Animales de experimentación

INSTITUTO DE MEDICINA TRADICIONAL
IMET-ESSALUD IQUITOS
ESTUDIO PRE-CLINICO DEL
Muntingia calabura
Estudio Farmacológico
Q.F. Luis Nonato Ramírez
1.
ANTECEDENTES
Muntingia calabura L. es un árbol pequeño de 3 –12 mt (1), es un género
monotípico, pertenece a la familia ELAEOCARPACEAE, ampliamente
distribuído en América tropical. Presenta hojas oblongas, lanceoladas,
con base oblicua y semicordiforme, algo pubescente en la cara superior y
tomentosa con pelos estrellados en la cara del envés (2,3,4,5,7), crece entre
los 100 y 1300 m.s.n.m. (6).
La medicina tradicional utiliza sus flores como antiespasmódico (7),
calmante de nervios, resfríos, jaquecas y espasmos (8,9), la planta
macerada sin raíz en agua es usada en úlceras malignas y crónicas (10).
2. MATERIALES Y METODOS
2.1.
Equipos, Materiales y Reactivos:
Los equipos del laboratorio, los materiales y reactivos que se
emplearán en el estudio pre-clínico se detallan en las respectivas
metodologías a utilizarse en el estudio farmacológico.
2.2.
Métodos:
2.2.1
Estudio Farmacológico
2.2.1.1 Evaluación
de la inflamación intestinal mediante el
modelo crónico.
Fundamento: Evalúa el efecto inflamatorio en las células
epiteliales del intestino delgado.11
Materiales y reactivos:
Extracto liofilizado de Muntingia calabura.
Indometacina p.a.
Bicarbonato de sodio
Jeringas descartables de 1cc
Jeringas descartables de 5ml
Agujas descartables 26 x 5/8
Vaso de precipitado de 50 ml
Pipeta graduada de 1 ml
Pipeta graduada de 5 ml
Algodón
Gasa
Guantes descartables 7 ½
Mascarilla descartable
2
Animales de experimentación:
Ratas albinas machos y hembras
Procedimiento Experimental: Se seleccionan y agrupan al
azar ratas albinas machos y hembras. Para la evaluación de
la inflamación crónica se aplica inicialmente dos
inyecciones por vía sub cutánea de indometacina (7.5 mgkg1) con un intervalo de 24 horas, posteriormente se
administró por vía oral a cada grupo durante 4 días
solución salina al 0.9%, extracto acuoso liofilizado en las
dosis de 100 y 200 mgkg-1 e indometacina (10 mgkg-1).
Evaluar la presencia de nódulos, dilatación, adherencia e
hipertemia del intestino delgado, además presencia de
ulceras en la mucosa sobre el lado mesenterico.11
2.2.1.2 Evaluación del
efecto analgésico mediante el
método de contorsiones abdominales inducidas por
ácido acético
Fundamento: Evalúa las contorsiones provocadas por la
administración de ácido acético en el peritoneo del ratón.12
Materiales y reactivos:
Extracto liofilizado de hojas de Muntingia calabura.
Indometacina
Acido acético
Solución salina
Jeringas descartables x 1ml
Agujas descartables 26 x 5/8
Vaso de precipitado x 50 ml
Pipeta de 1 ml
Pipeta de 5 ml
Cronómetros digitales
Guantes descartable x 7 ½
Alcohol medicinal
Alcohol yodado
Lápiz marcadores.
Animales de experimentación:
Ratones albinos machos y hembras
Procedimiento experimental: Se agrupan al azar ratones
albinos previamente sometidos a ayuno de 12 h. en 4
grupos de 10 animales cada uno, luego se procede a la
administración por vía oral de indometacina (10 mgkg-1),
3
solución salina (0.9%) y extracto acuoso liofilizado (100, 200
mgkg-1). Transcurrido 30 minutos se inocula ácido acético
al 1% por vía intraperitoneal e inmediatamente se procede a
la cuantificación del número de contorsiones.12 Se utilizó el
test de Anova de una vía para calcular las significancias
estadísticas.
2.2.1.3 Evaluación de la Actividad y Performance motora
mediante el Test de Chimenea “ Chimney Test”
Fundamento: Evaluar la coordinación motora en función de
la actividad y performance motora de los animales. 13
Materiales y reactivos:
Diazepan
Extracto liofilizado de hojas de Muntingia calabura
Vaso de precipitado x 50mL
Pipeta de 1 mL
Pipeta de 5 mL
Cronómetros digitales
Guantes descartables 7 ½
Mascarillas descartables
Animales de experimentación:
Ratones albinos machos
Procedimiento experimental: Elegir al azar ratones albinos
machos y evaluar inicialmente en un tubo de vidrio de 25
cm de largo con un diámetro interno de 2.5 – 3cm.
Introducir al animal por un extremo del tubo y cuando éste
alcance el extremo opuesto, colocar el tubo en posición
vertical, registrar el tiempo que el animal requiere para
alcanzar el extremo opuesto del tubo. Los animales que no
cumplen con esta tarea se eliminan de la prueba, luego se
agrupan al azar en 4 grupos a los que se administra
solución salina 0.9%, diazepan (1 mgkg-1;i.p.) y extracto
liofilizado (100, 2000 mgkg-1), inmediatamente se evalúan
respecto a su coordinación y performance motora, el tiempo
de retroceso para cada caso y los animales que no
desempeñan esta tarea son considerados con perjuicio en su
coordinación motora. 13
2.2.1.4. Evaluación de la Actividad hipoglicemiante en ratones
albinos con hiperglicemia inducida por aloxano
4
Fundamento: Evaluar el efecto del extracto sobre la
hiperglicemia inducida en ratones albinos.14
Materiales y reactivos:
Extracto liofilizado de hojas de Muntingia calabura.
Aloxano
Glibenclamida USP
Micro capilares heparinizados x 100
Algodón
Reactivo de glucosa cinética x 500 det.
Cubetas espectrofotometricas
Vaso de precipitado
Pipeta graduadas de 1mL
Pipetas graduadas de 5mL
Guantes descartables 7 ½
Mascarillas descartables
Solución salina 0.1%
Jeringas descartables de 1ml
Jeringas descartables de 3 ml.
Tubos de ensayo.
Equipos:
Baño maría
Centrifuga
Espectrofotómetro
Animales de experimentación:
Ratones albinos y/o ratas albinos machos.
Procedimiento experimental: En ratones albinos machos
previamente sometidos a ayuno se determinan sus niveles
de glicemia basales, se procede entonces a la
administración por vía intraperitoneal de aloxano (150
mgkg-1), luego los animales se distribuyen al azar en 3
grupos:
Control negativo (solución salinas 0.9%),
glibenclamida (3 mgkg-1) y extracto liofilizado (50 mgkg-1).
Se determinan los niveles de glicemia a 1H, , 2H, 6H, 24H
y 96H de la administración de las soluciones en estudio.
Los valores de glicemia se expresan en mg/dL y los
resultados se evalúan mediante análisis estadísticos.14
2.2.1.5 Evaluación del efecto protector de la mucosa gástrica
mediante inducción de daño por ácido acético.
5
Fundamento: Evaluar el daño de la mucosa gástrica
mediante planimetría.15
Materiales y reactivos:
Extracto liofilizado de hojas de Muntingia calabura
Ketamina
Acido acético
Solución salina
Penicilina procainica
Dicloxacilina
Catgut crónico 3%
Sutura seda negra
Jeringa descartable de 1ml
Jeringa descartable 3 mL
Jeringa descartable 5 mL
Gasa
Algodón
Guante descartable 7 ½
Mascarilla descartable
Placa petri
Formol PA
Cámara fotográfica
Papel metálico
Microcapilares hepcrinizado x 100 Unid.
Equipos:
Equipo de microcirugía
Animales de experimentación:
Ratas albinas
Procedimiento experimental: Ratas albinas machos con
ayuno de 24 horas se someten a una laparotomia media,
luego se induce lesión sobre la serosa del estomago por
contacto con ácido acético. Posteriormente se procede a
suturar y luego a la recuperación post operatoria. Se
utilizan 4 grupos de estudio y se administra por vía oral
solución salina 0.9%, extracto liofilizado (5mgkg-1/1 día, 5
mgkg-1/7 días) y control positivo. La evaluación del de la
lesión se determina por planimetría utilizando fotografía
magnificada.15 Los resultados obtenidos se evalúan
mediante métodos estadísticos.
2.2.1.6.Evaluación de la actividad de tránsito intestinal.
6
Fundamento: Evaluar el tránsito intestinal de extractos de
plantas medicinales mediante la administración de
marcadores coloreados 16.
Materiales:
Extracto de planta medicinal
Jeringa descartable de 1cc
Jeringa descartable de 3cc
Vaso de precipitado de 50 mL
Pipeta graduada de 1mL
Pipeta graduada de 5 mL
Algodón
Gasa
Guantes descartables 7 ½
Mascarilla descartable
Tijeras quirúrgicas tipo iris
Pinzas quirúrgicas para punta roma y curva
Cronómetro digital
Placa Petri
Cinta métrica
Reactivos:
Atropina
Carbón activado
Carboximetil celulosa
Formol Q.P.
Alcohol Medicinal
Equipos:
Balanza analítica
Animales de experimentación:
Ratones albinos de ambos sexos
Procedimiento experimental: Ratones albinos hembras con
ayuno de 12 horas y agrupados al azar en 4 grupos se tratan
con el vehículo (solución salina 0.9%), Atropina (5 mgkg-1;
i.p.) y extracto liofilizado (100, 200 mgkg-1; p.o.).
