si-mcs09 ¿son utiles los trasplantes neuronales para el control de

¿SON UTILES LOS TRASPLANTES NEURONALES PARA EL CONTROL DE
CRISIS TÓNICO-CLONICAS?
Claudia Castillo, M. S. Mendoza, M. Giordano
Laboratorio de Plasticidad Cerebral, Departamento de Neurobiología Conductual y Cognitiva.
Instituto de Neurobiología, UNAM Campus Juriquilla. Carretera Qro-S.L.P. km 15.5, Juriquilla, c.p.
76230,
Querétaro,
Qro.
e-mail:
[email protected];
[email protected];
[email protected]
RESUMEN
El sistema nervioso central tiene una capacidad de regeneración limitada, por lo que se han propuesto
alternativas como la terapia celular para tratar enfermedades de diverso origen. En este estudio se evaluó el
efecto del trasplante de células sobre crisis tónico-clónicas inducidas por kainato. La línea celular M213-2O
CL4 (CL4)1, transfectada con el cDNA del GAD67h, se utilizó como fuente de trasplante. Ratas macho
Sprague-Dawley se distribuyeron en 3 grupos: trasplante con línea celular control (A), con CL4, y control
(CTRL). Ocho semanas después se administró kainato (AK, 5 mg/kg/h). El grupo CL-4 necesitó un mayor
número de inyecciones para llegar a crisis tipo FV, mayor latencia de aparición a la primer FIII, FIV y FV y
menor número de FIII, FIV y FV. In vitro se evaluó la liberación de GABA por potasio y el contenido total de
GABA, también se cuantificó GABA en el tejido. De acuerdo con lo reportado previamente en la literatura 2,3,
estos experimentos muestran que el trasplante intranigral líneas celulares gabérgicas pueden proteger contra el
desarrollo de las crisis motoras, además los resultados de las mediciones de GABA sugieren que este efecto es
el resultado del incremento de este neurotransmisor en el lugar del trasplante.
1. INTRODUCCIÓN
Actualmente la farmacoterapia es la primera opción a tratamiento de las enfermedades neurodegenerativas,
sin embargo en algunos casos esto reduce los síntomas pero no detiene el progreso de la enfermedad. Aunado
a lo anterior, el SNC tiene una capacidad de regeneración limitada, estas razones han impulsado a muchos
grupos de investigación a la búsqueda de alternativas terapéuticas, entre ellas el uso de vehículos celulares, es
decir la terapia celular, y la terapia génica. La primera consiste en la administración de sustancias de interés
al SNC usando como vehículo el trasplante de células. La finalidad es que estas células trasplantadas
substituyan a las células perdidas y proporcionen al tejido huésped ciertos factores de los cuales carece 4,5. La
terapia génica por otra parte aprovecha los vectores virales para restaurar los niveles de una proteína
determinada con el objetivo de retrasar o detener la degeneración neuronal 6-8. Se han producido líneas
celulares con características específicas gracias a la inserción de genes en una célula inmortal preexistente o
mediante la inmortalización de células a partir de un cultivo primario para así seleccionar aquellas con
características deseables, tales como la producción y liberación de ciertos neuropéptidos y neurotransmisores,
la expresión de ciertos tipos de moléculas de adhesión, factores tróficos y enzimas biosintéticas y metabólicas
1,9-12
.
De particular interés para este trabajo es la línea celular M213-2O de origen estriatal, la cual fue
inmortalizada usando el alelo A58 sensible a temperatura del antígeno T grande del SV40 13. Posteriormente
se transfectó con el cDNA del glutamato descarboxilasa humana (GAD67h) usando como vector un plásmido
episomal basado en el virus de Epstein-Barr. Una de las clonas resultantes (M210-2O CL-4), presenta una
alta expresión de la GAD transgénica y una mayor síntesis de GABA y experimenta apoptosis en respuesta a
fármacos anticancerígenos 1. Estas células son potencialmente útiles en modelos donde existe deficiencia del
neurotransmisor GABA.
