BIOLOGÍA MOLECULAR

BIOLOGÍA MOLECULAR
DOGMA CENTRAL DE LA
BIOLOGIA MOLECULAR
Replicación
Traducción
Transcripción
ADN
ARN
Proteína
Transcripción
inversa
Replicación
Francis Crick (1958/1970)
P
OH
H2C O
T
A
C
G
A
T
P
H2C O
Mólecula de
ADN  carga
negativa!
H2C O
O
P
H2C O
OH
G
2 ’:
de
s
C
ox
i
P
5’
P
P P
3’
H2C O
H2C O
O
P
O
H2C O
P
P
-O
P
Grupo fosfato
H2C O
P P
... 2 de abril de
1953, Molecular
Structure of
Nucleic Acids.
A Structure for
Deoxyribose
Nucleic Acid.
Nature 171: 737.
J. D. WATSON and F. H. C. CRICK
3
REPLICACIÓN DEL ADN
Cadena
“lagging”
Horquilla de
replicacion
5’
3’
3’
5’



5’
3’
Cadena “leading”
ENZIMAS:
* Helicasa + prot. SSB, desenrolla ADN doble cadena:

* Primasa (ARNpol; dnaG), fragm. ARN 10 pb :
* ADN replicasa:
DNApol III, síntesis (sub. , polC, dnaE).
* DNApol I: actividad exonucleasas 3’
* ADN ligasas:
5’ “proof reading” + 5’
3’.
4
TRANSCRIPCIÓN
ARN Ribosomal
ADN RNApol
ARN Mensajero
Proteína
ARN Transferencia
INICIACIÓN
Promotor


ARN
rpoA: ensamblado enz.,
reconocimiento del Pr,
activadores

rpoB
catálisis
’