Transcurridos 30 minutos del tratamiento se administra a
todos los animales carbón activado suspendido en
carboximetil celulosa, 45 minutos después los animales se
sacrifican, se remueve el estómago e intestino delgado y se
evalúa la distancia recorrida por el carbón activado que es
medida desde el piloro hasta la válvula ileocecal que
contiene por lo menos 1 cm continuo de carbón activado.
Se expresa la distancia recorrida en porcentaje con relación
7
a la longitud del intestino delgado. Los resultados se
evalúan mediante métodos estadísticos. 16
3. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
E
F
1
Actividad Inflamatoria intestinal crónica.
Actividad Analgésica
Actividad sobre el SNC (Performance motora)
Evaluación de la actividad de tránsito intestinal
Actividad Hipoglicemiante
Evaluación efecto Protector de mucosa gástrica.
Actividad antioxidante *.
x
x
x
X
2
x
x
X
x
x
M
1
2
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
1
X
X
X
2
x
x
x
*: Ejjecución opcional
4.
BIBLIOGRAFÍA
1. Ruiz MJ. 1993. Alimento del bosque Amazónico. Una alternativa para la
protección de los bosques tropicales. Montevideo, Uruguay. Oficina Regional de
Ciencia y Tecnología de la UNESCO. Perú- América Latina y del Caribe. Orcyt.
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Panamá. Panamá 46-47.
3. NAS. 1980. Muntingia calabura. Firewood crops. National Academy of
sciences. Washintong. DC. 58-59.
4. Schennee CL. 1984. Muntingia calabura. Plantas comunes de Venezuela.c
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5. Romero Castañeda. CR. 1991. Muntingia clabura. Frutos Silvestres de
Colombia. Santa Fé de Bogotá – Colombia.
6. Borga C, Lasso S. 1990. Muntingia calabura. Plantas Nativas para la
reforestación en Ecuador. Fundación Natura.Quito-Ecuador. 65-66.
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8. Perez-Arbelaoz E. 1978. Muntingia calabura. Plantas útiles de Colombia. Santa
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9. Duke JA; Wain KK. 1981. Medicinal Plant of the world comput indez winth
more than 8500 ewries.
10. Forero 1980. Ethnobotany of the cunc and waunana indigenous communities
Choco-Colombia. Cepedesia 9(33): 115-302.
11. Yamada, T.; Deitch, E.; Grisham, M.B. 1993. Mechanisms of acute and chronic
intestinal inflamation induce by indometacin inflamation. 17(6): 641-662.
8
12. Kuster, R; Anderson, 1959. Acetic acid for analgesic screening Fed. Proc, 18:
412,
13. Boissier, J.R.; Dremont, C; Robins, R & Pagny, 1961. J. Arch. Int.
Pharmacodin. Ther, 133: 29-32,
14. Venkateswarlo, V.; Kokate, C.K. and Pambhau, D. 1993. Antidiabetic activity of
roots of salacia macrosperma. Planta med. 59: 391 – 393.
15. Kobayashi, T.; Ohta, Y. 2001. Teprenone promotes the healing of acetic acid –
induced chronic grastric ulcers in rats by inhibiting neutrophil infiltration and
lipid peroxidation in ulcerated gastric tissues. Pharmacol Res. 43(1). 23-30.
16. Arbos, J.; Zegri, A.; López, F.R.J.; Argiles, J.M. 1993. A simple method for
determining the rate of gastro intestinal transitn the rat. Archiv. Int. Physiol.
Bioch.101: 113-115pp.
INSTITUTO DE MEDICINA TRADICIONAL
IMET-ESSALUD IQUITOS
ESTUDIO PRE-CLINICO DEL
Uncaria guianensis
Estudio Farmacológico
9
Q.F. Luis Nonato Ramírez
1.
ANTECEDENTES
Unacria guianensis (Aubl.) Gmel. “Uña de gato”, conocido también como
Cat´s claw, “Paraguayo”, “Garabato” , es una planta que pertenece a la
familia de las Rubiaceae.
En medicina tradicional es utilizada como antiinflamatorio,
antirrehumatico y contraceptivo, también se utiliza en el tratamiento de
úlceras gástricas y tumores (1). Es considerado como un remedio para el
cáncer del tracto urinario femenino y cirrosis. Los Boras lo usan para el
tratamiento de la gonorrea. En colombia es usado para casos de
disenteria(2,3).
La corteza de Uncaria guianensis contiene ácidos quinovicos
glicosidicos: quinovic acid 3 beta o-beta-D-quinovopyranoside and
quinovic acid 3 beta-o-beta-D-fucopyranosil(4).
2. MATERIALES Y METODOS
2.1.
Equipos, Materiales y Reactivos:
Los equipos del laboratorio, los materiales y reactivos que se
emplearán en el estudio pre-clínico se detallan en las respectivas
metodologías a utilizarse en el estudio farmacológico.
2.2.
Métodos:
2.2.1
Estudio Farmacológico
2.2.1.1 Evaluación
de la inflamación intestinal mediante el
modelo crónico.
10
Fundamento: Evalúa el efecto inflamatorio en las células
epiteliales del intestino delgado.5
Materiales y reactivos:
Extracto liofilizado de Uncaria guianensis.
Indometacina p.a.
Bicarbonato de sodio
Jeringas descartables de 1cc
Jeringas descartables de 5ml
Agujas descartables 26 x 5/8
Vaso de precipitado de 50 ml
Pipeta graduada de 1 ml
Pipeta graduada de 5 ml
Algodón
Gasa
Guantes descartables 7 ½
Mascarilla descartable
Animales de experimentación:
Ratas albinas machos y hembras
Procedimiento Experimental: Se seleccionan y agrupan al
azar ratas albinas machos y hembras. Para la evaluación de
la inflamación crónica se aplica inicialmente dos
inyecciones por vía sub cutánea de indometacina (7.5 mgkg1) con un intervalo de 24 horas, posteriormente se
administró por vía oral a cada grupo durante 4 días
solución salina al 0.9%, extracto acuoso liofilizado en las
dosis de 100 y 200 mgkg-1 e indometacina (10 mgkg-1).
Evaluar la presencia de nódulos, dilatación, adherencia e
hipertemia del intestino delgado, además presencia de
ulceras en la mucosa sobre el lado mesenterico.5
2.2.1.2 Evaluación del
efecto analgésico mediante el
método de contorsiones abdominales inducidas por
ácido acético
Fundamento: Evalúa las contorsiones provocadas por la
administración de ácido acético en el peritoneo del ratón.6
Materiales y reactivos:
Extracto liofilizado de Uncaria guianensis.
Indometacina
Acido acético
Solución salina
11
Jeringas descartables x 1ml
Agujas descartables 26 x 5/8
Vaso de precipitado x 50 ml
Pipeta de 1 ml
Pipeta de 5 ml
Cronómetros digitales
Guantes descartable x 7 ½
Alcohol medicinal
Alcohol yodado
Lápiz marcadores.
Animales de experimentación:
Ratones albinos machos y hembras
Procedimiento experimental: Se agrupan al azar ratones
albinos previamente sometidos a ayuno de 12 h. en 4
grupos de 10 animales cada uno, luego se procede a la
administración por vía oral de indometacina (10 mgkg-1),
solución salina (0.9%) y extracto acuoso liofilizado (100, 200
mgkg-1). Transcurrido 30 minutos se inocula ácido acético
al 1% por vía intraperitoneal e inmediatamente se procede a
la cuantificación del número de contorsiones.6 Se utilizó el
test de Anova de una vía para calcular las significancias
estadísticas.
2.2.1.3 Evaluación de la Actividad y Performance motora
mediante el Test de Chimenea “ Chimney Test”
Fundamento: Evaluar la coordinación motora en función de
la actividad y performance motora de los animales. 7
Materiales y reactivos:
Diazepan
Extracto liofilizado de Uncaria guianensis
Vaso de precipitado x 50mL
Pipeta de 1 mL
Pipeta de 5 mL
Cronómetros digitales
Guantes descartables 7 ½
Mascarillas descartables
Animales de experimentación:
Ratones albinos machos
12
Procedimiento experimental: Elegir al azar ratones albinos
machos y evaluar inicialmente en un tubo de vidrio de 25
cm de largo con un diámetro interno de 2.5 – 3cm.
Introducir al animal por un extremo del tubo y cuando éste
alcance el extremo opuesto, colocar el tubo en posición
vertical, registrar el tiempo que el animal requiere para
alcanzar el extremo opuesto del tubo. Los animales que no
cumplen con esta tarea se eliminan de la prueba, luego se
agrupan al azar en 4 grupos a los que se administra
solución salina 0.9%, diazepan (1 mgkg-1;i.p.) y extracto
liofilizado (100, 2000 mgkg-1), inmediatamente se evalúan
respecto a su coordinación y performance motora, el tiempo
de retroceso para cada caso y los animales que no
desempeñan esta tarea son considerados con perjuicio en su
coordinación motora. 7
2.2.1.4. Evaluación de la Actividad hipoglicemiante en ratones
albinos con hiperglicemia inducida por aloxano
Fundamento: Evaluar el efecto del extracto sobre la
hiperglicemia inducida en ratones albinos.8
Materiales y reactivos:
Extracto liofilizado de Uncaria guianensis.
Aloxano
Glibenclamida USP
Micro capilares heparinizados x 100
Algodón
Reactivo de glucosa cinética x 500 det.
Cubetas espectrofotometricas
Vaso de precipitado
Pipeta graduadas de 1mL
Pipetas graduadas de 5mL
Guantes descartables 7 ½
Mascarillas descartables
Solución salina 0.1%
Jeringas descartables de 1ml
Jeringas descartables de 3 ml.