La epilepsia comprende un grupo de desórdenes caracterizados por crisis recurrentes debidas a la descarga
excesiva, hipersincrónica de grupos neuronales cerebrales14. Las causas de la epilepsia son diversas, entre
ellas están cambios en las funciones sinápticas y en las propiedades intrínsecas de las neuronas. Se ha
sugerido que las crisis epileptiformes pueden ser el resultado de un desequilibrio entre la neurotransmisión
inhibitoria y excitatoria en el circuito responsable del origen de las crisis 15. Con esta hipótesis en mente, las
crisis podrían ser suprimidas por trasplantes de células liberadoras de GABA en el foco epiléptico, o en sitios
que contribuyen a la generalización y propagación de las crisis 4. Una de las ventajas de los trasplantes es que
la liberación del neurotransmisor podría estar controlada por acción sináptica de las células adyacentes y por
ende estaría bajo control fisiológico.
El modelo de desarrollo de crisis tónico-clónicas con ácido kaínico se considera un modelo de epilepsia del
lóbulo temporal ya que el tratamiento sistémico con dosis múltiples y bajas de este excitotóxico produce crisis
crónicas en las ratas tratadas, presenta un periodo de latencia entre el tratamiento con kainato y el inicio de las
crisis espontáneas y después de la primera aparición, estas crisis son recurrentes y se mantienen hasta la
muerte del animal 16.
Una estructura cuya inhibición reduce las crisis epileptiformes provocadas en diversos modelos, es la
sustancia nigra pars reticulata (SNpr) 17-20. La sustancia nigra pars reticulata (SNpr) envía proyecciones
gabaérgicas hacia el colículo superior y al tegmento mesopontino. También proyecta hacia el tálamo,
específicamente los núcleos intralaminares, ventralanterior y ventrolateral 21,22. Los estudios de aplicación
directa de drogas gabaérgicas y los de trasplantes de células gabaérgicas en la SNpr indican que la
desinhibición de los núcleos blanco de la SNpr puede resultar en la supresión de las crisis epileptiformes. Es
por esta razón que los modelos de crisis epileptiformes serán de utilidad para evaluar los efectos funcionales
del trasplante intranigral de la línea celular gabaérgica que deseamos estudiar.
2. MATERIALES Y METODOS
Trasplantes. Se usaron ratas macho de la cepa Sprague - Dawley sometidas a un ciclo normal (12
luz/12 oscuridad), con agua y alimento ad libitum. Las cuales se distribuyeron en los siguientes grupos: un
grupo intacto sin trasplante (CONTROL); ratas trasplantadas con la línea celular control (A) y un grupo de
ratas trasplantado con la clona M213-20cl-4 (CL 4). Se realizaron inyecciones bilaterales de la CL4 así como
de clona A en la SNpr por medio de la técnica esterotáxica. Se trasplantaron 2l de la suspensión celular
(200,000 cel/l) utilizando una jeringa Hamilton de 10l. Las células fueron marcadas con bisbenzimida
(5M) antes del trasplante.
Dosificación. Ocho semanas después del trasplante, se administró ácido kaínico (5 mg/kg de peso por
hora) por un periodo de 4 horas hasta alcanzar la categoría de fase III, IV y V en la escala de Racine 16. Las
categorías fueron descritas como sigue: Fase III  clonus de los miembros anteriores; Fase IV  Las ratas se
paran en las extremidades posteriores y presentan clonus de los miembros anteriores; Fase V  Fase IV pero
al final la rata cae. Se registró el número de inyecciones necesarias para llegar a la Fase V, y la latencia de
aparición y el número de crisis Fase III, IV y V presentadas por las ratas tratadas. Cinco horas después de
iniciado el tratamiento con ácido kaínico los animales fueron sacrificados.
Análisis histológico. Se anestesiaron las ratas con una sobredosis de pentobarbital (>50 mg/kg) y se
sacrificaron por decapitación. El encéfalo se congeló inmediatamente en hielo seco y utilizando el criostato se
realizaron cortes de 20 m que se montaron en portaobjetos gelatinizados. Por medio de microscopia de
fluorescencia con un filtro ultravioleta se localizaron las células trasplantadas marcadas con la bisbenzimida.
