, entre +2 - +8 °C. Se se pretender conservá-las durante um período de tempo superior, deverão ser congeladas. Execução do teste Execução do teste com o BEP® II 1. Dosagem das amostras: Colocar 10 µl de soro de controlo anti-HBc/IgM negativo em cada uma das 4 cavidades, numa cavidade 10 µl de soro de controlo anti-HBc/IgM positivo, em cada uma das cavidades seguintes 10 µl da amostra não diluída e, no final da série ou placa de teste, dosear novamente 10 µl de soro de controlo anti-HBc/IgM positivo e tapar com a folha. As operações de pipetagem por cada placa de teste, têm de ser executadas num período de tempo de 15 minutos. 2. Incubação das amostras: pelo menos 15 min (máx. 30 min) à temperatura ambiente (+18 a +25 °C). 3. Distribuição do conjugado: retirar a folha sem lavar antes, adicionar 100 µl de solução de uso do conjugado por determinação, cobrir com nova folha e colocar na incubadora. 4. Incubação do conjugado: 60 min ± 2 min a +37 °C ± 1 °C. Passar imediatamente à lavagem. 5. Lavagem: retirar a folha, aspirar todos os poços e lavar 4 ou 5 vezes (v. Advertência) com aprox. 0,3 ml de cada vez. 6. Distribuição do substrato: distribuir 100 µl de solução de uso do cromógeno em cada poço, cobrir a placa com nova folha adesiva. 7. Incubação do substrato: deixar incubar durante 30 ± 2 min ao abrigo da luz entre +18 e +25 °C. 8. Reacção de paragem: retirar a folha adesiva. Acrescentar a cada poço 100 µl de solução de interrupção POD, mantendo o mesmo ritmo que em 6. 9. Leitura: fazer uma medição fotométrica a 450 nm dentro de 1 hora. É aconselhável empregar um fotómetro com dois comprimentos de onda (um de medição e outro de referência). Efectuar a medição das extinções (absorvências) das amostras de controlo e dos pacientes a 450 nm; como comprimento de onda de referência aconselha-se 650 nm (eventualmente entre 615 e 690 nm). OWSE G13 C0541 (909) H/R 44 Execução do teste com BEP® III No caso do processamento ser feito com BEP® III é necessário preparar as placas de ensaio incluindo a dosagem das amostras (ponto 1 da «execução do teste com BEP® II»). Imediatamente a seguir, as placas de ensaio são colocadas no BEP® III abertas, ou seja, sem película colada. Ao mesmo tempo, é necessário prestar atenção a que as placas de ensaio parcialmente providas de «barras de água» sejam acrescentadas até ficarem, no mínimo, pelo meio ( 6 barras de água). O processamento subsequente do teste realiza-se automaticamente (vide instruções de serviço do BEP® III). Devido às condições técnicas básicas (ciclo dos aparelhos), os tempos de incubação ajustados no software do BEP® III podem divergir dos tempos do processamento com o BEP® II, mas foram validados na combinação BEP® III/Enzygnost*. Execução do teste com BEP® 2000 A dosagem das amostras e subsequente processamento do teste efectua-se de forma completamente automática no aparelho (vide instruções de serviço do BEP® 2000). Validação do teste Os valores de extinção dos soros de controlo serão utilizados para cálculo dos valores médios, se: -0,010 ≤ Eneg. ≤ 0,1 –0,010 ≤ Epos. ≥ 0,7 Dos 4 valores de extinção do soro de controlo anti-HBc/IgM, negativo, pode mostrar-se um fora da especificação e ser negligenciado. Os valores de extinção do controlo positivo têm de corresponder ambos às especificações. Não se cumprindo estas condições, há que repetir o teste. Avaliação As avaliações efectuam-se automaticamente com o BEP® 2000 e BEP® III. Para o efeito, consultar as instruções de serviço. Deverão observar-se os capítulos seguintes no caso da avaliação ser efectuada sem a assistência de Software. Tirar a média dos valores de extinção dos controlos negativos. Para calcular o valor-limite, adicionar 0,07 ao valor médio de extinção dos controlos