Tubos de ensayo.
Equipos:
Baño maría
Centrifuga
Espectrofotómetro
Animales de experimentación:
13
Ratones albinos y/o ratas albinos machos.
Procedimiento experimental: En ratones albinos machos
previamente sometidos a ayuno se determinan sus niveles
de glicemia basales, se procede entonces a la
administración por vía intraperitoneal de aloxano (150
mgkg-1), luego los animales se distribuyen al azar en 3
grupos:
Control negativo (solución salinas 0.9%),
glibenclamida (3 mgkg-1) y extracto liofilizado (50 mgkg-1).
Se determinan los niveles de glicemia a 1H, , 2H, 6H, 24H
y 96H de la administración de las soluciones en estudio.
Los valores de glicemia se expresan en mg/dL y los
resultados se evalúan mediante análisis estadísticos.8
2.2.1.5 Evaluación del efecto protector de la mucosa gástrica
mediante inducción de daño por ácido acético.
Fundamento: Evaluar el daño de la mucosa gástrica
mediante planimetría.9
Materiales y reactivos:
Extracto liofilizado de Uncaria guianensis
Ketamina
Acido acético
Solución salina
Penicilina procainica
Dicloxacilina
Catgut crónico 3%
Sutura seda negra
Jeringa descartable de 1ml
Jeringa descartable 3 mL
Jeringa descartable 5 mL
Gasa
Algodón
Guante descartable 7 ½
Mascarilla descartable
Placa petri
Formol PA
Cámara fotográfica
Papel metálico
Microcapilares hepcrinizado x 100 Unid.
Equipos:
Equipo de microcirugía
14
Animales de experimentación:
Ratas albinas
Procedimiento experimental: Ratas albinas machos con
ayuno de 24 horas se someten a una laparotomia media,
luego se induce lesión sobre la serosa del estomago por
contacto con ácido acético. Posteriormente se procede a
suturar y luego a la recuperación post operatoria. Se
utilizan 4 grupos de estudio y se administra por vía oral
solución salina 0.9%, extracto liofilizado (5mgkg-1/1 día, 5
mgkg-1/7 días) y control positivo. La evaluación del de la
lesión se determina por planimetría utilizando fotografía
magnificada.9 Los resultados obtenidos se evalúan
mediante métodos estadísticos.
2.2.1.6.Evaluación de la actividad de tránsito intestinal.
Fundamento: Evaluar el tránsito intestinal de extractos de
plantas medicinales mediante la administración de
marcadores coloreados 10.
Materiales:
Extracto liofilizado de Uncaria guianensis.
Jeringa descartable de 1cc
Jeringa descartable de 3cc
Vaso de precipitado de 50 mL
Pipeta graduada de 1mL
Pipeta graduada de 5 mL
Algodón
Gasa
Guantes descartables 7 ½
Mascarilla descartable
Tijeras quirúrgicas tipo iris
Pinzas quirúrgicas para punta roma y curva
Cronómetro digital
Placa Petri
Cinta métrica
Reactivos:
Atropina
Carbón activado
Carboximetil celulosa
Formol Q.P.
Alcohol Medicinal
15
Equipos:
Balanza analítica
Animales de experimentación:
Ratones albinos de ambos sexos
Procedimiento experimental: Ratones albinos hembras con
ayuno de 12 horas y agrupados al azar en 4 grupos se tratan
con el vehículo (solución salina 0.9%), Atropina (5 mgkg-1;
i.p.) y extracto liofilizado (100, 200 mgkg-1; p.o.).
Transcurridos 30 minutos del tratamiento se administra a
todos los animales carbón activado suspendido en
carboximetil celulosa, 45 minutos después los animales se
sacrifican, se remueve el estómago e intestino delgado y se
evalúa la distancia recorrida por el carbón activado que es
medida desde el piloro hasta la válvula ileocecal que
contiene por lo menos 1 cm continuo de carbón activado.
Se expresa la distancia recorrida en porcentaje con relación
a la longitud del intestino delgado. Los resultados se
evalúan mediante métodos estadísticos. 10
3. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
Ab
1
Actividad Inflamatoria intestinal crónica.
Actividad Analgésica
Actividad sobre el SNC (Performance
motora)
Evaluación de la actividad de tránsito
intestinal
Actividad Hipoglicemiante
Evaluación efecto Protector de mucosa
gástrica.
Actividad antioxidante.
4.
X
X
x
x
X
1
Ju
2
1
2
X
X
X
X
X
x
X
X
X
X
x
x
x
x
x
X
x
X
x
X
X
Ma
2
BIBLIOGRAFÍA
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Fitoterapia 63: 417-440.
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Quimica. Pontificia Universidad Catolica del Perú. Lima. Phitochemistry 30:
1635-1637.
5. Yamada, T.; Deitch, E.; Grisham, M.B. 1993. Mechanisms of acute and chronic
intestinal inflamation induce by indometacin inflamation. 17(6): 641-662.
6. Kuster, R; Anderson, 1959. Acetic acid for analgesic screening Fed. Proc, 18:
412,
7. Boissier, J.R.; Dremont, C; Robins, R & Pagny, 1961. J. Arch. Int.
Pharmacodin. Ther, 133: 29-32,
8. Venkateswarlo, V.; Kokate, C.K. and Pambhau, D. 1993. Antidiabetic activity of
roots of salacia macrosperma. Planta med. 59: 391 – 393.
9. Kobayashi, T.; Ohta, Y. 2001. Teprenone promotes the healing of acetic acid –
induced chronic grastric ulcers in rats by inhibiting neutrophil infiltration and
lipid peroxidation in ulcerated gastric tissues. Pharmacol Res. 43(1). 23-30.
10. Arbos, J.; Zegri, A.; López, F.R.J.; Argiles, J.M. 1993. A simple method for
determining the rate of gastro intestinal transitn the rat. Archiv. Int. Physiol.
Bioch.101: 113-115pp.
INSTITUTO DE MEDICINA TRADICIONAL
IMET-ESSALUD IQUITOS
17
ESTUDIO PRE-CLINICO DEL
Copaifera reticulata
Estudio Farmacológico
Q.F. Luis Nonato Ramírez
1.
ANTECEDENTES
Copaiba paupera también llamado Bonshish matisiati y Namboman
tsacati (Shipibo-conibo); Bunix (Conibo); Capaúba; Copal, Copauva,
Cupiúba, Jatobamirim, Marimari, Matisihuati y Oleo-branco. Es una
especie vegetal que pertenece a la familia FABACEAE., con una altura de
20 a 30 m, de alto, con corteza rugosa, gris verdosa. Las hojas son
paripinnadas coriáceas, alternas, compuestas, las flores son blancas,
sésiles, olorosas, pequeñas, bisexuales, el fruto es una legumbre bivalva
dehiscente. Se encuentra en climas tropicales secos y húmedos con suelo
areno-arcilloso, logrando un desarrollo a plenitud con alta intensidad
luminica. En la Amazonía peruana se encuentra en los departamentos de
Ucayali, Madre de Dios y Loreto, en la Asmazonía brasileña se encuentra
en la zona de Acre.
La oleoresina parte aprovechada de la Copaifera contiene alrededor de
24 hidrocarburos sesquiterpenicos y varios diterpenos, ácidos resinios
18
como el elácico y copaíbico, aceites esenciales, trementina, ácido
copaifero, beta-cariofileno, E-Cubeno, u-Cubebeno, u-Humuleno y DCandieno y ácido resinólico (1).
2. MATERIALES Y METODOS
a. Equipos, Materiales y Reactivos:
Los equipos del laboratorio, los materiales y reactivos que se
emplearán en el estudio pre-clínico se detallan en las respectivas
metodologías a utilizarse en el estudio farmacológico.
b. Métodos:
2.2.1
Estudio Farmacológico
2.2.1.1 Evaluación
de la inflamación intestinal mediante el
modelo crónico.
Fundamento: Evalúa el efecto inflamatorio en las células
epiteliales del intestino delgado.2
Materiales y reactivos:
Extracto liofilizado de Copaifera reticulata.
Indometacina p.a.
Bicarbonato de sodio
Jeringas descartables de 1cc
Jeringas descartables de 5ml
Agujas descartables 26 x 5/8
Vaso de precipitado de 50 ml
Pipeta graduada de 1 ml
Pipeta graduada de 5 ml
Algodón
Gasa
Guantes descartables 7 ½
Mascarilla descartable
Animales de experimentación:
Ratas albinas machos y hembras
Procedimiento Experimental: Se seleccionan y agrupan al
azar ratas albinas machos y hembras. Para la evaluación de
la inflamación crónica se aplica inicialmente dos
inyecciones por vía sub cutánea de indometacina (7.5 mgkg1) con un intervalo de 24 horas, posteriormente se
19
administró por vía oral a cada grupo durante 4 días
solución salina al 0.9%, extracto acuoso liofilizado en las
dosis de 100 y 200 mgkg-1 e indometacina (10 mgkg-1).
Evaluar la presencia de nódulos, dilatación, adherencia e
hipertemia del intestino delgado, además presencia de
ulceras en la mucosa sobre el lado mesenterico.2
2.2.1.2 Evaluación del
efecto analgésico mediante el
método de contorsiones abdominales inducidas por
ácido acético
Fundamento: Evalúa las contorsiones provocadas por la
administración de ácido acético en el peritoneo del ratón.3
Materiales y reactivos:
Extracto liofilizado de Copaifera reticulata.
