LA HONORABLE CÁMARA DE DIPUTADOS DE LA PROVINCIA DE BUENOS AIRES

Honorable Cámara de Diputados
Provincia de Buenos Aires
PROYECTO DE DECLARACION
LA HONORABLE CÁMARA DE DIPUTADOS DE LA PROVINCIA DE BUENOS
AIRES
DECLARA
Que vería con agrado que el Poder Ejecutivo de la Provincia de
Buenos Aires, declare de Interés Provincial, el trabajo de investigación titulado
“ANGIOGÈNESIS Y CÉLULAS MADRE EN EL DESARROLLO DE LOS
ADENOMAS HIPOFISIARIOS HUMANOS” desarrollado por la Investigadora
Dra. Carolina Cristina, Profesora en Química Biológica de la UNNOBA
(Universidad Nacional del Noroeste de la Provincia de Buenos Aires) Regional
Pergamino.
FUNDAMENTACIÒN
El proyecto de angiogénesis y células madre en adenomas hipofisarios se
encuadra en el marco de Promoción de la Ciencia en Medicina, es decir
Ciencia Básica cuyos resultados son publicados en revistas internacionales y
nacionales y fueron objeto de premios y distinciones.
Los tumores o adenomas hipofisarios son los neoplasmas intracraneales
primarios más frecuentes. Se consideran benignos por ser no metastásicos,
aunque pueden volverse agresivos y crecer en forma expansiva invadiendo el
tejido cerebral circundante.
La importancia del estudio de la génesis de los adenomas de hipófisis radica en
la alta incidencia de estos tumores y la necesidad de hallar marcadores
moleculares que pronostiquen el comportamiento tumoral y la posibilidad de
desarrollo de recidivas.
En este sentido dicho laboratorio tiene estrechos contactos con médicos
endocrinólogos que estudian los distintos tipos de adenomas hipofisarios. Se
ha generado una colaboración de los investigadores del laboratorio de la
UNNOBA con hospitales de la región y de la Ciudad de Buenos Aires, y los
conocimientos generados son plasmados en disertaciones y ateneos,
intercambiando discusiones sobre los casos enriqueciendo el conocimiento en
la especialidad.
Asimismo, el presente trabajo se realiza en colaboración con el laboratorio de
Regulación Hipofisaria del Instituto de Biología y Medicina Experimental
(IBYME-CONICET) de la ciudad de Bs As, instituto de investigación
dependiente del CONICET que apoya la actividad de investigación incipiente
en la Universidad Nacional del Noroeste de la Provincia de Bs As.
La UNNOBA es una Universidad joven, por lo que la investigación científica es
una actividad de suma importancia para el desarrollo de la misma y en ella se
llevan a cabo tesis de alumnos de las distintas carreras quienes se entrenan en
distintas técnicas, y pueden acceder de esta manera
a una iniciación en
investigación científica.
En el marco de este conocimiento de la patología hipofisaria, nos proponemos
estudiar a través de una nueva línea en el laboratorio, la incidencia de los
adenomas hipofisarios subclínicos en la población del Noroeste de la Provincia
de Bs As. No tenemos conocimiento de la existencia de estudios científicos de
este tipo en la región de modo que nuestro trabajo aportará datos certeros y
provechosos respecto a la incidencia y características anátomopatológicas de
los adenomas de hipófisis de la región.
Por lo expuesto, solicito a los señores Legisladores se sirvan acompañar con
su voto la presente iniciativa.
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NOROESTE DE LA PROVINCIA DE
BUENOS AIRES (UNNOBA)
ANGIOGÉNESIS Y CÉLULAS MADRE EN EL DESARROLLO DE LOS
ADENOMAS HIPOFISARIOS HUMANOS
Investigador responsable del proyecto:
Dra. Carolina Cristina
CONTENIDOS
INTRODUCCIÓN .................................................................................................... 6
ANTECEDENTES. MARCO TEÓRICO................................................................ 6
TUMOROGÉNESIS HIPOFISARIA .................................................................. 6
ANGIOGÉNESIS EN TUMORES HIPOFISARIOS ........................................... 7
CÉLULAS MADRE EN PROLACTINOMAS Y OTROS TUMORES
HIPOFISARIOS ................................................................................................ 7
RESULTADOS PREVIOS DEL GRUPO DE TRABAJO ........................................ 8
OBJETIVOS DEL PROYECTO............................................................................... 9
INVESTIGADORES PARTICIPANTES ................................................................ 10
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NOROESTE DE LA PROVINCIA DE BS. AS.