negativos: – Eneg. + 0,07 = valor-limite (cut off) Para conferir maior segurança a resultados próximos do valor-limite, foi definida uma zona-limite: valor-limite ± 10% De acordo com os critérios do teste, as amostras serão classificadas do seguinte modo: Resultado do teste: ^ anticorpos HBc/IgM-negativo 1. Eamostra < cut off -10% = ^ anticorpos HBc//IgM-positivo 2. Eamostra > cut off + 10% = ^ zona-limite (duvidoso) 3. cut off - 10% ≤ Eamostra ≤ cut off + 10% = Amostras com resultados situados na zona-limite (duvidosos) devem ser novamente testadas. Se também após repetição do teste não for ainda possível classificar uma amostra como positiva ou negativa, o resultado será: “duvidoso”. Limitações e fontes de erro 1.Os anticoagulantes como a heparina, EDTA e citrato não influenciam o resultado do teste. 2.As amostras lipémicas, ictéricas ou hemolíticas não afectam o teste. Esporadicamente, em casos individuais, as amostras com elevado factor reumático e, simultaneamente, elevado teor de anti-HBc, podem provocar um aumento dos sinais. 3.As amostras com anticorpos contra o CMV, HAV, HIV, HCV, o vírus da rubéola e as amostras positivas Anti-HBs não influenciam o resultado do teste. 4.Com amostras com valores elevados de transaminases e auto-anticorpos ou amostras contendo ANA não foi verificada qualquer influência sobre o resultado do teste. 5.As amostras com anticorpos contra o EBV e as amostras de pacientes hemodialisados podem apresentar uma reactividade elevada. 6. Os soros insuficientemente coagulados, o material de amostra contendo azida de sódio e as amostras de análise contaminadas por micróbios não devem ser utilizadas. Os componentes com eventuais partículas existentes (p. ex., coágulo de fibrina) deverão ser eliminados antes da realização do teste. 7.Tratando-se de amostras descongeladas, é necessário prestar atenção a que o material fique bem homogeneizado. OWSE G13 C0541 (909) H/R 45 8.Os reagentes (excluindo a solução de lavagem POD, a solução de bloqueio POD e a solução cromógena pronta para uso fabricada a partir de reagentes associados a lotes de cromógeno TMB e tampão/substrato TMB) só deverão ser utilizados associados a lotes, ou seja, unicamente na combinação de 6 números da designação do lote (designação do lote) impressa na embalagem ou retirados, respectivamente, da tabela do código de barras embalada separadamente. 9.O tampão/substrato TMB, a solução cromógena pronta para uso e a solução de bloqueio POD não podem entrar em contacto com iões de metal pesado ou substâncias oxidantes (não utilizar pipetas com partes metálicas para conduzir o líquido). Não executar as reacções do substrato na proximidade de desinfectantes contendo hipoclorito. A coloração espontânea da solução cromógena pronta a usar antes de ser transferida para a placa de ensaio indicia que há contaminação; é necessário preparar uma solução fresca num recipiente limpo. Evitar o contacto da pele com as soluções referidas anteriormente. 10.Durante a incubação, a placa de ensaio deverá repousar (p. ex., sobre um flutuador fixo ou em banho-maria não circulante); neste caso, as cavidades ficam em contacto com a água temperada. Se forem utilizados estabilizadores para impedir a propagação dos germes na água, é necessário ter todo o cuidado para que nem a superfície das placas de ensaio, nem as cubetas entrem em contacto com estas soluções, uma vez que essa circunstância pode provocar reacções não específicas. 11. Nas amostras fortemente reactivas, na reacção de bloqueio o corante pode perder-se. A interpretação fotométrica não é influenciada por esse facto. 12.Os soros de controlo são preparados utilizando soros humanos congénitos. Por essa razão, podem ocorrer turvações que, todavia, não influenciam o resultado do teste. 