rpoC
rpoD: especificidad
del Promotor
4
TRANSCRIPCIÓN
REGIÓN PROMOTORA
upstream
Codificante
- 35
- 10
+1: Inicio ARN
5’
3’
5’
Templado
17 bp
TTGACA
7 bp
TATAAT
downstream
4
TRANSCRIPCIÓN
TERMINACIÓN
ARN
A Ter. Intrínsecos
loop
B Rho-dependiente
5’
50-90 pb;
C, G
G-C
hairpin
stem
+
UUUUUU
5’
-UUU
REGIÓN TERMINADORA
Rho
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TRADUCCIÓN
RIBOSOMA
50S
ARNr 23S (2904 pb) + 5S,
31 proteínas diferentes
70S
30S ARNr 16S
21 proteínas diferentes
66% ARNr
5’
+1
30 nucleótidos
AUGUCGAAGCAA
GUG
Región
UUG
codificante
Iniciación
AAACAGGAGG (10 nuc)
Shine-Dalgarno
(RBS)
3’
GGAGG AAU
U
GUC GU
G
A
C CC
U
GU
G
A UU
U
GA
AU
U UUA AAA
UGA GCG
UUUAUG - - - - - C A
UAG
AAA UAC
UUU
UAA
Sitio P
Sitio A
Transpeptidación
Canal de
salida
5’
3’
5
G
CA
AA
U
GG
A
A
C
UA
A
U
COOH
U UU
CAG
UA
AA
A
UGA
UAG CGC
UAA
Plegamiento
NH2
C
7
MARCO ABIERTO DE LECTURA = ORF
5’-UCCAUGCAACAUGGAUGCGAU….
RNAm
5’-UCC AUG CAA CAU GGA UGC GAU ….
5’-UC CAU GCA ACA UGG AUG CGA U ….
5’-U CCA UGC AAC AUG GAU GCG AU ….
AUG
UGA
5’-UCCAUGCAACAUGGAUGCGAUGUCGAAGUAUUGACUAA...
AUG
AUG
1º
2º
3º
MLA (ORF)
AUG
AUG
AUG
UGA
L
UAA
L
7
ORF´S
ARNm es policistrónico
Genes
ARN
pol
Promotor
RBS
ARNm
BACTERIAS
Transcripción
+
Traducción
+
Degradación
Sin
protección
Vida ½
2 min.
Sin
procesamiento
posterior
GENETICA MICROBIANA
8
MUTACIONES
PUNTUALES:
5’…T A C…
…A T G…5’
MUTACIONES
ADN
AAC
TTG
TAG
ATC
REPLICACION
NORMAL
TAT
ATA
TAC
ATG
Alelos
TRANSCRIPCION
ARN
codón AAC
Asparagina
codón UAG
Stop
codón UAU
Tirosina
codón UAC
Tirosina
TRADUCCION
PROTEINA
Mutación
MISSENSE
Mutación
Mutación
NONSENSE SILENCIOSA
WILD TYPE
8
MUTACIONES
REARREGLOS:
Inserción de ADN exógeno
ORF
INSERTO
Interrupción ORF:
Interrupción promotor:
- Proteína quimera: ¿funcionalidad?
- Proteína trunca
- Modificación nivel de expresión:
¿expresión?
- Expresión de proteína del inserto
8
MUTACIONES
REARREGLOS:
Deleción de ADN
ORF
ELEMENTO MOVIL
Escisión
ELEMENTO MOVIL
Eliminación ORF:
- Perdida de funcionalidad
ORF
Duplicación ORF
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GENOTIPO Y FENOTIPO
GENOTIPO: información genética
de un organismo
FENOTIPO: características o propiedades
observables
de
un
organismo,
resultantes de su genotipo.
Genotipo relevante: diferencias con
el organismo “wild-type”
lacZ
hisC1
LacZ-: no fermenta galactosa
HisC-: no sintetiza histidina
rpsL
StrR: resistente a streptomicina
recA
RecA-: incapaz de recombinar
MUTACION: cambio heredable en la
secuencia de bases del genoma de
un organismo.
MUTANTE: organismo cuyo genoma
posee una mutación.
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REVERSIONES
i ón
c
e
l
De
Cepa salvaje
o wild type
Inserción
Mutante por
deleción
Mutante por
inserción
Delec
ión
le
a
ntu io
u
p sit
n
ó
ci smo
a
t
i
Mu el m
Mutación
puntual
Mutante por
sustitución
Mutación
supresora
n
Revertante
verdadera
Revertante
2º sitio
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ADQUISICIÓN DE ADN EXÓGENO: TRANSFORMACIÓN
ADN
“desnudo”
“Uptake”
Recombinación
de ADN
Homologa
Cepa
COMPETENTE
Cepa
TRANSFORMANTE
Alelo R
(exógeno)
Alelo S
(bacteriano)
RecA
Recombinante
(gen en mosaico)
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ADQUISICIÓN DE ADN EXÓGENO:
TRANSDUCCIÓN
Bacteriófagos:
Genoma viral
Cápside
Cola
Ciclo lítico
Receptor
Lisis bacteriana
Multiplicación
Ciclo lisogénico
Inyección
Inducción
Integración
Duplicación
bacteriana
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ADQUISICIÓN DE ADN EXÓGENO: CONJUGACIÓN
Genes relacionados con la
movilidad = MOB o Dtr
(DNA-transfer replication)
R
B
MO
ep
F
P
M
Plásmidos
•
•
•
•
ADN circular (ds)
extra-cromosomómico
autoreplicativo (replicasa)
heredable
Replicasa
Genes relacionados con la
conjugación/apareamiento =
MPF (mating pair formation)
ss-ADN
Receptor
Cepa DADORA
Cepa ACEPTORA
Cepa DADORA
Cepa TRANSCONJUGANTE
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ADQUISICIÓN DE ADN EXÓGENO: CONJUGACIÓN
MOB  oriT + Relaxasa
- oriT = Origen de transferencia
- Relaxasa = Reconoce oriT en cis
Movilización de plásmidos
B
MO
T4CP
T4CP = Proteína de acoplamiento
tipo IV
F
MP
B
MO
T4SS