Indometacina
Acido acético
Solución salina
Jeringas descartables x 1ml
Agujas descartables 26 x 5/8
Vaso de precipitado x 50 ml
Pipeta de 1 ml
Pipeta de 5 ml
Cronómetros digitales
Guantes descartable x 7 ½
Alcohol medicinal
Alcohol yodado
Lápiz marcadores.
Animales de experimentación:
Ratones albinos machos y hembras
Procedimiento experimental: Se agrupan al azar ratones
albinos previamente sometidos a ayuno de 12 h. en 4
grupos de 10 animales cada uno, luego se procede a la
administración por vía oral de indometacina (10 mgkg-1),
solución salina (0.9%) y extracto acuoso liofilizado (100, 200
mgkg-1). Transcurrido 30 minutos se inocula ácido acético
al 1% por vía intraperitoneal e inmediatamente se procede a
la cuantificación del número de contorsiones.3 Se utilizó el
test de Anova de una vía para calcular las significancias
estadísticas.
20
2.2.1.3 Evaluación de la Actividad y Performance motora
mediante el Test de Chimenea “ Chimney Test”
Fundamento: Evaluar la coordinación motora en función de
la actividad y performance motora de los animales. 4
Materiales y reactivos:
Diazepan
Extracto liofilizado de Copaifera reticulata
Vaso de precipitado x 50mL
Pipeta de 1 mL
Pipeta de 5 mL
Cronómetros digitales
Guantes descartables 7 ½
Mascarillas descartables
Animales de experimentación:
Ratones albinos machos
Procedimiento experimental: Elegir al azar ratones albinos
machos y evaluar inicialmente en un tubo de vidrio de 25
cm de largo con un diámetro interno de 2.5 – 3cm.
Introducir al animal por un extremo del tubo y cuando éste
alcance el extremo opuesto, colocar el tubo en posición
vertical, registrar el tiempo que el animal requiere para
alcanzar el extremo opuesto del tubo. Los animales que no
cumplen con esta tarea se eliminan de la prueba, luego se
agrupan al azar en 4 grupos a los que se administra
solución salina 0.9%, diazepan (1 mgkg-1;i.p.) y extracto
liofilizado (100, 2000 mgkg-1), inmediatamente se evalúan
respecto a su coordinación y performance motora, el tiempo
de retroceso para cada caso y los animales que no
desempeñan esta tarea son considerados con perjuicio en su
coordinación motora. 4
2.2.1.4. Evaluación de la Actividad hipoglicemiante en ratones
albinos con hiperglicemia inducida por aloxano
Fundamento: Evaluar el efecto del extracto sobre la
hiperglicemia inducida en ratones albinos.5
Materiales y reactivos:
Extracto liofilizado de Copaifera reticulata.
21
Aloxano
Glibenclamida USP
Micro capilares heparinizados x 100
Algodón
Reactivo de glucosa cinética x 500 det.
Cubetas espectrofotometricas
Vaso de precipitado
Pipeta graduadas de 1mL
Pipetas graduadas de 5mL
Guantes descartables 7 ½
Mascarillas descartables
Solución salina 0.1%
Jeringas descartables de 1ml
Jeringas descartables de 3 ml.
Tubos de ensayo.
Equipos:
Baño maría
Centrifuga
Espectrofotómetro
Animales de experimentación:
Ratones albinos y/o ratas albinos machos.
Procedimiento experimental: En ratones albinos machos
previamente sometidos a ayuno se determinan sus niveles
de glicemia basales, se procede entonces a la
administración por vía intraperitoneal de aloxano (150
mgkg-1), luego los animales se distribuyen al azar en 3
grupos:
Control negativo (solución salinas 0.9%),
glibenclamida (3 mgkg-1) y extracto liofilizado (50 mgkg-1).
Se determinan los niveles de glicemia a 1H, , 2H, 6H, 24H
y 96H de la administración de las soluciones en estudio.
Los valores de glicemia se expresan en mg/dL y los
resultados se evalúan mediante análisis estadísticos.5
2.2.1.5 Evaluación del efecto protector de la mucosa gástrica
mediante inducción de daño por ácido acético.
Fundamento: Evaluar el daño de la mucosa gástrica
mediante planimetría.6
Materiales y reactivos:
Extracto liofilizado de Copaifera reticulata.
Ketamina
Acido acético
22
Solución salina
Penicilina procainica
Dicloxacilina
Catgut crónico 3%
Sutura seda negra
Jeringa descartable de 1ml
Jeringa descartable 3 mL
Jeringa descartable 5 mL
Gasa
Algodón
Guante descartable 7 ½
Mascarilla descartable
Placa petri
Formol PA
Cámara fotográfica
Papel metálico
Microcapilares hepcrinizado x 100 Unid.
Equipos:
Equipo de microcirugía
Animales de experimentación:
Ratas albinas
Procedimiento experimental: Ratas albinas machos con
ayuno de 24 horas se someten a una laparotomia media,
luego se induce lesión sobre la serosa del estomago por
contacto con ácido acético. Posteriormente se procede a
suturar y luego a la recuperación post operatoria. Se
utilizan 4 grupos de estudio y se administra por vía oral
solución salina 0.9%, extracto liofilizado (5mgkg-1/1 día, 5
mgkg-1/7 días) y control positivo. La evaluación del de la
lesión se determina por planimetría utilizando fotografía
magnificada.6 Los resultados obtenidos se evalúan
mediante métodos estadísticos.
2.2.1.6.Evaluación de la actividad de tránsito intestinal.
Fundamento: Evaluar el tránsito intestinal de extractos de
plantas medicinales mediante la administración de
marcadores coloreados 7.
Materiales:
Extracto liofilizado de Copaifera reticulata.
Jeringa descartable de 1cc
Jeringa descartable de 3cc
Vaso de precipitado de 50 mL
23
Pipeta graduada de 1mL
Pipeta graduada de 5 mL
Algodón
Gasa
Guantes descartables 7 ½
Mascarilla descartable
Tijeras quirúrgicas tipo iris
Pinzas quirúrgicas para punta roma y curva
Cronómetro digital
Placa Petri
Cinta métrica
Reactivos:
Atropina
Carbón activado
Carboximetil celulosa
Formol Q.P.
Alcohol Medicinal
Equipos:
Balanza analítica
Animales de experimentación:
Ratones albinos de ambos sexos
Procedimiento experimental: Ratones albinos hembras con
ayuno de 12 horas y agrupados al azar en 4 grupos se tratan
con el vehículo (solución salina 0.9%), Atropina (5 mgkg-1;
i.p.) y extracto liofilizado (100, 200 mgkg-1; p.o.).
Transcurridos 30 minutos del tratamiento se administra a
todos los animales carbón activado suspendido en
carboximetil celulosa, 45 minutos después los animales se
sacrifican, se remueve el estómago e intestino delgado y se
evalúa la distancia recorrida por el carbón activado que es
medida desde el piloro hasta la válvula ileocecal que
contiene por lo menos 1 cm continuo de carbón activado.
Se expresa la distancia recorrida en porcentaje con relación
a la longitud del intestino delgado. Los resultados se
evalúan mediante métodos estadísticos. 7
3. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
24
Jul
1
Actividad Inflamatoria intestinal crónica.
Actividad Analgésica
Actividad sobre el SNC (Performance
motora)
Evaluación de la actividad de tránsito
intestinal
Actividad Hipoglicemiante
Evaluación efecto Protector de mucosa
gástrica.
Actividad antioxidante *.
X
X
x
x
X
1
Set
2
1
2
x
x
X
x
X
x
x
x
X
X
x
x
x
x
x
x
X
X
x
X
X
Ag
2
* actividad opcional
4.
BIBLIOGRAFÍA
1. Pinedo M. 1997. Plantas Medicinales de la Amazonìa Peruana. Estudio de su
Uso y Cultivo. Instituto de Investigaciones de la Amazonìa Peruana. IIAP.
2. Yamada, T.; Deitch, E.; Grisham, M.B. 1993. Mechanisms of acute and chronic
intestinal inflamation induce by indometacin inflamation. 17(6): 641-662.
3. Kuster, R; Anderson, 1959. Acetic acid for analgesic screening Fed. Proc, 18:
412,
4. Boissier, J.R.; Dremont, C; Robins, R & Pagny, 1961. J. Arch. Int.
Pharmacodin. Ther, 133: 29-32,
5. Venkateswarlo, V.; Kokate, C.K. and Pambhau, D. 1993. Antidiabetic activity of
roots of salacia macrosperma. Planta med. 59: 391 – 393.
6. Kobayashi, T.; Ohta, Y. 2001. Teprenone promotes the healing of acetic acid –
induced chronic grastric ulcers in rats by inhibiting neutrophil infiltration and
lipid peroxidation in ulcerated gastric tissues. Pharmacol Res. 43(1). 23-30.
7. Arbos, J.; Zegri, A.; López, F.R.J.; Argiles, J.M. 1993. A simple method for
determining the rate of gastro intestinal transitn the rat. Archiv. Int. Physiol.
Bioch.101: 113-115pp.
INSTITUTO DE MEDICINA TRADICIONAL
IMET-ESSALUD IQUITOS
25
ESTUDIO PRE-CLINICO DEL
Mansoa alliacea (Lam. ) Gentry
Estudio Farmacológico
Q.F. Luis Nonato Ramírez
1.