(UNNOBA) ......................................................................................................... 10
INSTITUTO DE BIOLOGÍA Y MEDICINA EXPERIMENTAL (IBYMECONICET) ......................................................................................................... 11
METODOLOGÍA A APLICAR ............................................................................... 11
SELECCIÓN DE LOS PACIENTES ............................................................................. 11
OBTENCIÓN DE LAS MUESTRAS .............................................................................. 11
MÉTODOS BIOQUÍMICOS Y MOLECULARES ESPECÍFICOS ........................................... 12
RECURSOS FINANCIEROS PARA EL PROYECTO ........................................... 12
CONSIDERACIONES BIOÉTICAS ....................................................................... 13
BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................... 14
INTRODUCCIÓN
Los tumores o adenomas hipofisarios constituyen el 10% de los tumores
intracraneales; suelen ser benignos, pero causan considerable morbilidad y
mortalidad debido a su localización crítica, su secreción hormonal exacerbada y
su posible expansión hacia zonas contiguas comprometiendo la visión y otras
funciones cerebrales. Dentro de los adenomas hipofisarios, los prolactinomas o
adenomas secretores de prolactina son los más frecuentes, reuniendo el 3040% de los casos.
Los pacientes con prolactinomas son tratados en forma eficaz con agonistas
dopaminérgicos, sin embargo un 15% de ellos son resistentes o intolerantes a
la terapia y deben recurrir a la cirugía.
ANTECEDENTES. MARCO TEÓRICO
TUMOROGÉNESIS HIPOFISARIA
Las dos teorías principales que intentan explicar los mecanismos de
tumorogénesis hipofisaria confrontan la estimulación hormonal contra un
defecto genético intrínseco. Un esquema integrado concilia ambas teorías
donde, el evento iniciador sería una alteración genética que transforma a una
única célula mientras que las hormonas y factores de crecimiento participarían
en la promoción de la proliferación celular (Asa and Ezzat, 1998).
La formación de adenomas hipofisarios, por tanto, resultaría de la acumulación
de varias alteraciones que son las que van a determinar el fenotipo tumoral.
Todavía existen importantes cuestiones por resolver en el tema como por qué
la mayoría de estos tumores son de tipo benigno, qué hace que algunos
tumores se vuelvan invasivos y más agresivos, o resistentes a dopamina (en el
caso de los prolactinomas si fueron sensibles en un comienzo), y el hecho de
que menos del 0,5% de ellos produzca metástasis.
ANGIOGÉNESIS EN TUMORES HIPOFISARIOS
En 1984 Elias y Weiner propusieron que la angiogénesis era necesaria para la
inducción y el crecimiento de los prolactinomas generados por estrógenos en
ratas Fisher 344 (Elias and Weiner, 1984). El VEGF, factor de crecimiento del
endotelio vascular, es el principal mediador del proceso angiogénico en
distintos tipos de tumores, sin embargo su rol y el de otros factores
angiogénicos como el FGF-2 (factor de crecimiento fibroblástico 2) no ha sido
estudiado en profundidad en la tumorogénesis hipofisaria humana.
Si bien el grado de vascularización alcanzado por el tejido hipofisario tumoral
humano es controvertido, varios estudios han demostrado que la angiogénesis
en los adenomas hipofisarios está relacionada con el comportamiento y la
respuesta tumoral (Turner et al., 2000c) (Jugenburg et al., 1995;Turner et al.,
2000b) (Turner et al., 2000a) (Vidal et al., 2001). Por otra parte se ha sugerido
que el FGF-2 podría participar en el proceso de tumorogénesis en algunos
adenomas hipofisarios humanos (Ezzat et al., 1995;Zimering et al., 1993). El
FGF-2 es un mitógeno potente de muchos tipos celulares y se lo ha identificado
tanto en la hipófisis humana normal como tumoral (Li et al., 1992)
(Gospodarowicz et al., 1984).
CÉLULAS
MADRE
EN
PROLACTINOMAS
Y
OTROS
TUMORES
HIPOFISARIOS
Las células madre son progenitores multipotentes con capacidad de autorenovación. Han sido descriptas en prácticamente todos los tejidos adultos
además del hematopoyético.