MPF  12-30 genes
- T4SS = Sistema de secreción
tipo IV
No movilizable
(sin modulo MOB o
MOB funcional)
No movilizable
Movilizable
Conjugativo
oriT relaxasa T4CP
T4SS
MOB
MPF
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ADQUISICIÓN DE ADN EXÓGENO: CONJUGACIÓN
- Extracromosómico: autoreplicativo y heredable
- Tamaño variable: 2-300 Kb
- Numero de copias variable: 1-200 copias/célula
(bajo-medio-alto) (xej. ColE1⋍20 copias)
Plásmidos
Características
- Rango de hospedador: amplio o acotado
- Incompatibilidad: más de 20 grupos de INC
- Distintas funciones: rutas metabólicas, factores de
virulencia, genes de resistencia
- Baja frecuencia de perdida de plásmido (<10-7 cél)
- Sistemas veneno/antídoto (plásmidos R1)
- Plásmidos movilizables < plásmidos conjugativos
(genes MPF)
13
ADQUISICIÓN DE ADN
EXÓGENO: CONJUGACIÓN
Transposones conjugativos
- ADN lineal, inserto en cromosoma o
plásmido.
- Distintas funciones: rutas metabólicas,
factores de virulencia, genes de
resistencia
- x ej: Tn916, Tn5397
14
RECOMBINACIÓN
HOMOLOGA
Secuencias homologas de
larga extensión
SITIO ESPECÍFICA
Secuencias específica
(fagos, transposon)
TRANSPOSICIÓN
Inserción en una secuencia
sin homología
(secuencias de inserción,
transposones)
Fago
Fago
Tn
Tn
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RECOMBINACIÓN
HOMÓLOGA
Moléculas de ds-ADN
con secuencias
homólogas
Corte en una hebra de
ADN en cada duplex
homólogo (nicked)
Intercambio de hebras
cortadas con el otro
duplex homólogo
Desplazamiento del
punto de intercambio
2º corte en la misma hebra
Ligación
de “nicks”
Genoma no
recombinante pero con
región heteroduplex
2º corte en la otra hebra
Intercambio y
desplazamiento
del 2º punto de
recombinación.
Ligación de
“nicks”
Genoma
recombinante
reciproco
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ELEMENTOS MOVILES
Secuencias de Inserción (IS) o
Transposon simple
Repeticiones invertidas
Transposasa
1234567
1234567
ATGCCTAGT
TACGGATCA
Secuencia Target
~ 9 bp
IS se insertan en:
- secuencia específica
- sitios calientes
- al azar
TACGGATCA
1234567
ATGCCTAGT
Transposasa
Se generan
repeticiones directas
1234567
ATGCCTAGT
TACGGATCA
Transposones Compuestos (Tn)
GENES FLANKEADOS
POR DOS SECUENCIAS DE INSERCION(IS)
IS en igual dirección
IS
GENES
IS
IS en dirección invertida
IS
GENES
IS
*Si ambos IS´s son iguales pueden
ser los 2 o solo 1 funcional
Gen resistencia
No funcional
IS10L
TET, CMP,
KAN, AMP
AATTC
TTAAG
Transposasa Resolvasa
TetR
IS10R
Tn10
Transposones Compuestos (Tn)
Transposición
Replicativa: Duplicación del Tn,
copia en sitio original y nuevo
(Transposasa + Resolvasa)
Tn
No-replicativa / Conservativa: El Tn
se mueve de un sitio a otro sin dejar
copia en sitio original (Transposasa)
Tn
Tn
Tn
Tn
Tn1546
ORF1
ORF2
vanR
vanS
vanH
vanA
vanX
vanY
vanZ
IRL
IRR
GTTAA
Tn1546
GTTAA
ORF1
ORF2 vanR vanS
vanH vanA vanX
vanY vanZ
GTTAA
IRL
IRR
ORF1:
Posible Transposasa
ORF2:
Posible Resolvasa
IR’s:
38bp caracteristicas de Tn3
Sitios res: 12bp repetidas en region intergenica de ORF1 y ORF2
vanA = vanR (Activador Transcripcion), vanS (Reg Negativo de la Transcripcion), vanH
(Deshidrogenasa), vanA (Ligasa), vanX (D,D-dipeptidasa), vanY (D,D-Carboxipeptidasa), vanZ (R Teico)
ORF1, ORF2, vanY, vanZ
 29-37% GC
vanS, vanR, vanH, vanA, vanX  41-45% GC
Distintos origenes
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REGULACIÓN GENICA: INDUCCIÓN TRANSCRIPCIÓN
Factores externos
- Sustratos
- Factores ambientales
Activación de factores de transcripción:
- Fosforilación del FT
- Activación por unión al sustrato
Factores internos
- Metabolitos enzimáticos
Activación de factores de transcripción:
- Activación por unión al sustrato
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REGULACIÓN GENICA
Operador
Gen regulatorio
Pr
+
LacY LacA
D
C
B
A
Pr
Represor inactivo
(-)
Represor
activo
LacZ
Operon lac
Operador
E
+
lacY lacA
Pr
Pr
Regulador
(represor)
(-)
LacI
Presencia de
triptófano
lacZ
E
No se expresa
operon triptófano
D
C
B A
Operon trp
Biosíntesis de
triptófano
Regulación ciclos lítico y
lisogénico del fago
Lambda
OL/PL
Head
Tail
OR/PR
Recomb
PR´
Replic Lys
cl