esclerosis multiple bandas oligoclonales en lcr

ESCLEROSIS MULTIPLE
BANDAS OLIGOCLONALES EN LCR
Bioq. María Josefina Boero
Hospital Italiano de Buenos Aires
Esclerosis Múltiple
“Es una enfermedad inflamatoria,
desmielinizante, neurodegenerativa
de curso crónico del SNC”
INFLAMACIÓN
DESMIELINIZACION
GLIOSIS
DOCTOR, ¿ CUÁL ES LA
CAUSA DE LA EM?
…………
Esclerosis Múltiple (EM)
• Se piensa en un mecanismo autoinmune: “Debido a la
destrucción selectiva de la capa de mielina y de las fibras
nerviosas, y secundariamente un daño neuronal progresivo”
• Se caracteriza por la ocurrencia sucesiva de focos de
desmielinización diseminados en tiempo y espacio en varias
áreas del SNC, incluidos la región periventricular, la médula
espinal, el tronco encefálico, el cerebro y el nervio óptico.
EM: Epidemiología
• La enfermedad suele comenzar entre los 20 y 40 años, con
un pico máximo a los 30 años
• Es más frecuente en mujeres (2:1) y en caucásicos
• No se conoce las razones de la variación de prevalencia en
el mundo, pero piensan que los factores genéticos y
ambientales podrían ser la causa
EM: Distribución mundial
The New England Journal of Medicine 2000;938:952-Vol. 343-Núm 13.
En el Mundo….
• La prevalencia más alta de la enfermedad (30 /100000)
se encuentra en el norte de Europa, sur de Australia y
centro de Norte América.
En Argentina….
• Argentina es un país con una prevalencia de
18/100000, lo que significa que hay 5500-6500 casos.
Con 2.24 nuevos casos /año.
EM: Factores de riesgo
Factor genético…
Se asocia a pacientes que presentan ciertos antígenos del
complejo mayor de histocompatibilidad HLA-DR2
Factor ambientales…
En estos individuos la exposición a ciertos factores
(infecciones virales, polisacáridos bacterianos, súper
antígenos, toxinas) resultarían en la activación y
proliferación del sistema inmune.
Fisiopatología
EM: Fisiopatología
EM: Fisiopatología
Factores genéticos y
ambientales
1
Factores locales: infección
viral, stress metabólico
2
3
MBP, MOG, glicoproteína
asociada a mielina, proteína
proteolipídica,β- cristalina,
fosfodiesterasas y S-100
Citoquinas proinflamatorias
pueden aumentar la
expresión de moléculas en
la superficie de LT y CPA
4
Up-regulation
Down-regulation
6
Injuria mediada por células
Injuria mediada por citoquinas
Digestión de Ag de superficie
de mielina por macrófagos
5
Injuria inmunológica
mediada por Ac y activación
del complemento
•Resolución de la rta inflamatoria
•Remielinización espontanea
•Propagación de los canales de
Na de los nódulos de Ranvier
Injuria directa de
oligodendrocitos
por CD8+ y CD4+
Axones desnudos
The New England Journal of Medicine 2000;938:952-Vol. 343-Núm 13.
EM: Fisiopatología
En algunas lesiones la presencia de inmunoglobulinas y
activación del complemento sugieren que los Ac tienen un
rol en el desarrollo de la lesión.
Se observa una distrofia primaria de los oligodendrocitos.
Finalmente, en otras lesiones un borde de
oligodendrocitos necróticos se ven adyacentes al borde de
la placa activa.
EM: Fisiopatología
El marco patológico de la enfermedad es la PLACA DESMIELINIZADA
La placa es una zona bien
demarcada caracterizada por la
pérdida de mielina, con
preservación del axón y formación
de cicatrices astrociticas.
La injuria irreversible axonal y la
escasa población de
oligodendrocitos progenitores
resulta en la pérdida progresiva de
la función neurológica.