La hipófisis tiene la capacidad de adaptar la proporción de los distintos tipos de
células endócrinas según las demandas hormonales a lo largo de la vida
(Melmed, 2003). Parte de esta plasticidad puede entenderse por variaciones en
la velocidad de división y muerte de las poblaciones de células altamente
diferenciadas, pero existen también evidencias directas de la existencia de
progenitores multipotentes capaces de dar origen a estos cambios celulares
(Nolan and Levy, 2006) situación compatible con el hecho de que el número de
células productoras de hormonas que se dividen en la hipófisis normal es por
lejos demasiado pequeño para explicar los grandes cambios observados en las
poblaciones celulares ante situaciones determinadas(Levy, 2008).
Recientemente se demostró la existencia de células madre en hipófisis de
ratones adultos mediante la generación de ratones transgénicos que expresan
la proteína verde fluorescente bajo elementos regulatorios del gen de nestina,
gen expresado en células madre de distintos tejidos adultos (Gleiberman et al.,
2008).
Pero, si bien muchos autores suponen
la participación de células
madre en la génesis de los tumores de hipófisis, no existen al respecto, datos
consistentes en la literatura.
RESULTADOS PREVIOS DEL GRUPO DE TRABAJO
El presente proyecto se desprende de los resultados que obtuvimos con los
ratones deficientes en el receptor dopaminérgico D2 (Cristina et al.,
2005;Cristina et al., 2006;Cristina et al., 2007a;Cristina et al., 2007b) los cuales,
al carecer del receptor D2 para la dopamina, desarrollan prolactinomas y son
un buen modelo animal de los prolactinomas humanos resistentes a agonistas
dopaminérgicos. En este modelo describimos un aumento en la expresión de
VEGF en las hipófisis hiperplásicas e hipertróficas de las hembras knockout
(ko) respecto a sus pares wt (Cristina et al., 2005;Cristina et al., 2006) con
existencia de grandes zonas de peliosis o glóbulos rojos extravasados en
ausencia de una contención de endotelio para las hipófisis ko. La peliosis se ha
relacionado en otros tejidos con el aumento de permeabilidad vascular que
promueve VEGF (Park et al., 2000). Demostramos también una regulación del
VEGF por el sistema dopaminérgico en hipófisis de ratón a través del
tratamiento crónico con el antagonista del RD2, haloperidol, en ratones wt
(Cristina et al., 2005;Cristina et al., 2006). Esta es la primera vez que se
describe el control dopaminérgico de VEGF en la hipófisis y podría ser
importante en la acción de los agentes dopaminérgicos. Nosotros creemos que
tanto el VEGF como sus receptores podrían convertirse en blancos
terapéuticos importantes en los prolactinomas resistentes a Dopamina.
Dada la participación de VEGF en el desarrollo de la hiperplasia de lactotropos
en las hembras ko para el RD2, aplicamos un tratamiento antiangiogénico in
vivo con un inhibidor de VEGF, el VEGF-Trap (receptor soluble de VEGF que lo
captura e impide su unión al receptor de membrana). Para el tratamiento se
diseñó un modelo de trasplantes de los prolactinomas en ratones. Observamos
una disminución en el crecimiento del tumor tratado y una menor tortuosidad y
mayor integridad de los vasos sanguíneos en las hipófisis transplantadas y
tratadas en comparación con las controles, indicando probablemente que el
bloqueo de la acción de VEGF sobre el endotelio modificaría las
características de los vasos en hipófisis ko. Asimismo determinamos un menor
contenido de prolactina en los tumores tratados con el inhibidor respecto a los
inyectados con vehículo (Luque et al., 2008), (Luque et al., 2009).
Estos
resultados son de gran interés para dilucidar las consecuencias que tendría el
bloqueo de la angiogénesis en hipófisis tumorales ya que VEGF podría
convertirse en un futuro en el blanco terapéutico para aquellos adenomas de
hipófisis que no responden a los tratamientos convencionales.
Por otro lado, describimos que en diversos prolactinomas experimentales, así
como en macroprolactinomas humanos el gen transformante tumoral hipofisario
(pttg) no está regulado por el RD2, y sí por estrógenos (Cristina et al., 2007b).
En la patología humana tenemos nuestros primeros resultados en marcadores
angiogénicos para un macroprolactinoma extraído en el Hospital Militar de la
ciudad de Bs. As. que se volvió resistente a la terapia con agonistas
dopaminérgicos (Mallea-Gil et al., 2009) en el que detectamos células
adenomatosas
mediana
y
fuertemente
positivas
para
VEGF
y
un
engrosamiento de los vasos sanguíneos tumorales evidenciado por la tinción
para CD31. Además contamos con un moderado número de muestras de
tumores hipofisarios humanos analizadas, provenientes del Servicio de
neurocirugía del Hospital Santa Lucía de la ciudad de Bs. As a partir de las
cuales hemos obtenidos datos interesantes volcados en un manuscrito en
preparación (ver más adelante aprobación del plan por el Comité de Bioética)
OBJETIVOS DEL PROYECTO
Nos interesa estudiar en el marco de nuestro proyecto, la participación de FGF2 junto con la de VEGF en la génesis de los adenomas hipofisarios humanos.
