Clase_5_HPLC_QAII - U

03/07/2012
CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA
DE ALTA RESOLUCIÓN
Curso: Química Analítica II
Loreto Ascar
2012
Esquema de las bases de la separación en cromatografía de:
(a)absorción, (b) partición, (c) Intercambio iónico y (d) Exclusión por
tamaño
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CROMATOGRAFÍA DE REPARTO
El líquido de la fase estacionaria está adsorbido sobre un
soporte sólido. Los líquidos que componen ambas fases
deben ser inmiscibles
• Cromatografía líquido – líquido
(adsorción física de la fase estacionaria sobre el soporte)
Desventaja: Pérdida de fase estacionaria por disolución en la fase
móvil, no permite trabajar en gradiente
• Cromatografía de fase unida químicamente o enlazada
(unión química de la fase estacionaria sobre el soporte)
Fase Estacionaria
Sílice hidrolizada
R es un grupo alquilo o alquilo sustituido , le confiere carácter polar o apolar:
Polares: Fase Normal
ciano ((–C2H4CN)
diol (–C3H6OCH2CHOHCH2OH)
amino (–C3H6NH2)
Apolares: Fase Reversa
cadena hidrocarbonada
n-octyl (C8)
n-octyldecyl (C18)
Fases estacionarias polares
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Fases estacionarias apolares
Octadecil:
Si-O-Si -------------CH3
Octil:
Si-O-Si--------CH3
Dimetil:
Si-O-Si - CH3
CH3
El enlace covalente, le confiere carácter térmico e hidrolítico
estable
Partícula de relleno para (a) cromatografía en fase normal y
(b) cromatografía en fase reversa
Rellenos de Fase Normal y Fase Inversa
• Fase Normal
Fase estacionaria: polar
Fase móvil: apolar
• Fase Inversa
Fase estacionaria: apolar
Fase móvil: polar
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Fase Normal y Fase Inversa
Efecto largo de cadena en fase inversa
Partículas de 5 µm, fase móvil 50/50 : metanol/agua, caudal 1,0 mL/min
Elección del Método Cromatográfico
Debe existir un adecuado equilibrio entre las
fuerzas intermoleculares del soluto, fase móvil y
fase estacionaria
Soluto muy afín con fase móvil, tiempo de elución muy bajo,
pobre separación
Soluto muy afín con fase estacionaria, tiempo de elución
excesivamente largo
Polaridad grupos funcionales:
Hidrocarburos < éteres < ésteres < cetonas < aldehídos < amidas <
aminas < alcoholes
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Acetaminofen, cafeína, ácido benzoico y ácido salicílico
Aplicaciones de la cromatografía de reparto
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Derivatización
• Reducir la polaridad de los analitos, poder usar cromatografía
de reparto
• Aumentar la respuesta del detector (sensibilidad)
• Aumentar la selectividad del detector
CROMATOGRAFÍA DE PARES IÓNICOS (ICP)
Permite la determinación de especies iónicas por cromatografía
de reparto en fase inversa, incorporando un contraión a la fase
móvil de carga opuesta al analito, generando una especie neutra.
La fase móvil está constituida por una disolución acuosa
reguladora que contiene un disolvente orgánico como metanol o
acetonitrilo y un compuesto iónico que aporta un contra ión de
carga opuesta al analito, generando una especie neutra que es
retenida por el relleno de fase inversa.
Mecanismos para la separación por cromatografía de
pares iónicos
• Formación de pares iónicos del contraión con la
muestra ionizada, para formar la especie neutra que
luego va a interactuar con la fase estacionaria.
• La cadena alquílica del contraión se reparte en la fase
estacionaria dejándola cargada, esto convierte la
columna de fase inversa en una columna iónica.
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CROMATOGRAFÍA CON FASES ESTACIONARIAS
QUIRALES
Es una metodología que permite la separación de isómeros
ópticamente activos (enantiómeros)
Se recubre el soporte con un polímero al cual se le enlaza un
isómero ópticamente activo
CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN
Cromatografía líquido- sólido
Fase estacionaria: altamente polar (Sílice o alúmina)
Fase móvil: relativamente no polar
Es adecuada para compuestos no polares de masas
moleculares inferiores a 5000
Hidrocarburos aromáticos, haluros, aldehídos, sulfuros, éteres,
ésteres, cetonas, alcoholes
SELECCIÓN DE LA FASE MÓVIL
Para optimizar las separaciones sólo se puede modificar la
composición de la fase móvil
En la cromatografía de adsorción hay dos procesos
competitivos involucrados:
•Reacciones entre el grupo funcional del soluto y los sitios de
enlace de la fase estacionaria.
•Competencia entre la fase móvil y las moléculas del soluto
por los sitios de enlace de la fase estacionaria
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CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN POR TAMAÑO
(cromatografía en geles o filtración en geles)
La cromatografía de exclusión por tamaño, consiste en una fase
estacionaria de geles con tamaño de poro controlado.
Los componentes de la muestra se separan de acuerdo al tamaño
de sus moléculas
Rellenos de columna
Pequeñas partículas poliméricas o de sílice (5 a 10 um de tamaño),
con una red de poros uniformes en los que pueden difundir las
moléculas de soluto y el disolvente
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Rellenos de columna
Teoría de la cromatografía de exclusión por tamaño
La curva de calibración se realiza con estándares.
Cromatograma de exclusión de una mezcla de seis ácidos débiles
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Proteínas
Cromatografía de intercambio iónica
o cromatografía iónica (IC)
Separación y determinación de iones utilizando resinas de
intercambio iónico.
Utiliza como fase estacionaria una resina y como fase móvil un
disolvente
Los intercambiadores catiónicos contienen ácido sulfónico.
Los intercambiadores aniónicos contienen grupos amino
cuaternarios –N(CH 3)3+ OH- o grupos amina primaria -NH3+ OHlos primeros son base fuerte y los segundos base débil.
Intercambiadores catiónicos:
xRSO3- H+ + M X+ <---> (RSO3-)x MX+ + xH+
sólido
disol.
sólido
disol.
RSO3- H+ :grupos de Ac. sulfónico unidos a una gran molécula polimérica.
Intercambiador aniónico:
RN(CH3)+ OH- + A X- <----> RH (CH3-) A x- + xOHsolido
disol
sólido
disol
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Rellenos de Intercambio Iónico
Partículas esféricas porosas producidas por la polimerización de
estireno con divinilbenceno, actualmente se utilizan partículas
esféricas no porosas
Rellenos de Intercambio Iónico
Resinas de intercambio catiónico:
ácido sulfónico (-SO3-H+, ácido fuerte)
ácido carboxílico (-COO-H+, ácido débil)
Resinas de intercambio aniónico:
grupos amino cuaternarios (–N(CH3)3+ OH- , base fuerte)
grupos amina primaria ( -NH3+ OH- ,base débil)
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Cationes y metales de transición
Aplicaciones
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