ANTECEDENTES
Mansoa alliacea (Lam.) Gentry “Ajo sacha” conocido también como “Ajo
macho”, “Boens”, “Ajos del monte”, “be´o-ho”, “shansque boains” (v. Shipiboconibo), “frukutitei”, “posatalu”, “pusanga”, es un arbusto semi-trepador
de 3 m de altura o más que pertenece a la familia de las
BIGNONIÁCEAS. Todas sus partes vegetativas presentan olor a ajos o
cebollas, Su fruto es una cápsula linear oblonga lignificada, fuertemente
angulosa de superficie lisa y las semillas con alas membranosas de color
pardo y subhialinas en el borde.
26
Mansoa alliacea se encuentra distribuido en la Amazonía baja en estado
de liana silvestre y cultivado.
Estudios químicos reportan la presencia de Alil Disulfoxido, Alcaloides,
Allina, Allicina, DisulfuroPropilalilo, Estigmasterol, Flavonas, Pigmentos
flavonicos, Saponinas, Sulfuro de dialil, Sulfuro de dimetilo, Sulfuro de
divinilo, Naftaquinonas citotóxicas: 9-metoxi-a-lapachona y la 4-hidroxi
9-metoxi-a-lapachona.
La medicina tradicional reporta la maceración de corteza o de la raíz
como antirreumático y antiartrítico; las hojas en infusión
como
analgésico; corteza cocida en casos de epilepsia, tónico reconstituyente,
dolores de cabeza y fiebre (1,2,3,4,5,6).
2.MATERIALES Y METODOS
2.1.
Equipos, Materiales y Reactivos:
Los equipos del laboratorio, los materiales y reactivos que se
emplearán en el estudio pre-clínico se detallan en las respectivas
metodologías a utilizarse en el estudio farmacológico.
2.2.
Métodos:
2.2.1
Estudio Farmacológico
2.2.1.1 Evaluación
de la inflamación intestinal mediante el
modelo crónico.
Fundamento: Evalúa el efecto inflamatorio en las células
epiteliales del intestino delgado.7
Materiales y reactivos:
Extracto liofilizado de Mansoa alliacea.
Indometacina p.a.
Bicarbonato de sodio
Jeringas descartables de 1cc
Jeringas descartables de 5ml
Agujas descartables 26 x 5/8
Vaso de precipitado de 50 ml
Pipeta graduada de 1 ml
Pipeta graduada de 5 ml
Algodón
Gasa
Guantes descartables 7 ½
Mascarilla descartable
27
Animales de experimentación:
Ratas albinas machos y hembras
Procedimiento Experimental: Se seleccionan y agrupan al
azar ratas albinas machos y hembras. Para la evaluación de
la inflamación crónica se aplica inicialmente dos
inyecciones por vía sub cutánea de indometacina (7.5 mgkg1) con un intervalo de 24 horas, posteriormente se
administró por vía oral a cada grupo durante 4 días
solución salina al 0.9%, extracto acuoso liofilizado de
Mansoa alliacea a las dosis de 100 y 200 mgkg-1 e
indometacina (10 mgkg-1).
Evaluar la presencia de
nódulos, dilatación, adherencia e hipertemia del intestino
delgado, además presencia de ulceras en la mucosa sobre el
lado mesenterico.7
2.2.1.2 Evaluación del
efecto analgésico mediante el
método de contorsiones abdominales inducidas por
ácido acético
Fundamento: Evalúa las contorsiones provocadas por la
administración de ácido acético en el peritoneo del ratón.8
Materiales y reactivos:
Extracto liofilizado de hojas de Mansoa alliacea.
Indometacina
Acido acético
Solución salina
Jeringas descartables x 1ml
Agujas descartables 26 x 5/8
Vaso de precipitado x 50 ml
Pipeta de 1 ml
Pipeta de 5 ml
Cronómetros digitales
Guantes descartable x 7 ½
Alcohol medicinal
Alcohol yodado
Lápiz marcadores.
Animales de experimentación:
Ratones albinos machos y hembras
Procedimiento experimental: Se agrupan al azar ratones
albinos previamente sometidos a ayuno de 12 h. en 4
grupos de 10 animales cada uno, luego se procede a la
28
administración por vía oral de indometacina (10 mgkg-1),
solución salina (0.9%) y extracto acuoso liofilizado (100, 200
mgkg-1). Transcurrido 30 minutos se inocula ácido acético
al 1% por vía intraperitoneal e inmediatamente se procede a
la cuantificación del número de contorsiones.8 Se utilizó el
test de Anova de una vía para calcular las significancias
estadísticas.
2.2.1.3 Evaluación de la Actividad y Performance motora
mediante el Test de Chimenea “ Chimney Test”
Fundamento: Evaluar la coordinación motora en función de
la actividad y performance motora de los animales. 9
Materiales y reactivos:
Diazepan
Extracto liofilizado de hojas de Mansoa alliacea
Vaso de precipitado x 50mL
Pipeta de 1 mL
Pipeta de 5 mL
Cronómetros digitales
Guantes descartables 7 ½
Mascarillas descartables
Animales de experimentación:
Ratones albinos machos
Procedimiento experimental: Elegir al azar ratones albinos
machos y evaluar inicialmente en un tubo de vidrio de 25
cm de largo con un diámetro interno de 2.5 – 3cm.
Introducir al animal por un extremo del tubo y cuando éste
alcance el extremo opuesto, colocar el tubo en posición
vertical, registrar el tiempo que el animal requiere para
alcanzar el extremo opuesto del tubo. Los animales que no
cumplen con esta tarea se eliminan de la prueba, luego se
agrupan al azar en 4 grupos a los que se administra
solución salina 0.9%, diazepan (1 mgkg-1;i.p.) y extracto
liofilizado (100, 2000 mgkg-1), inmediatamente se evalúan
respecto a su coordinación y performance motora, el tiempo
de retroceso para cada caso y los animales que no
desempeñan esta tarea son considerados con perjuicio en su
coordinación motora. 9
29
2.2.1.4. Evaluación de la Actividad hipoglicemiante en ratones
albinos con hiperglicemia inducida por aloxano
Fundamento: Evaluar el efecto del extracto sobre la
hiperglicemia inducida en ratones albinos.10
Materiales y reactivos:
Extracto liofilizado de hojas de Mansoa alliacea.
Aloxano
Glibenclamida USP
Micro capilares heparinizados x 100
Algodón
Reactivo de glucosa cinética x 500 det.
Cubetas espectrofotometricas
Vaso de precipitado
Pipeta graduadas de 1mL
Pipetas graduadas de 5mL
Guantes descartables 7 ½
Mascarillas descartables
Solución salina 0.1%
Jeringas descartables de 1ml
Jeringas descartables de 3 ml.
Tubos de ensayo.
Equipos:
Baño maría
Centrifuga
Espectrofotómetro
Animales de experimentación:
Ratones albinos y/o ratas albinos machos.
Procedimiento experimental: En ratones albinos machos
previamente sometidos a ayuno se determinan sus niveles
de glicemia basales, se procede entonces a la
administración por vía intraperitoneal de aloxano (150
mgkg-1), luego los animales se distribuyen al azar en 3
grupos:
Control negativo (solución salinas 0.9%),
glibenclamida (3 mgkg-1) y extracto liofilizado (50 mgkg-1).
Se determinan los niveles de glicemia a 1H, , 2H, 6H, 24H
y 96H de la administración de las soluciones en estudio.
Los valores de glicemia se expresan en mg/dL y los
resultados se evalúan mediante análisis estadísticos.10
2.2.1.5 Evaluación del efecto protector de la mucosa gástrica
mediante inducción de daño por ácido acético.
30
Fundamento: Evaluar el daño de la mucosa gástrica
mediante planimetría.11
Materiales y reactivos:
Extracto liofilizado de hojas de Mansoa alliacea.
Ketamina
Acido acético
Solución salina
Penicilina procainica
Dicloxacilina
Catgut crónico 3%
Sutura seda negra
Jeringa descartable de 1ml
Jeringa descartable 3 mL
Jeringa descartable 5 mL
Gasa
Algodón
Guante descartable 7 ½
Mascarilla descartable
Placa petri
Formol PA
Cámara fotográfica
Papel metálico
Microcapilares hepcrinizado x 100 Unid.
Equipos:
Equipo de microcirugía
Animales de experimentación:
Ratas albinas
Procedimiento experimental: Ratas albinas machos con
ayuno de 24 horas se someten a una laparotomia media,
luego se induce lesión sobre la serosa del estomago por
contacto con ácido acético. Posteriormente se procede a
suturar y luego a la recuperación post operatoria. Se
utilizan 4 grupos de estudio y se administra por vía oral
solución salina 0.9%, extracto liofilizado (5mgkg-1/1 día, 5
mgkg-1/7 días) y control positivo. La evaluación del de la
lesión se determina por planimetría utilizando fotografía
magnificada.11 Los resultados obtenidos se evalúan
mediante métodos estadísticos.
2.2.1.6.Evaluación de la actividad de tránsito intestinal.
31
Fundamento: Evaluar el tránsito intestinal de extractos de
plantas medicinales mediante la administración de
marcadores coloreados 12.
Materiales:
Extracto liofilizado de Mansoa alliacea.
Jeringa descartable de 1cc
Jeringa descartable de 3cc
Vaso de precipitado de 50 mL
Pipeta graduada de 1mL
Pipeta graduada de 5 mL
Algodón
Gasa
Guantes descartables 7 ½
Mascarilla descartable
Tijeras quirúrgicas tipo iris
Pinzas quirúrgicas para punta roma y curva
Cronómetro digital
Placa Petri
Cinta métrica
Reactivos:
Atropina
Carbón activado
Carboximetil celulosa
Formol Q.P.