Para otros tipos de tumores ya se encuentra implementada la terapia
antiangiogénica, pero no hay datos sobre estos tratamientos para los
adenomas hipofisarios. Asimismo investigaremos el grado de vascularización
alcanzado por los tumores a través de la determinación de marcadores de
células endoteliales (CD31, CD34 y α-SMA).
Apoyados en nuestra experiencia en la patogénesis hipofisaria y en la
búsqueda de blancos alternativos (Cristina et al., 2006), exploraremos el nuevo
campo de las células madre tumorales ya que analizaremos la existencia e
implicancia de células madre en prolactinomas resistentes a dopamina y otros
adenomas hipofisarios humanos. Éste es un tema ya abordado para otros tipos
de cáncer, habiéndose aislado células madre tumorales en leucemias (Bonnet
and Dick, 1997) , mieloma múltiple y también en tumores sólidos como el
cáncer de mama (Dontu et al., 2003), de pulmón (Jordan, 2004) y distintos
tumores cerebrales (Singh et al., 2003).
El estudio de células madre en
adenomas hipofisarios resulta interesante al momento de comprender los
mecanismos de generación de este tipo de tumores y la falta de respuesta a
drogas convencionales en ciertos casos (Massard et al., 2006).
Finalmente se procederá al estudio del comportamiento tumoral a partir de la
determinación de marcadores de proliferación celular, índices que se
analizarán en conjunto con el grado de angiogénesis y existencia de células
madre (nestin+) en los tumores hipofisarios.
A través del presente proyecto se pretende, por lo tanto, dilucidar los distintos
mecanismos que inician y perpetúan la proliferación y función anómala de los
lactotropos en los prolactinomas como así también de los demás tipos celulares
en el resto de los adenomas hipofisarios.
INVESTIGADORES PARTICIPANTES
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NOROESTE DE LA PROVINCIA DE BS. AS.
(UNNOBA)
Dra. Carolina Cristina: Investigador responsable del proyecto.
Agustín Baricalla: Estudiante de Lic. en Genética cursando su tesina de grado
bajo la dirección de la Dra. Cristina.
La Dra. Cristina ha tomado contacto con los neurocirujanos del Hospital
Interzonal Gral. de Agudos ¨Dr. Abrahan F. Piñeyro¨ de Junín y del Hospital
Interzonal de Pergamino con el objetivo de hacerles conocer el proyecto e
intercambiar ideas relacionadas a la factibilidad y alcances del mismo.
Integrantes del grupo colaborador: Dra. Damasia Becú (Investigadora principal
del CONICET), Dra. Graciela Díaz (Investigadora adjunta del CONICET) en el
INSTITUTO DE BIOLOGÍA Y MEDICINA EXPERIMENTAL de Buenos Aires
(IBYME-CONICET)
Dra. Silvia Berner, jefa del Servicio de Neurocirugia del HOSPITAL SANTA
LUCIA de la Ciudad de Bs As.
METODOLOGÍA A APLICAR
Selección de los Pacientes
Pacientes del Hospital Interzonal General de Agudos de la ciudad de Junín y de
la ciudad de Pergamino que sean derivados a cirugía por tumor hipofisario. Se
clasificarán los adenomas de acuerdo a la secreción hormonal en
somototropinomas, prolactinomas, gonadotropinomas, adenomas secretores de
ACTH y adenomas no funcionantes. Además, según su tamaño se clasificarán
en microadenomas (< 10 mm) y macroadenomas (> 10mm).
El paciente será informado por el cirujano interviniente de los estudios que se
realizarán, firmando el respectivo consentimiento (documento anexo al
presente plan). La privacidad del paciente será siempre preservada.
Obtención de las muestras
Durante la cirugía trans-esfenoidal parte del tejido hipofisario tumoral será
enviado para su estudio anátomo-patológico (como de rutina lo hace el servicio
de Neurocirugía) y parte será fraccionado en buffer Tris- EDTA con inhibidores
de proteasas para determinación de factores angiogénicos, marcadores del
endotelio vascular, de proliferación celular y proteínas expresadas por células
madre por las técnicas de Western blot y/o ELISA. Estas fracciones de
congelarán de manera inmediata a -20˚C para su adecuada conservación hasta
el momento de su procesamiento.