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Manifestaciones clínicas
Debilidad de las extremidades
• Pérdida de fuerza
• Fatiga
• Descoordinación en los movimientos
• Espasticidad
Neuritis óptica
• Disminución de la agudeza visual
• Visión borrosa
Síntomas sensitivos
• Parestesias
• Hiperestesia
Alteraciones cognitivas
• Pérdida de memoria a corto plazo,
depresión
• Falta de atención
• Dificultad para resolver problemas
• Lentificación del procesamiento de la
información
• Alteración del juicio
• Labilidad emocional
Otros síntomas
• Disfagia
• Disartria
• Disnea
• Espasticidad
• Disfunción sexual
• Estreñimiento
EM: Patrones clínicos
Discapacidad
EM RECURRENTE-REMITENTE: 85%
EM SECUNDARIAMENTE PROGRESIVA: 50%
EM PRIMARIAMENTE PROGRESIVA: 10%
EM PROGRESIVA RECURRENTE: 5%
Tiempo
Diagnóstico
EM: Diagnóstico
• Nuevos criterios para el diagnóstico de EM se han
publicado como resultado de la formación de un comité
internacional
• Objetivo: simplificar la clasificación y acortar el intervalo
entre presentación y diagnóstico
• Se requiere la presencia de hallazgos clínicos y
paraclínicos ( RMN, potenciales evocados y análisis del
LCR)
Arch Neurol. 2005;62:865-870
EM: Diagnóstico
La RMN es sensible pero no específica para el diagnóstico de EM
una cantidad de otras enfermedades pueden mimetizar con EM, ya
sea clínicamente como a través de neuroimágenes.
Los Potenciales evocados no son específicos, ya que las
anomalías en las respuestas provocadas ocurren en un gran número
de enfermedades neurológicas que tienen alteradas las vías que se
estudian (vías visuales, auditivas, somato sensitivas o motoras).
Los estudios en LCR tienen la ventaja de una mayor especificidad
puesto que en población normal, no es frecuente hallar anormalidades
de las inmunoglobulinas en este líquido biológico.
Diagnóstico Diferencial de EM
INFECCIOSAS
• Enfermedad de lyme
• Sífilis meningovascular
• Mielopatías por HIV o HTLV-1
AUTOINMUNES
• LES
• Sjögren
• Sarcoidosis
• Wegener
VASCULARES
• Malformaciones vasculares de la espina dorsal
• Vasculitis primaria
NEOPLASIAS
• Linfomas o gliomas
• Tumores de la espina dorsal
• Síndrome paraneoplásicos
DEGENERATIVAS
• Ataxia espinocerebelar
ENDOCRINAS/METABÓLICAS
• Hipotiroidismo
• Deficiencia de vit. E o B12
GENÉTICAS
• Leuecodistrofia metacromática
Laboratorio
Estudio del LCR: Proteínas
• Las proteínas totales en LCR es el indicador más
sensible de patología en el SNC
• El rango normal de proteínas es de 15-45 mg/dl.
Niños y añosos pueden tener rangos mayores
• Muchas enfermedades pueden aumentar la
permeabilidad de la BHE llevando a un aumento de las
proteínas
Arch Neurol. 2005;62:865-870
Estas enfermedades incluyen:
Bacterianas, virales y otras formas de meningitis
Infiltración neoplásica de meninges
Tumores cerebrales y espinales
Polineuropatías
Hernia de disco
Infarto cerebral, hemorragias
Estudio del LCR: Proteínas
La albúmina, al no ser sintetizada en el SNC, sirve
como un indicador de referencia para monitorear
permeabilidad.
La concentración de IgG debe tomar en consideración el
estado de la barrera, para poder distinguir entre
aumentos por síntesis intratecal y pasaje de proteínas
plasmáticas.
Se recomienda el uso del cosciente Alb LCR/ Alb suero,
en lugar de PT, para evaluar disfunción de la BHE.
Arch Neurol. 2005;62:865-870
EM: Estudio del LCR
Aspecto: Cristal de roca
Leucocitos: normales
( Pleocitosis leve con predominio linfocitario)
Glucosa: Normal
Proteínas totales: Normal o liger. aumentado
IgG LCR/IgG suero: elevada en el 90% de los casos
La respuesta inmune humoral a los antígenos de mielina se
refleja en un aumento de la concentración de IgG y la
síntesis de bandas oligoclonales(BO)
EM: Bandas oligoclonales (BOC) en LCR
Presencia de BOC en LCR y no en suero, indica síntesis
intratecal de IgG
No es exclusiva de la EM sino que también puede estar
presente en enfermedades infecciosas o inflamatorias del
SNC
Existen fórmulas matemáticas para intentar cuantificar la
producción intratecal de IgG.