Alcohol Medicinal
Equipos:
Balanza analítica
Animales de experimentación:
Ratones albinos de ambos sexos
Procedimiento experimental: Ratones albinos hembras con
ayuno de 12 horas y agrupados al azar en 4 grupos se tratan
con el vehículo (solución salina 0.9%), Atropina (5 mgkg-1;
i.p.) y extracto liofilizado (100, 200 mgkg-1; p.o.).
Transcurridos 30 minutos del tratamiento se administra a
todos los animales carbón activado suspendido en
carboximetil celulosa, 45 minutos después los animales se
sacrifican, se remueve el estómago e intestino delgado y se
evalúa la distancia recorrida por el carbón activado que es
medida desde el piloro hasta la válvula ileocecal que
contiene por lo menos 1 cm continuo de carbón activado.
Se expresa la distancia recorrida en porcentaje con relación
32
a la longitud del intestino delgado. Los resultados se
evalúan mediante métodos estadísticos. 12
3. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
JUN
1
Actividad Inflamatoria intestinal crónica.
Actividad Analgésica
Actividad sobre el SNC (Performance motora)
Evaluación de la actividad de tránsito intestinal
Actividad Hipoglicemiante
Evaluación efecto Protector de mucosa gástrica.
Actividad antioxidante *.
x
x
x
X
JUL
2
x
x
X
x
x
1
AGOST
1
2
2
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
*: Ejjecución opcional
4.
BIBLIOGRAFÍA
1. Karston, R. 1964. Studies in the Religión of the South-American Indians East of
the Andes. Helsinki: Societes Scientiarum Fennica. Commentationes
Humanarum Litterarum XXIX.1.
2. Luna LE. Vegetalismo: Shamanism among the Meztizon Population of the
Peruvian Amazon. Almquist & Wiksell International. Stockholm. Swedwn.
3. www.spiritpathperu.com/sellplants.html
4. www.maya-ethnobotanicals.com/product info.phtm1/herbid 120/category.
5. www.rainforestconservation.org/data sheets
6. Brack A. 1999. Diccionario Enciclopedico de Plantas Utiles del Perú. Centro de
Estudios Regionales Andinos Bartolomé de las Casas. Programa de las Naciones
Unidas para el Desarrollo. 15-302.
7. Yamada, T.; Deitch, E.; Grisham, M.B. 1993. Mechanisms of acute and chronic
intestinal inflamation induce by indometacin inflamation. 17(6): 641-662.
8. Kuster, R; Anderson, 1959. Acetic acid for analgesic screening Fed. Proc, 18:
412,
9. Boissier, J.R.; Dremont, C; Robins, R & Pagny, 1961. J. Arch. Int.
Pharmacodin. Ther, 133: 29-32,
10. Venkateswarlo, V.; Kokate, C.K. and Pambhau, D. 1993. Antidiabetic activity of
roots of salacia macrosperma. Planta med. 59: 391 – 393.
11 .Kobayashi, T.; Ohta, Y. 2001. Teprenone promotes the healing of acetic acid –
induced chronic grastric ulcers in rats by inhibiting neutrophil infiltration and
lipid peroxidation in ulcerated gastric tissues. Pharmacol Res. 43(1). 23-30.
33
12.Arbos, J.; Zegri, A.; López, F.R.J.; Argiles, J.M. 1993. A simple method for
determining the rate of gastro intestinal transitn the rat. Archiv. Int. Physiol.
Bioch.101: 113-115pp.
INSTITUTO DE MEDICINA TRADICIONAL
IMET-ESSALUD IQUITOS
ESTUDIO PRE-CLINICO DEL
Solanum sessiliflorum Dunal
Estudio Farmacológico
Q.F. Luis Nonato Ramírez
34
1.
ANTECEDENTES
Solanum sessiliflorum Dunal “Cocona” conocido también como “Topiro”,
“roolla´he (v. Bora)”, “coconilla”, “daboca (v. Waorani)”, “kochari, kukuna (v.
Secoya)”, “luló popó (v. Amahuaca, piro-yine, shipibo-conibo)”, “popoi (v. Eseeja)”, es una planta arbustiva andromonoica que pertenece a la familia de
las SOLANACEAS, mide de 0.5 a 2 m de altura con tallos semi-leñosos
cilíndricos y muy pubescentes, las hojas son simples, alternas y con
estípulas de 30 a 50 cm de largo y 20 a 30 cm de ancho. Los frutos son en
forma de bayas de forma variable de subglobosas a ovoides y tamaños de
3 a 6 cm de largo y 3 a 12 cm de diámetro con peso promedio que varía
de 24g a 250 g . El epicarpo es una delgada capa lisa, suave y cubierta
según variedad por pubescencia fina, puberulenta que presenta
coloraciones diferentes a la madurez según variedad de amarillos,
anaranjados o rojos; el mesocarpo es una pulpa de grosor variable,
suculento, carnoso y de color blanco cremoso a amarillento. Las semillas
son numerosas, planas y redondas de 2.5 a 3 mm, envueltos en un
mucílago transparente de sabor ácido y aroma agradable.
Solanum sessiliflorum se encuentra distribuido en la alta y baja amazonía
hasta los 1500 m.s.n.m.. Su origen parece ser el piedemonte andino de Colombia,
Ecuador y Perú.
La medicina tradicional reporta que el jugo de los frutos de cocona es
usado en el tratamiento de Diabetes; el jugo de hojas y las hojas
machacadas como antiofídico, además es usado como escabicida,
problemas hipertensivos y tratamientos de quemaduras.
2. MATERIALES Y METODOS
2.1
Equipos, Materiales y Reactivos:
Los equipos del laboratorio, los materiales y reactivos que se
emplearán en el estudio pre-clínico se detallan en las respectivas
metodologías a utilizarse en el estudio farmacológico.
2.2.
Métodos:
2.2.1
Estudio Farmacológico
2.2.1.1 Evaluación
de la inflamación intestinal mediante el
modelo crónico.
35
Fundamento: Evalúa el efecto inflamatorio en las células
epiteliales del intestino delgado.2
Materiales y reactivos:
Fruto liofilizado de Solanum sessiliflorum.
Indometacina p.a.
Bicarbonato de sodio
Jeringas descartables de 1cc
Jeringas descartables de 5ml
Agujas descartables 26 x 5/8
Vaso de precipitado de 50 ml
Pipeta graduada de 1 ml
Pipeta graduada de 5 ml
Algodón
Gasa
Guantes descartables 7 ½
Mascarilla descartable
Animales de experimentación:
Ratas albinas machos y hembras
Procedimiento Experimental: Se seleccionan y agrupan al
azar ratas albinas machos y hembras. Para la evaluación de
la inflamación crónica se aplica inicialmente dos
inyecciones por vía sub cutánea de indometacina (7.5 mgkg1) con un intervalo de 24 horas, posteriormente se
administró por vía oral a cada grupo durante 4 días
solución salina al 0.9%, fruto liofilizado de Solanum
sessiliflorum a las dosis de 100 y 200 mgkg-1 e indometacina
(10 mgkg-1). Evaluar la presencia de nódulos, dilatación,
adherencia e hipertemia del intestino delgado, además
presencia de ulceras en la mucosa sobre el lado
mesenterico.2
2.2.1.2 Evaluación del
efecto analgésico mediante el
método de contorsiones abdominales inducidas por
ácido acético
Fundamento: Evalúa las contorsiones provocadas por la
administración de ácido acético en el peritoneo del ratón.3
Materiales y reactivos:
Fruto liofilizado de Solanum sessiliflorum.
Indometacina
Acido acético
36
Solución salina
Jeringas descartables x 1ml
Agujas descartables 26 x 5/8
Vaso de precipitado x 50 ml
Pipeta de 1 ml
Pipeta de 5 ml
Cronómetros digitales
Guantes descartable x 7 ½
Alcohol medicinal
Alcohol yodado
Lápiz marcadores.
Animales de experimentación:
Ratones albinos machos y hembras
Procedimiento experimental: Se agrupan al azar ratones
albinos previamente sometidos a ayuno de 12 h. en 4
grupos de 10 animales cada uno, luego se procede a la
administración por vía oral de indometacina (10 mgkg-1),
solución salina (0.9%) y fruto liofilizado (100, 200 mgkg-1).
Transcurrido 30 minutos se inocula ácido acético al 1% por
vía intraperitoneal e inmediatamente se procede a la
cuantificación del número de contorsiones.3 Se utilizó el test
de Anova de una vía para calcular las significancias
estadísticas.
2.2.1.3 Evaluación de la Actividad y Performance motora
mediante el Test de Chimenea “ Chimney Test”
Fundamento: Evaluar la coordinación motora en función de
la actividad y performance motora de los animales. 4
Materiales y reactivos:
Diazepan
Fruto liofilizado de Solanum sessiliflorum
Vaso de precipitado x 50mL
Pipeta de 1 mL
Pipeta de 5 mL
Cronómetros digitales
Guantes descartables 7 ½
Mascarillas descartables
Animales de experimentación:
Ratones albinos machos
37
Procedimiento experimental: Elegir al azar ratones albinos
machos y evaluar inicialmente en un tubo de vidrio de 25
cm de largo con un diámetro interno de 2.5 – 3cm.