Análisis de la concentración de GABA tisular. En otro grupo de ratas trasplantadas tanto con
CLONA 4 como con células control, se sacrificaron a las 4, 8 y 12 semanas posteriores al trasplante. Después
de la decapitación se realizó la disección del mesencéfalo ventral y se homogenizó con metanol al 85%. Se
centrifugó y el sobrenadante se guardó para su análisis en HPLC. El GABA y glutamato se cuantificaron por
HPLC con detección electroquímica. La detección fue por fase reversa utilizando un método de gradientes
realizando una derivatización precolumna con ortoftaldehído para permitir la detección de aminoácidos.
Pruebas de liberación de GABA por alta concentración de K +. Se realizaron cultivos de las clonas
CL4 y A en placas de seis pozos. Cuando llegaron a una confluencia del 90% se les eliminó el medio de
cultivo y se lavaron con solución salina. Se aplicó una solución amortiguadora con una concentración de K
50mM la cual se recolecto a los 15, 30 y 45 minutos. A la par se tuvo un control en donde se aplico una
solución amortiguadora preparada de manera similar pero con una concentración de K baja (4mM) por 5 min.
Determinación de GABA total. Se realizaron cultivos de las clonas CL4 y A en frascos de 25 cm 2.
Cuando llegaron a una confluencia del 90% se les aplicó ácido sulfosalicílico al 35% por 20 minutos.
Posteriormente se separaron las células con ayuda de un aplicador de plástico y se colocaron en tubos
eppendorf. Se mantuvieron a 4°C toda la noche; después se centrifugaron por 5 minutos a 3000 rpm. El
sobrenadante se destinó para su análisis en HPLC y el precipitado para el análisis de proteínas totales.
RT-PCR. La expresión del transgen se evaluó por medio de RT-PCR en 3 animales trasplantados con
la CL4 y 2 trasplantados con clona control. Los animales fueron sacrificados por decapitación 8 semanas
después del trasplante, se realizó la disección del mesencéfalo ventral y fue congelado en nitrógeno líquido.
Se realizó la extracción de mRNA utilizando Trizol (Invitrogen). La transcripción reversa se realizó utilizando
10 µg de RNA total (Superscript, Invitrogen), y se utilizaron 2µl de la reacción resultante para los
subsecuentes PCRs. Se utilizaron oligonucleotidos sentido correspondientes a un fragmento del vector
pREP10 y un oligonucleotido antisentido que corresponde a una parte del gen hGAD67. Los fragmentos de
DNA amplificados se hicieron pasar por un gel de agarosa al 2%.
3. RESULTADOS
El análisis histológico de los cortes de cerebro de las ratas trasplantadas con la CL4 y con la A marcadas con
bisbenzimida demostró la presencia de estas células en 80% de los animales trasplantados. La localización del
trasplante se observó en la sustancia nigra y en regiones ventrales cercanas a ésta (Figura 1). En los cortes
teñidos con la técnica de Nissl (violeta de cresilo) se observó la presencia del trasplante en el área de la
sustancia nigra, sin presentar necrosis del tejido, ni la presencia de tumores en ninguno de los animales
trasplantados. Se verificó la presencia del trasplante bilateral en la SNPpr antes de incluir a los animales en el
análisis estadístico del número de inyecciones de AK, latencia de las crisis y del número de crisis tipo FIII,
FIV y FV. Después de la inyección del ácido kaínico los animales presentaron inactividad y postración,
minutos más tarde iniciaron las sacudidas (sacudidas de perro mojado) y automatismos, seguidas finalmente
de la aparición de las fases III, IV y IV descritas por Racine manteniéndose en status epilepticus hasta el
término del experimento. Se encontró una diferencia estadísticamente significativa en el número de
inyecciones que se necesitaron para el desarrollo de la Fase V (F(2,23)= 4.25; p<0.05; Figura 2A). Las ratas
trasplantadas previamente con la CL4 requirieron de un mayor número de inyecciones, es decir una mayor
dosis de ácido kaínico para desarrollar crisis tipo FV de Racine con respecto al grupo CONTROL (Prueba
LSD de Fisher, p<0.05, Figura 2A).