13.A Dade Behring validou a utilização destes reagentes em vários analisadores, com o intuito de optimizar o desempenho do produto e satisfazer as especificações do produto. As modificações definidas pelo utilizador não são suportadas pela Dade Behring, na medida em que podem afectar o desempenho do sistema e os resultados do ensaio. Constitui responsabilidade do utilizador validar as modificações efectuadas nestas instruções ou em relação ao uso dos reagentes noutros analisadores que não os incluídos nas folhas de instruções de aplicação da Dade Behring ou nestas instruções de utilização. 14.Os resultados deste teste devem sempre ser interpretados em conjunto com o histórico médico do doente, estado clínico e outros dados de interesse. Características dos testes Sensibilidade e especificidade Os resultados referentes ao controlo da sensibilidade e da especificidade, estão resumidos nas tabelas 2 e 3 (no anexo). Para determinar a sensibilidade, foram analisadas 192 amostras anti-HBc/IgM positivas. Todas as amostras testadas foram consideradas positivas, de acordo com os critérios do Enzygnost* Anti-HBc/IgM. Independentemente disso, em caso de utilização ampla do teste, não é de excluir que para algumas das amostras individuais não se possa fazer a prova. Para determinar a especificidade, foram examinadas 2559 amostras anti-HBc/IgM negativas e foi determinada uma especificidade de 99,60% a 99,91% (teste inicial) ou de 99,91% a 100% (novo teste).Os valores podem ser divergentes, entre outras coisas, em função da população examinada e da execução do teste. De acordo com o nível de conhecimentos actual, do resultado positivo do teste anti-HBc/IgM não pode inferir-se com segurança que exista uma infecção de HBV, da mesma maneira que, o resultado negativo do teste também não exclui com segurança a infecção de HBV. Reprodutibilidade Os resultados dos ensaios Intra/Inter estão resumidos na tabela 4 (no anexo). Neste caso, tratase de dados determinados a título exemplificativo. É perfeitamente possível obter valores divergentes, em função da execução do teste. * Enzygnost e uma marca registada da Dade Behring Marburg GmbH na Alemanha e noutros países. BEP e uma marca registada da Dade Behring Marburg GmbH nos EUA, na Alemanha e noutros países. Boviserin é uma marca registada da Aventis Behring. Dade Behring Marburg GmbH Emil-von-Behring-Str. 76 D-35041 Marburg www.dadebehring.com OWSE G13 C0541 (909) H/R 46 0197 Tab. 1 Estabilidade e condições de conservação Material/Reagente Estado Conservação Estabilidade• Amostras de análise diluídas Diluídas 1+100 com amostras tampão (Anti-HBc/IgM) +2 a +8 °C 24 horas Placa de teste (restantes barretas) aberto +2 a +8 °C 6 semanas no saco com cáp- sulas desidratantes Conjugado HBcAg/POD aberto +2 a +8 °C 4 semanas Tampão para amostras (anti-HBc/IgM) aberto +2 a +8 °C 4 semanas Solução de uso do conjugado 1+10 Tampão para amostras (anti-Hbc/IgM) aberto Soro de controlo anti-HBc/IgM, positivo +2 a +8 °C 4 semanas +18 a +25 °C 1 semana +2 a +8 °C 4 semanas +2 a +8 °C 4 semanas +2 a +8 °C 4 semanas aberto Soro de controlo anti-HBc/IgM, negativo Cromógeno TMB aberto +2 a +8 °C até data de venci. Tampão/substrato TMB aberto +2 a +8 °C até data de venci. Solução de uso do cromógeno 1+10 +2 a +8 °C 5 dias +18 a +25 °C 8 horas recipiente fechado, ao abrigo da luz Solução de lavagem POD (concentrado) não diluída aberto 1:20 1:20 +2 a +8 °C +2 a +8 °C +18 a +25 °C até data de venci. 