Introducir al animal por un extremo del tubo y cuando éste
alcance el extremo opuesto, colocar el tubo en posición
vertical, registrar el tiempo que el animal requiere para
alcanzar el extremo opuesto del tubo. Los animales que no
cumplen con esta tarea se eliminan de la prueba, luego se
agrupan al azar en 4 grupos a los que se administra
solución salina 0.9%, diazepan (1 mgkg-1;i.p.) y extracto
liofilizado (100, 2000 mgkg-1), inmediatamente se evalúan
respecto a su coordinación y performance motora, el tiempo
de retroceso para cada caso y los animales que no
desempeñan esta tarea son considerados con perjuicio en su
coordinación motora. 4
2.2.1.4. Evaluación de la Actividad hipoglicemiante en ratones
albinos con hiperglicemia inducida por aloxano
Fundamento: Evaluar el efecto del extracto sobre la
hiperglicemia inducida en ratones albinos.5
Materiales y reactivos:
Fruto liofilizado de Solanum sessiliflorum.
Aloxano
Glibenclamida USP
Micro capilares heparinizados x 100
Algodón
Reactivo de glucosa cinética x 500 det.
Cubetas espectrofotometricas
Vaso de precipitado
Pipeta graduadas de 1mL
Pipetas graduadas de 5mL
Guantes descartables 7 ½
Mascarillas descartables
Solución salina 0.1%
Jeringas descartables de 1ml
Jeringas descartables de 3 ml.
Tubos de ensayo.
Equipos:
Baño maría
Centrifuga
Espectrofotómetro
38
Animales de experimentación:
Ratones albinos y/o ratas albinos machos.
Procedimiento experimental: En ratones albinos machos
previamente sometidos a ayuno se determinan sus niveles
de glicemia basales, se procede entonces a la
administración por vía intraperitoneal de aloxano (150
mgkg-1), luego los animales se distribuyen al azar en 3
grupos:
Control negativo (solución salinas 0.9%),
glibenclamida (3 mgkg-1) y fruto liofilizado (50 mgkg-1). Se
determinan los niveles de glicemia a 1H, , 2H, 6H, 24H y
96H de la administración de las soluciones en estudio. Los
valores de glicemia se expresan en mg/dL y los resultados
se evalúan mediante análisis estadísticos.5
2.2.1.5 Evaluación del efecto protector de la mucosa gástrica
mediante inducción de daño por ácido acético.
Fundamento: Evaluar el daño de la mucosa gástrica
mediante planimetría.6
Materiales y reactivos:
Fruto liofilizado de Solanum sessiliflorum.
Ketamina
Acido acético
Solución salina
Penicilina procainica
Dicloxacilina
Catgut crónico 3%
Sutura seda negra
Jeringa descartable de 1ml
Jeringa descartable 3 mL
Jeringa descartable 5 mL
Gasa
Algodón
Guante descartable 7 ½
Mascarilla descartable
Placa petri
Formol PA
Cámara fotográfica
Papel metálico
Microcapilares hepcrinizado x 100 Unid.
Equipos:
Equipo de microcirugía
39
Animales de experimentación:
Ratas albinas
Procedimiento experimental: Ratas albinas machos con
ayuno de 24 horas se someten a una laparotomia media,
luego se induce lesión sobre la serosa del estomago por
contacto con ácido acético. Posteriormente se procede a
suturar y luego a la recuperación post operatoria. Se
utilizan 4 grupos de estudio y se administra por vía oral
solución salina 0.9%, fruto liofilizado (5mgkg-1/1 día, 5
mgkg-1/7 días) y control positivo. La evaluación del de la
lesión se determina por planimetría utilizando fotografía
magnificada.6 Los resultados obtenidos se evalúan
mediante métodos estadísticos.
2.2.1.6.Evaluación de la actividad de tránsito intestinal.
Fundamento: Evaluar el tránsito intestinal de extractos de
plantas medicinales mediante la administración de
marcadores coloreados 7.
Materiales:
Fruto liofilizado de Solanum sessiliflorum.
Jeringa descartable de 1cc
Jeringa descartable de 3cc
Vaso de precipitado de 50 mL
Pipeta graduada de 1mL
Pipeta graduada de 5 mL
Algodón
Gasa
Guantes descartables 7 ½
Mascarilla descartable
Tijeras quirúrgicas tipo iris
Pinzas quirúrgicas para punta roma y curva
Cronómetro digital
Placa Petri
Cinta métrica
Reactivos:
Atropina
Carbón activado
Carboximetil celulosa
Formol Q.P.
Alcohol Medicinal
40
Equipos:
Balanza analítica
Animales de experimentación:
Ratones albinos de ambos sexos
Procedimiento experimental: Ratones albinos hembras con
ayuno de 12 horas y agrupados al azar en 4 grupos se tratan
con el vehículo (solución salina 0.9%), Atropina (5 mgkg-1;
i.p.) y fruto liofilizado (100, 200 mgkg-1; p.o.).
Transcurridos 30 minutos del tratamiento se administra a
todos los animales carbón activado suspendido en
carboximetil celulosa, 45 minutos después los animales se
sacrifican, se remueve el estómago e intestino delgado y se
evalúa la distancia recorrida por el carbón activado que es
medida desde el piloro hasta la válvula ileocecal que
contiene por lo menos 1 cm continuo de carbón activado.
Se expresa la distancia recorrida en porcentaje con relación
a la longitud del intestino delgado. Los resultados se
evalúan mediante métodos estadísticos. 7
3. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
Actividad Inflamatoria intestinal crónica.
Actividad Analgésica
Actividad sobre el SNC (Performance motora)
Evaluación de la actividad de tránsito intestinal
Actividad Hipoglicemiante
Evaluación efecto Protector de mucosa gástrica.
Actividad antioxidante *.
AGOST
1
2
x
x
x
x
X
x
X
x
x
SET
1
OCT
2
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
1
X
X
X
2
X
X
X
*: Ejjecución opcional
4. BIBLIOGRAFÍA
1.
Brack A. 1999. Diccionario Enciclopedico de Plantas Utiles del Perú. Centro de
Estudios Regionales Andinos Bartolomé de las Casas. Programa de las Naciones
Unidas para el Desarrollo. 15-302.
2. Yamada, T.; Deitch, E.; Grisham, M.B. 1993. Mechanisms of acute and chronic
intestinal inflamation induce by indometacin inflamation. 17(6): 641-662.
3. Kuster, R; Anderson, 1959. Acetic acid for analgesic screening Fed. Proc, 18: 412,
4. Boissier, J.R.; Dremont, C; Robins, R & Pagny, 1961. J. Arch. Int. Pharmacodin.
Ther, 133: 29-32,
41
5. Venkateswarlo, V.; Kokate, C.K. and Pambhau, D. 1993. Antidiabetic activity of
roots of salacia macrosperma. Planta med. 59: 391 – 393.
6. Kobayashi, T.; Ohta, Y. 2001. Teprenone promotes the healing of acetic acid –
induced chronic grastric ulcers in rats by inhibiting neutrophil infiltration and
lipid peroxidation in ulcerated gastric tissues. Pharmacol Res. 43(1). 23-30.
7. Arbos, J.; Zegri, A.; López, F.R.J.; Argiles, J.M. 1993. A simple method for
determining the rate of gastro intestinal transitn the rat. Archiv. Int. Physiol.
Bioch.101: 113-115pp.
INSTITUTO DE MEDICINA TRADICIONAL
IMET-ESSALUD IQUITOS
ESTUDIO PRE-CLINICO DEL
Cariniana decandra Ducke
Estudio Farmacológico
Q.F. Luis Nonato Ramírez
42
1.
ANTECEDENTES
Cariniana decandra Ducke “Papelillo caspi” conocido también como
“Tahuarí”, “Cachimbo”, “Cachimbo blanco”, “Cachimbo caspi”, “Machimango
colorado”, es una planta arbórea silvestre que pertenece a la familia de las
LECITIDACEAE, mide hasta 40 m de altura, mientras que el tronco
alcanza hasta los 80 cm de diámetro (1,2,3,4).
Cariniana decandra se encuentra distribuido en la Amazonía baja, es utilizado
su madera por su excelente calidad en la construcción de paredes divisorias.
La medicina tradicional reporta que la corteza es empleado como
sustituto de la corteza del Tahuarí para el tratamiento del cáncer (5).
2. MATERIALES Y METODOS
2.1.
Equipos, Materiales y Reactivos:
Los equipos del laboratorio, los materiales y reactivos que se
emplearán en el estudio pre-clínico se detallan en las respectivas
metodologías a utilizarse en el estudio farmacológico.
2.2.
Métodos:
2.2.1
Estudio Farmacológico
2.2.1.1 Evaluación
de la inflamación intestinal mediante el
modelo crónico.
Fundamento: Evalúa el efecto inflamatorio en las células
epiteliales del intestino delgado.6
43
Materiales y reactivos:
Corteza liofilizada de Cariniana decandra
Indometacina p.a.
Bicarbonato de sodio
Jeringas descartables de 1cc
Jeringas descartables de 5ml
Agujas descartables 26 x 5/8
Vaso de precipitado de 50 ml
Pipeta graduada de 1 ml
Pipeta graduada de 5 ml
Algodón
Gasa
Guantes descartables 7 ½
Mascarilla descartable
Animales de experimentación:
Ratas albinas machos y hembras
Procedimiento Experimental: Se seleccionan y agrupan al
azar ratas albinas machos y hembras. Para la evaluación de
la inflamación crónica se aplica inicialmente dos
inyecciones por vía sub cutánea de indometacina (7.5 mgkg1) con un intervalo de 24 horas, posteriormente se
administró por vía oral a cada grupo durante 4 días
solución salina al 0.9%, corteza liofilizada de Cariniana
decandra a las dosis de 100 y 200 mgkg-1 e indometacina (10
mgkg-1).