Otra porción se recogerá en formalina para estudios de inmunohistoquímica
(IHQ). En este caso las muestras se conservan a 4˚C y en un plazo no mayor a
una semana se procederá a su deshidratación para la inclusión en parafina.
Además, si el tamaño del tumor lo permite, se reservará
-
Una fracción en Trizol para extracción de ARN y análisis del ARNm de
los factores angiogénicos.
-
Otra porción se colocará en medio de cultivo para su inmediato
procesamiento y obtención de células dispersas in vitro para estudio de
la proliferación celular y secreción de hormonas en respuesta a los
factores angiogénicos.
Asimismo se guardará una alícuota de las muestras de sangre periférica que
de rutina se toman como control pre-quirúrgico, y una alícuota de las muestras
de sangre que se toman para control de la prolactina/u otras hormonas al mes
de la cirugía. El
procedimiento no involucrará extracciones adicionales de
sangre más allá de las realizadas de rutina. En sangre se determinarán VEGF
por Radioinmunoensayo (RIA) o ELISA, y FGF-2 por ELISA.
De lo expuesto anteriormente se comprende que no hay riesgo posible para el
paciente, ya que se trabajará sobre el material obtenido en la cirugía, en lugar
de proceder a su descarte. Los sujetos están en libertad de abstenerse de
participar y son libres de retirar su consentimiento en cualquier momento del
estudio.
Métodos bioquímicos y moleculares específicos
La Metodología de RT-PCR, Western blot, RIA, ELISA e IHQ fue descripta por
nosotros en detalle en nuestros trabajos previos (Cristina et al. 2005; Gonzalez
Iglesias et al. 2000; Gonzalez Iglesias et al. 1999; Suarez et al. 2004; DiazTorga et al. 2002). Para la realización del presente proyecto se utilizarán
anticuerpos específicos para muestras humanas, y se diseñarán los primers
para PRC correspondientes a la secuencia de VEGF y nestin humanos. Las
muestras para inmunohistoquímica de hipófisis controles se obtendrán en
Labvision Co, o en Abcam (UK).
RECURSOS FINANCIEROS PARA EL PROYECTO
-Subsidio ANPCYT Jóvenes Investigadores PICT 2008 Nro 1326. Otorgado Dic
2009.
(Dra. Carolina Cristina Investigador responsable UNNOBA) Proyecto en
colaboración UNNOBA-IBYME CONICET.
- Subsidio de la Fundación Florencio Fiorini para Investigación en Cs.
Biomédicas 2010.
- Se presentó el proyecto a la Convocatoria Interna para Subsidios de
Investigación de UNNOBA 2010.
No existe relación alguna entre los investigadores y empresas farmacéuticas
privadas para el desarrollo del proyecto.
CONSIDERACIONES BIOÉTICAS
A) Este plan sigue los lineamientos del “MARCO ÉTICO DE REFERENCIA
PARA LAS INVESTIGACIONES BIOMÉDICAS”, publicado por el CONICET
(RESOLUCION D N° 1047/05), en todos sus puntos.
http://www.conicet.gov.ar/INSTITUCIONAL/sistema_de_evaluacion/documents/
comite_etica_resolucion_marco_para_bioetica_axo3.doc
Punto I Encuadra en investigación biomédica básica.
Cada sujeto da su consentimiento informado, tiene la libertad de abstenerse de
participar y es libre de retirar su consentimiento en cualquier momento
quedando fuera del estudio.
No hay riesgos predecibles para el paciente, y se respeta su privacidad.
El transporte y procesamiento de las muestras será financiado exclusivamente
a través de los subsidios ya asignados y a asignar al proyecto.
No existen relaciones entre los investigadores y las fuentes de financiación.
B) El presente proyecto cuenta con un subsidio asignado (PICT 2008 #1326)
en el cual se han evaluado aspectos éticos de la experimentación planteada
con muestras humanas con resultados satisfactorios.
C) Cabe destacar que el modelo de Consentimiento Informado que aquí se
presenta y la realización de un proyecto de investigación previo y
estrechamente relacionado al presente plan cuentan con la aprobación de los
Comités de Bioética del Hospital Santa Lucía y del Instituto de Biología y
Medicina Experimental – CONICET de la ciudad de Bs. As. El mencionado
proyecto ha sido aprobado también por el Comité de Docencia e Investigación
del Hospital Santa Lucía de la ciudad de Buenos Aires.
BIBLIOGRAFÍA
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