1 semana 1 dia Solução de paragem POD aberto +2 a +8 °C até data de venci. • Nunca depois da data de vencimento OWSE G13 C0541 (909) H/R 47 Tab. 2 Sensibilidade Nas análises de sensibilidade, foram determinados os seguintes dados: Enzygnost* Anti-HBc/IgM População de amostras Número de Inicialmente Novo teste amostras reactivo reactivo Infecção aguda de HBV 192 192 n.d. Tab. 3 Especificidade Nas análises de especificidade, foram determinados os seguintes dados em dois centros independentes (W, R): Enzygnost* Anti-HBc/IgM População de amostras Número de Inicialmente Novo teste amostras reactivo reactivo (W) soros normais negativos (W) plasmas normais negativos (R) população de pacientes 997 501 1061 2 2 1 0 0 1 Tab. 4 Reprodutibilidade Ensaio Intra Amostra Valor médio de extinção FP 1 0,236 FP 2 0,182 FP 3 0,155 FP 4 0,159 Ensaio Inter Amostra Valor médio de extinção FP 1 0,158 FP 2 0,113 FP 3 0,125 FP 4 0,104 OWSE G13 C0541 (909) % VK 4,3 6,8 6,3 5,7 % VK 10,9 5,9 5,8 16,9 H/R 48 No exame referente ao ensaio Intra da reprodutibilidade, as amostras foram testadas sempre com uma determinação de 20 x (FP 2, n = 18). No exame referente ao ensaio Inter da reprodutibilidade, as amostras foram testadas sempre com uma determinação tripla, em 5 operações diferentes. Tab. 5 Procedimento e programação Enzygnost* Anti-HBc/IgM Programação do Menu Procedimento (BEP® II, BEP® III, BEP® 2000) Preparação dos reagentes para o BEP® 2000 BEP® II MENU NO 4 x 10 µl soro de controlo, negativo 2 x 10 µl soro de controlo, positivo 10 µl de amostras pré-diluída cada vez OPERATE 1 NO OPERATE 2 YES Dosagem do conjugado ® ® BEP II BEP III 15 min (máx 30 min) (+18 a +25 °C) placas incompletas: completar até meia placa com „barretas de água“ 100 µl de solução de uso do conjugado WASHINGS ASPIRATE SOAKTIME DISP VOL CHANNEL NO PHOT 100 1 NO OPERATE 3 YES Lavagem e dosagem do cromógeno 60 min ± 2 min (37 ± 1 °C) processamento automático Lavar: BEP® II 4 x WASHINGS ASPIRATE SOAKTIME DISP VOL CHANNEL NO PHOT 4 NO 0 100 4 NO OPERATE 4 YES Dosagem da solução de bloqueio 100 µl de solução de uso do cromógeno 30 min ± 2 min (+18 a +25 °C ao abrigo da luz) 100 µl de solução de paragem após máx 1 hora Leitura 450 nm (Comprimento de onda de ref.: 650 nm) Resultado do teste OWSE G13 C0541 (909) H/R 49 WASHINGS ASPIRATE SOAKTIME DISP VOL CHANNEL NO 0 NO 0 100 5 PHOT YES MEAS WL REF WL BLK COR EVAL MODE GEN CUT NEG CONT MAX NEG MIN NEG FACT NEG MAX POS THRESH CUT OFF 450 650 NO 1 NO 4 0.1 0.07 - Bibliography/Literatur/Littérature/Bibliografia/Bibliografía/Bibliografia 1. Frösner G. Viral hepatitis. In: Thomas L, ed. Clinical Laboratory Diagnostics, Frankfurt/Main: TH Books, 1998: 1260-87. 2. U.S. Department of Health and Human Services CDC, Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, HHS Publication (CDC) 93-8395; 1999; Section II; 8-16 Symbols Key / Symbolschlüssel / Explication des Symboles / Interpretazione simboli / Clave de los Símbolos / Chave dos Símbolos Manufactured by / Hergestellt von / Fabriqué par / Prodotto da / Fabricado por IVD LOT EXP CCYY-MM-DD In Vitro Diagnostic Medical Device / In Vitro Diagnosticum / Dispositif Médical Diagnostic In Vitro / Dispositivo Medico per Diagnostica In Vitro / Producto sanitario para Diagnóstico In Vitro Lot Number / Chargenbezeichnung / Numéro de Lot / Numero di Lotto / Número de Lote Expiration Date / Verfalldatum / Date de Péremtion / data di scadenza / Fecha de vencimiento / termo da validade Storage Temperature / Lagertemperatur / Température de Conservation / Temperatura di conservazione / Temperatura de almacenamiento / Temperatura de armazenagem CE Mark / CE-Zeichen / Marquage CE / Marchio CE / CE Marca / Marca CE REF Catalogue Number / Katalog Nummer / Référence / Codice Catalogo / Número de Catálogo Consult Instructions for Use / Gebrauchsanweisung beachten / Consulter la Notice d'Utilisation / Istruzioni per l'uso / Consultar Instucciones para el Uso / Consulte as Instruções de Utilização OWSE G13 C0541 (909) H/R 50