Evaluar la presencia de nódulos, dilatación,
adherencia e hipertemia del intestino delgado, además
presencia de ulceras en la mucosa sobre el lado
mesenterico.6
2.2.1.2 Evaluación del
efecto analgésico mediante el
método de contorsiones abdominales inducidas por
ácido acético
Fundamento: Evalúa las contorsiones provocadas por la
administración de ácido acético en el peritoneo del ratón.7
Materiales y reactivos:
Corteza liofilizada de Cariniana decandra.
Indometacina
Acido acético
Solución salina
Jeringas descartables x 1ml
44
Agujas descartables 26 x 5/8
Vaso de precipitado x 50 ml
Pipeta de 1 ml
Pipeta de 5 ml
Cronómetros digitales
Guantes descartable x 7 ½
Alcohol medicinal
Alcohol yodado
Lápiz marcadores.
Animales de experimentación:
Ratones albinos machos y hembras
Procedimiento experimental: Se agrupan al azar ratones
albinos previamente sometidos a ayuno de 12 h. en 4
grupos de 10 animales cada uno, luego se procede a la
administración por vía oral de indometacina (10 mgkg-1),
solución salina (0.9%) y corteza liofilizada (100, 200 mgkg-1).
Transcurrido 30 minutos se inocula ácido acético al 1% por
vía intraperitoneal e inmediatamente se procede a la
cuantificación del número de contorsiones.7 Se utilizó el test
de Anova de una vía para calcular las significancias
estadísticas.
2.2.1.3 Evaluación de la Actividad y Performance motora
mediante el Test de Chimenea “ Chimney Test”
Fundamento: Evaluar la coordinación motora en función de
la actividad y performance motora de los animales. 8
Materiales y reactivos:
Diazepan
Corteza liofilizada de Cariniana decandra
Vaso de precipitado x 50mL
Pipeta de 1 mL
Pipeta de 5 mL
Cronómetros digitales
Guantes descartables 7 ½
Mascarillas descartables
Animales de experimentación:
Ratones albinos machos
Procedimiento experimental: Elegir al azar ratones albinos
machos y evaluar inicialmente en un tubo de vidrio de 25
cm de largo con un diámetro interno de 2.5 – 3cm.
45
Introducir al animal por un extremo del tubo y cuando éste
alcance el extremo opuesto, colocar el tubo en posición
vertical, registrar el tiempo que el animal requiere para
alcanzar el extremo opuesto del tubo. Los animales que no
cumplen con esta tarea se eliminan de la prueba, luego se
agrupan al azar en 4 grupos a los que se administra
solución salina 0.9%, diazepan (1 mgkg-1;i.p.) y extracto
liofilizado (100, 2000 mgkg-1), inmediatamente se evalúan
respecto a su coordinación y performance motora, el tiempo
de retroceso para cada caso y los animales que no
desempeñan esta tarea son considerados con perjuicio en su
coordinación motora. 8
2.2.1.4. Evaluación de la Actividad hipoglicemiante en ratones
albinos con hiperglicemia inducida por aloxano
Fundamento: Evaluar el efecto del extracto sobre la
hiperglicemia inducida en ratones albinos.9
Materiales y reactivos:
Corteza liofilizada de Cariniana decandra.
Aloxano
Glibenclamida USP
Micro capilares heparinizados x 100
Algodón
Reactivo de glucosa cinética x 500 det.
Cubetas espectrofotometricas
Vaso de precipitado
Pipeta graduadas de 1mL
Pipetas graduadas de 5mL
Guantes descartables 7 ½
Mascarillas descartables
Solución salina 0.1%
Jeringas descartables de 1ml
Jeringas descartables de 3 ml.
Tubos de ensayo.
Equipos:
Baño maría
Centrifuga
Espectrofotómetro
Animales de experimentación:
Ratones albinos y/o ratas albinos machos.
46
Procedimiento experimental: En ratones albinos machos
previamente sometidos a ayuno se determinan sus niveles
de glicemia basales, se procede entonces a la
administración por vía intraperitoneal de aloxano (150
mgkg-1), luego los animales se distribuyen al azar en 3
grupos:
Control negativo (solución salinas 0.9%),
glibenclamida (3 mgkg-1) y extracto liofilizado (50 mgkg-1).
Se determinan los niveles de glicemia a 1H, , 2H, 6H, 24H
y 96H de la administración de las soluciones en estudio.
Los valores de glicemia se expresan en mg/dL y los
resultados se evalúan mediante análisis estadísticos.9
2.2.1.5 Evaluación del efecto protector de la mucosa gástrica
mediante inducción de daño por ácido acético.
Fundamento: Evaluar el daño de la mucosa gástrica
mediante planimetría.10
Materiales y reactivos:
Corteza liofilizada de Cariniana decandra.
Ketamina
Acido acético
Solución salina
Penicilina procainica
Dicloxacilina
Catgut crónico 3%
Sutura seda negra
Jeringa descartable de 1ml
Jeringa descartable 3 mL
Jeringa descartable 5 mL
Gasa
Algodón
Guante descartable 7 ½
Mascarilla descartable
Placa petri
Formol PA
Cámara fotográfica
Papel metálico
Microcapilares hepcrinizado x 100 Unid.
Equipos:
Equipo de microcirugía
Animales de experimentación:
Ratas albinas
47
Procedimiento experimental: Ratas albinas machos con
ayuno de 24 horas se someten a una laparotomia media,
luego se induce lesión sobre la serosa del estomago por
contacto con ácido acético. Posteriormente se procede a
suturar y luego a la recuperación post operatoria. Se
utilizan 4 grupos de estudio y se administra por vía oral
solución salina 0.9%, extracto liofilizado (5mgkg-1/1 día, 5
mgkg-1/7 días) y control positivo. La evaluación del de la
lesión se determina por planimetría utilizando fotografía
magnificada.10 Los resultados obtenidos se evalúan
mediante métodos estadísticos.
2.2.1.6.Evaluación de la actividad de tránsito intestinal.
Fundamento: Evaluar el tránsito intestinal de extractos de
plantas medicinales mediante la administración de
marcadores coloreados 11.
Materiales:
Corteza liofilizada de Cariniana decandra.
Jeringa descartable de 1cc
Jeringa descartable de 3cc
Vaso de precipitado de 50 mL
Pipeta graduada de 1mL
Pipeta graduada de 5 mL
Algodón
Gasa
Guantes descartables 7 ½
Mascarilla descartable
Tijeras quirúrgicas tipo iris
Pinzas quirúrgicas para punta roma y curva
Cronómetro digital
Placa Petri
Cinta métrica
Reactivos:
Atropina
Carbón activado
Carboximetil celulosa
Formol Q.P.
Alcohol Medicinal
Equipos:
Balanza analítica
48
Animales de experimentación:
Ratones albinos de ambos sexos
Procedimiento experimental: Ratones albinos hembras con
ayuno de 12 horas y agrupados al azar en 4 grupos se tratan
con el vehículo (solución salina 0.9%), Atropina (5 mgkg-1;
i.p.) y extracto liofilizado (100, 200 mgkg-1; p.o.).
Transcurridos 30 minutos del tratamiento se administra a
todos los animales carbón activado suspendido en
carboximetil celulosa, 45 minutos después los animales se
sacrifican, se remueve el estómago e intestino delgado y se
evalúa la distancia recorrida por el carbón activado que es
medida desde el piloro hasta la válvula ileocecal que
contiene por lo menos 1 cm continuo de carbón activado.
Se expresa la distancia recorrida en porcentaje con relación
a la longitud del intestino delgado. Los resultados se
evalúan mediante métodos estadísticos. 11
3. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
Actividad Inflamatoria intestinal crónica.
Actividad Analgésica
Actividad sobre el SNC (Performance motora)
Evaluación de la actividad de tránsito intestinal
Actividad Hipoglicemiante
Evaluación efecto Protector de mucosa gástrica.
Actividad antioxidante *.
AGOST
1
2
x
x
x
x
X
x
X
x
x
SET
1
OCT
2
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
1
X
X
X
2
X
X
X
*: Ejjecución opcional
4. BIBLIOGRAFÍA
1. Mostacero LJ; Mejia CF; Gamarra TO. 2002. Taxonomìa de las Fanerogamas
útiles del Perú. Vol. I Concytec. Trujillo – Perú.
2. www.unaledu.com/un/imani/glosari
3. www.peruwoodproducts.com/cachimbo. Html.
4. www.humboldt.org.com/conservacion/amenazas/lecythidaceas.html.
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Estudios Regionales Andinos Bartolomé de las Casas. Programa de las Naciones
Unidas para el Desarrollo. 15-302
6. Yamada, T.; Deitch, E.; Grisham, M.B. 1993. Mechanisms of acute and chronic
intestinal inflamation induce by indometacin inflamation. 17(6): 641-662.
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8. Boissier, J.R.; Dremont, C; Robins, R & Pagny, 1961. J. Arch. Int.
Pharmacodin. Ther, 133: 29-32,
9. Venkateswarlo, V.; Kokate, C.K. and Pambhau, D. 1993. Antidiabetic activity of
roots of salacia macrosperma. Planta med. 59: 391 – 393.
10. Kobayashi, T.; Ohta, Y. 2001. Teprenone promotes the healing of acetic acid –
induced chronic grastric ulcers in rats by inhibiting neutrophil infiltration and
lipid peroxidation in ulcerated gastric tissues. Pharmacol Res. 43(1). 23-30.
11. Arbos, J.; Zegri, A.; López, F.R.J.; Argiles, J.M. 1993. A simple method for
determining the rate of gastro intestinal transit in the rat. Archiv. Int. Physiol.
Bioch.101: 113-115pp.
50