A
B
C
D
Figura 1. Distribución y localización de los trasplantes. Las células transplantadas se encontraron dentro de la región de la SNpr y en
regiones ventrales cercanas. El color más intenso en los esquemas representa el área de mayor coincidencia en el grupo trasplantado con
A (A) y CL4 (B). C. Corte coronal que demuestra de manera representativa el trasplante con la línea celular M213-2O CL4 por
microscopia de fluorescencia (C) y el mismo corte teñido con violeta de cresilo (C y D). Las flechas señalan el mismo sitio en las
micrografías. Barra= 50m.
También se encontró una diferencia significativa entre grupos al analizar las frecuencias de las crisis tipo FIII,
FIV y FV (F(2,23)= 6.85, 7.31, 3.95; p< 0.05, respectivamente; Figura 2B). El grupo de ratas trasplantado con
la CLONA 4 presentó una menor frecuencia de las crisis tipo FIII, FIV y FV con respecto al grupo INTACTO
(Prueba LSD de Fisher, p<0.05, Figura 2B). Se analizaron por separado las latencias para la aparición de la
primer sacudida, crisis tipo FIII, FIV y FV (Figura 2C). No se encontraron diferencias entre grupos con
respecto a la latencia de aparición de la primer sacudida. Sin embargo sí se encontraron diferencias
significativas en la latencia para la primer crisis tipo FIII (F(2,24)= 4.91; p< 0.05), la primer crisis tipo FIV
(F(2,24)= 6.07; p< 0.05) y la primer crisis tipo FV (F(2,24)= 5.86; p< 0.05), siendo el grupo trasplantado con
la CLONA 4 el que presenta las latencias mayores de los tres grupos analizados (Figura 2C).
En la figura 3 se muestra que la expresión del trasgen solo se detecta en los animales trasplantados con la
línea celular gabaérgica.
n=9
A
*#
B
4
250
C
n = 10
n=7
4
3
2
1
0
CONTROL
CL4
Latencia de aparición (min)
5
Número de crisis
Número de inyecciones de AK
6
3
2
*
1
150
100
50
0
A
*#
200
0
CONTROL
CL4
A
CONTROL
CL4
A
Figura 2. Efecto de los trasplantes sobre las crisis tónico-clónicas inducidas por AK. A. Número de inyecciones necesarias para presentar
crisis tipo FV. EL grupo trasplantado con CLONA 4 necesitó una mayor cantidad de ácido kaínico para presentar las crisis motoras. B.
Número de crisis (tipo FIII, FIV y FV) observadas para los tres grupos tratados con kainato. El grupo CLONA 4 presenta frecuencias
menores de las crisis observadas. C. Latencia de aparición a la primera sacudida, crisis FIII, crisis FIV y crisis FV. Los animales
trasplantados con la CLONA 4 presentan latencias mayores para la aparición de la primera crisis tipo FIII, crisis FIV y crisis FV
comparado con los grupos CONTROL y A.
Figura 3. Expresión del transgen de GAD67h. Solo se observa la presencia del transen en las
células gabaérgicas y en los animales trasplantados con estas células.
A.
B.
*
25000
Trasplantes de 40,000 células
20000
15000
n=7
10000
n=7
n=7
5000
n=4
0
B.
4w
n=4
n=4
n=4
15 MIN
30 MIN
*
400
300
200
100
0
A
CL4
Intacto
1500000
1000000
500000
n=5
CL4
Transplantes de 400,000 células
8w
600
GABA (nmol/mg proteina)
500
2000000
A
4w
12w
n=5
2500000
0
45 MIN
8w
600
GABA (nmol/mg protein
CL4
n=7
BASAL
A.
3000000
A
GABA (pmol/mg protein)
GABA (pmol/mg protein)
Figura 4. Concentración de
GABA (pmol/mg de proteína)
obtenidos de A. Pruebas de
liberación de GABA por
exposición a un buffer con alto
contenido de potasio y B.
Contenido total de GABA en las
tres líneas celulares en estudio.
12w
*
500
400
300
200
100
Figura 5. Contenido de GABA
tisular. A. En los animales
trasplantados con 40,000 células de
manera bilateral y B. Animales
trasplantados con 400,000 células
por lado en los diferentes tiempos
postrasplante, 4, 8 y 12 semanas.