El consenso establece que la prueba cualitativa esencial
es el IEF seguido de inmunofijación, y que no es
equivalente a ningún dato cuantitativo utilizado
Condiciones que presentan BOC (+) en LCR:
Enfermedad
Incidencia de BOC %
Pruebas sugeridas
EM
98
RMN
PESS
100
Acs anti-sarampión
Neurosifilis
95
Acs anti-treponémica
Neuro-SIDA
80
Acs anti-HIV
Neuro-Lyme
80
Acs anti-borrelia
Neuro-LES
50
Factor antinuclear
Neuro-Behçet
20
C’3 PMN en LCR
Ataxia-telangiectasia
60
IgA sérica
Meningitis-uveítis de Harada
60
PCR sérica
Adrenoleucodistrofia
100
Ácidos grasos de cadena larga
Neuro-sarcoidosis
<5
Test de Kveim
Encefalitis aguda (<7 días)
<5
Acs antivirales
Meningitis aguda (<7 días)
<5
Lactato en LCR, PCR
Neoplasias
<5
TAC
E. J. Thompsom, The National Hospital for Neurology y Nerusurgery Queen Square.
EM: Bandas oligoclonales (BOC) en LCR
Presencia de BOC en LCR y no en suero, índica síntesis
intratecal de IgG
No es exclusiva de la EM sino que también puede estar
presente en enfermedades infecciosas o inflamatorias del
SNC
Existen fórmulas matemáticas para intentar cuantificar la
producción intratecal de IgG
El consenso establece que la prueba cualitativa esencial
es el IEF seguido de inmunofijación, y que no es
equivalente a ningún dato cuantitativo utilizado
Estudio del LCR: Indice IgG
IgG LCR/ IgG suero
Alb LCR/ Alb suero
El valor de este cosciente en un LCR normal es 0.5
EM: Bandas oligoclonales (BOC) en LCR
Presencia de BOC en LCR y no en suero, índica síntesis
intratecal de IgG
No es exclusiva de la EM sino que también puede estar
presente en enfermedades infecciosas o inflamatorias del
SNC
Existen fórmulas matemáticas para intentar cuantificar la
producción intratecal de IgG
El consenso establece que la prueba cualitativa esencial
es el IEF seguido de inmunofijación, y que no es
equivalente a ningún dato cuantitativo utilizado
EM: Toma de muestra
Se deben extraer 3-5 ml de LCR
Se debe tomar al mismo tiempo una muestra de sangre
Conservación de la muestra:
1 semana: 2 a 8 °C
-20 °C
EM: Isoelectroenfoque e Inmunofijación
Las proteínas son separadas de acuerdo a su pI en un gradiente estable
y continuo de pH
La carga de superficie de la molécula (anfotérica) se mantiene
cambiando de acuerdo a su curva de titulación, hasta alcanzar una
posición de equilibrio a lo largo del gradiente de pH
Esa posición de equilibrio la alcanza donde el pH es igual al pI de la
molécula
Es decir, que en IEF las proteínas son continuamente desaceleradas
hacia una zona de equilibrio donde la carga neta es cero( pH=pI)
Esta técnica requiere crear y mantener en el gel un gradiente continuo de
pH, lo que se logra por el pasaje de la corriente eléctrica a través de una
solución de compuestos anfotéricos, cuya característica principal es que
tienen pI muy cercanos, abarcando un dado rango de pH
EM: Isoelectroenfoque e Inmunofijación
Medir la concentración de IgG en suero y LCR por nefelometría.
La concentración de IgG debe ser la misma en ambas
NO se debe concentrar el LCR
Se realiza la corrida en paralelo del suero y LCR en gel de agarosa
para separar las proteínas
Se realiza la inmunofijación con un antisuero anti-IgG marcado con
peroxidasa para detectar BOC de IgG
EM: Preparación de las muestras
Concentración de
IgG en LCR
LCR
SUERO
> 20 mg/L
Diluir para obtener una
conc. de 20 mg/L de
IgG
Diluir para obtener una
conc. de 20 mg/L de
IgG
10-20 mg/L
Sin diluir
Diluir para obtener una
conc. de IgG identica a
la del LCR
< 10 mg/L
Diluir para obtener una
conc. de IgG identica a
la del LCR
Similares concentraciones de IgG para suero y LCR
nos aseguran corridas óptimas
EM: Isoelectroenfoque e Inmunofijación
Medir la concentración de IgG en suero y LCR por nefelometría.