0
A
CL4
Intacto
En la figura 4 se presentan los resultados de los niveles de GABA obtenidos para las pruebas de liberación y
el contenido de GABA total relacionada con los miligramos de proteína presentes en el cultivo. El contenido
tisular de GABA en los animales trasplantados con 400,000 células o 40,000 células se grafican en la figura 5.
Según estos resultados, el número de células trasplantadas no representa una diferencia en los niveles de
GABA detectados en el tejido. En cuanto al tiempo postrasplante se ha encontrado una mayor concentración
tisular de GABA a las 12 semanas, solo en los animales trasplantados con la CLONA 4, con respecto a sus
niveles a las 4 y 8, semanas los cuales son muy parecidos a los observados para los animales intactos.
4. CONCLUSIONES
Este trabajo muestra el efecto de los trasplantes intranigrales de una línea celular gabaérgica sobre las crisis
tónico-clónicas inducidas por la inyección sistémica de ácido kaínico. La CLONA 4 modula las
manifestaciones de las crisis provocadas por la administración sistémica de ácido kaínico 8 semanas después
del trasplante. También como se demostró, se incrementa la dosis de AK requerida para generar una crisis
tipo FV, sugiriendo que el trasplante puede tener un efecto protector contra el desarrollo de las crisis. Los
animales trasplantados con la clona control que no posee el transgén de la GAD67h, no muestran ninguna
modificación en el desarrollo de las crisis, lo cual sugiere que los efectos benéficos observados podrían estar
relacionados con los niveles de GABA en el trasplante. Resultados similares han sido previamente descritos
en otros modelos de epilepsia experimental como lo son el modelo de kindling (amigdalino y en la corteza
entorrinal) y crisis audiogénicas 2,3,23,24.
En cuanto a los niveles de GABA in vitro, sólo fue posible detectarlos en la CLONA 4, esto posiblemente a
que la sensibilidad del método de detección utilizado no fue suficiente para cuantificar niveles más bajos
presentados con la CLONA CONTROL. La CLONA 4 libera GABA en respuesta a alto potasio y la mayor
concentración se encontró a los 15 minutos después de la administración del buffer con concentración alta de
potasio (50mM), niveles menores de GABA se cuantificaron a los 30 y 45 minutos. Esto probablemente
refleje la degradación de GABA o su recaptura. En cuanto al contenido tisular de GABA, se encontró un
incremento a las 12 semanas postrasplante sólo en los animales trasplantados con la CL4 pero los niveles de
GABA en cerebro no se correlacionan con el número de células trasplantadas. Estos resultados sugieren que
sólo una proporción de las células trasplantadas inicialmente sobreviven en el tejido huésped.
El mecanismo fisiológico por el cual los trasplantes están generando sus efectos sobre la conducta no es muy
claro. En el cerebro huésped las células pueden integrarse al tejido y establecer contactos sinápticos con las
células circundantes, por lo que la liberación de GABA podría estar regulada por las condiciones de
excitabilidad del sistema. Por otra parte estas células in vitro producen GABA de manera tónica, por lo que no
hay que descartar que podrían estar funcionando in vivo como minibombas biológicas, modificando el
ambiente neuroquímico del tejido huésped. Hasta el momento sólo podemos decir que la única diferencia
entre los grupos trasplantados con las células gabaérgicas, es la presencia del transgen de la GAD67h. Esto
nos lleva a pensar que es el incremento en el contenido de GABA el responsables de los efectos conductuales.
Otro aspecto importante que tenemos que considerar es que las determinaciones neuroquímicas se realizaron
en animales trasplantados que no recibieron el tratamiento con ácido kaínico, por lo que es necesario realizar
estudios futuros en los que se determinen los cambios en GABA producidos por el trasplante en animales con
crisis tónico-clónicas de forma dinámica usando microdiálisis.
* Agradecemos la asistencia técnica del Dr. Manuel Aguilar, Andrés Falcón, Lourdes Lara, Pilar Galarza, Leopoldo Santos,
Martín García, Elsa Nydia Hernández, Dra. Aurea Orozco, M. en C. Patricia Villalobos, y el Dr. Michael C. Jeziorski.
Trabajo auspiciado por DGAPA-PAPIIT IN225305-16 y CONACYT (46161).
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