La concentración de IgG debe ser la misma en ambas
NO se debe concentrar el LCR
Se realiza la corrida en paralelo del suero y LCR en gel de agarosa
para separar las proteínas
Se realiza la inmunofijación con un antisuero anti-IgG marcado con
peroxidasa para detectar BOC de IgG
EM: Isoelectroenfoque
Ventajas
• Es una técnica de equilibrio y por lo tanto los resultados
no dependen del modo de aplicación o del tiempo de
operación
• Se mide un parámetro intrínseco fisicoquímico de la
proteína (pI)
• Permite la resolución excelente de proteínas que difieren
en 0.02 unidades de pH en sus pI, que pueden ser
excelentemente separadas en bandas muy finas debido
al efecto de focalizado
EM: Isoelectroenfoque
Limitaciones
• Sólo sustancias anfotéricas pueden ser separadas
• Los anfolitos y los péptidos son reactivos a los mismos
colorantes, por ello se deben usar coloraciones
específicas
• Péptidos cortos no focalizan ya que son isoeléctricos en
casi todo el rango de pH(4-8)
IEF/PAGE Tinción con plata vs IEF/Inmunofijación
Resultado
PAGE/IEF
con Tinción
Ag
IEF
con Inmunofijación
Positivo verdadero
14
33
Falso positivo
12
2
Clin Chem 2000;48:1578
Sensibilidad y especificidad de IEF para EM
Origen
N° total de
pacientes
N° total de
pacientes con EM
Sensibilidad,%
Kostulas et al
1114
58
100
McLean et al
1007
82
95
Ohman et al
558
112
96
Especificidad %
Beer et al
189
98
87
Paolino et al
44
26
86
La presencia de BOC está fuertemente
Relacionada (>95%) con EM
Clin Chem 2000;48:1578
Interpretación de IEF
Patrón
1: Normal (no BO en LCR ni en suero)
Patrón
2: Esclerosis Múltiple (si BO en LCR, no en suero)
Patrón
3: Enfermedad sistémica (algunas bandas en
LCR y adicionales en concordancia con suero)
Patrón
4: Inflamación sistémica (patrón de bandas
idéntico en LCR y suero)
Patrón
5: Gammopatía monoclonal (patrón monoclonal
en espejo en LCR y suero)
Interpretación de IEF
5 PATRONES
Normal
IgG síntesis local
IgG síntesis local
Síntesis no local
Síntesis no local
Banda monoclonal “splitted”
en varias bandas en IEF
Interpretación de una única banda en LCR
La presencia de una banda solitaria en LCR debe ser
interpretada en conjunto con hallazgos clínicos y en suero.
Su presencia está asociada a linfoma, pero también es
observada en sujetos normales y no excluyen el
diagnóstico de EM.
En series de pacientes seguidos por 6 años las dos
terceras partes de los pacientes revertían el patrón, pero
aproximadamente 1/3 desarrollaban una respuesta
intratecal con diagnóstico de EM o síndromes
desmielinizantes. Sin embargo, en la mayoría de los
series la banda única es poco común.
Ejemplos de los perfiles
Patrón 1
Ejemplos de los perfiles
Patron 2
Síntesis local
EM
Ejemplos de los perfiles
Patron 3
Síntesis sistémica+local
Patrón « mayor que »
bandas
adicionales
bandas
adicionales
Monoclonal
componente
Ejemplos de los perfiles
Patron 4
Bandas Idénticas
« En espejo »
Ejemplos de los perfiles
PATRON 5
Bandas
Monoclonales
SUERO
1
2
LCR
3
4
5
6
7
8
9
HYDRAGEL 9 ISOFOCUSING
LCR SUERO
CN CP
sebia
SUERO LCR
CONTROL DE CALIDAD
Control externo
• Hay controles externos de calidad (CAP)
Control interno
• Se utilizan como controles internos de calidad, las
muestras mandadas por el CAP, también pueden ser
usadas muestras de pacientes validadas clínicamente
por un médico
CONTROL DE CALIDAD
Control externo
• Hay controles externos de calidad (CAP)
Control interno
• Se utilizan como controles internos de calidad, las
muestras mandadas por el CAP, también pueden ser
usadas muestras de pacientes validadas clínicamente
por un médico
Conclusión
Nuevos Criterios diagnósticos para
Esclerosis Múltiple
1- El análisis del LCR es una parte integral del diagnóstico
de EM
2- El único análisis informativo es el establecimiento
cualitativo de IgG en LCR, utilizando IEF seguido de una
técnica de detección inmune( fijación o blotting). Esta es
la técnica declarada “gold-standard” por la FDA
3- El análisis cualitativo debe ser realizado en LCR sin
concentrar y debe ser comparado directamente con un
suero corrido simultáneamente en el mismo ensayo
Arch Neurol. 2005;62:865-870
Nuevos Criterios diagnósticos para
Esclerosis Múltiple
4- Corridas óptimas usan similares concentraciones de
IgG para suero y LCR
5- Controles positivos y negativos deben ser corridos en
cada set de muestras y el gel debe ser desechado si
no se ven bien las bandas en los controles
6- El informe del LCR debe ser realizado en términos
de los 5 patrones reconocidos
Arch Neurol. 2005;62:865-870
Nuevos Criterios diagnósticos para
Esclerosis Múltiple
7- La interpretación debe ser realizada por una persona
experta en la técnica utilizada
8- Considerar una nueva punción en el caso de una alta
sospecha clínica pero resultados negativos del LCR, o
solo mostrando una banda
9- El análisis cuantitativo de IgG es un buen complemento
informativo, pero no se considera un substituto al análisis
cualitativo, el cual posee la más alta especificidad y
sensibilidad
Arch Neurol. 2005;62:865-870
Nuevos Criterios diagnósticos para
Esclerosis Múltiple
10- Cuando se realice el dosaje de IgG en LCR, fórmulas
no lineales deben ser usadas para medir integridad de la
BEH, midiendo la relación de albúmina en LCR/Albúmina
en suero
11- Los laboratorios que realicen de rutina la búsqueda de
Bandas Oligoclonales en LCR deben poseer controles
internos y externos de calidad para asegurar un alto
standard de confiabilidad y desempeño
Arch Neurol. 2005;62:865-870
BIBLIOGRAFIA
Recommended Standard of Cerebrospinal Fluid Analysis in the Diagnosis of
Multiple Sclerosis . A Consensus Statement
Mark S. Freedman, MSc, MD, FRCPC; Edward J. Thompson, DSc; Florian
Deisenhammer, MD; Gavin Giovannoni, PhD; Guy Grimsley, PhD; Geoffrey
Keir, PhD; Sten Öhman, PhD; Michael K. Racke, MD; Mohammad Sharief, PhD;
Christian J. M. Sindic, MD, PhD; Finn Sellebjerg, MD, PhD, DMSci; Wallace W.
Tourtellotte, MD, PhD . Arch Neurol. 2005;62:865-870.
Multiple sclerosis.Noseworthy JH, Lucchinetti C, Rodriguez M, Weinshenker
BG. N Engl J Med 2000;343:938-52.
Multiple Sclerosis — The Plaque and Its Pathogenesis
Elliot M. Frohman, M.D., Ph.D., Michael K. Racke, M.D., and Cedric S. Raine,
Ph.D., D.Sc. The new england journal o f medicine2006;354:942-55.
BIBLIOGRAFIA
E. J. Thompson. Líquido cefalorraquídeo en la Esclerosis Múltiple. The National
hospital for Neurology and Neurosurgery Queen Square. London.
Joaquín A. Peña, Eduardo Mora de la Cruz, Cecilia Montiel-Nava.
Enfermedades inflamatorias desmielinizantes. Neurología Pediátrica 3° edición.
Stephen L. Hauser, Donald E. Goodkin. Esclerosis Múltiple. Principios de
medicina interna. Harrison.
Esclerosis Múltiple en la infancia. Silvia N. Tenembaum. Revista Española de
Esclerosis Múltiple N°3:2007.
El estudio de laboratorio en el diagnóstico diferencial de la Esclerosis Múltiple.
Francisco Coret Ferrer, Bonaventura Casanova Estruch. Hospital Clínico
Universitario; Hospital Universitario La Fe, Valencia.
Recomendación para el estudio de las proteínas del líquido cefalorraquídeo
Sociedad Española de Bioquímica Clínica y Patología Molecular. Química
Clínica 2002;83-90.
MUCHAS GRACIAS….