ADN recombinante - Biotecnología para todos

Conceptos básicos de la tecnología
de ADN recombinante
BIOTECNOLOGÍA PARA TODOS:
Socialización de conceptos, aplicaciones y beneficios
ADN recombinante
Una molécula de ADN híbrida formada por la unión de
dos
secuencias
de
ADN
provenientes
de
dos
organismos distintos.
ADN de interés
Vector de clonación
Molécula
de
ADN
recombinante.
http://www.slideshare.net/mrtangextrahelp/18a-cloning
ADN
recombinante
Tomado
de
2
Creación ADN recombinante
●
●
●
Aislamiento de la secuencia de ADN de interés (ADN genómico,
ADNc o ADN copia o bien un ADN obtenido mediante PCR).
Unión de la secuencia de ADN de interés a un vector de
clonación.
Introducción de la molécula de ADN recombinante en una
célula huésped que puede ser procariota (bacterias) o
eucariota (levaduras).
Creación ADN recombinante
●
●
Identificación y purificación de los clones que
poseen
la molécula de ADN recombinante de
interés.
Crecimiento y amplificación de las células huésped
que incorporaron el ADN recombinante de interés.
Creación ADN recombinante
Pasos
básicos
en
la
creación
de
una
molécula
http://www.zo.utexas.edu/faculty/sjasper/images/20.1.gif
de
ADN
recombinante.
Tomado
de
Enzimas de restricción



Clonación depende
restricción.
de
las
endonuclesas
de
Enzimas que cortan la molécula de ADN en sitios
específicos denominados: sitios de restricción
(secuencias de 4 – 8 pares de bases).
Mecanismo de defensa de las bacterias contra la
infección por fagos.
• Bacterias metilan su propio ADN.
Enzimas de restricción

Reconocen secuencias de ADN palindrómicas.

Producen cortes en las dos cadenas.

Enzimas de restricción:

Extremos cohesivos o pegajosos (EcoRI)

Extremos romos (Hind II)
Enzimas de restricción
Enzima de
restricción
Secuencia
específica
Enzima de
restricción
Extremos cohesivos
Modo
de
acción
de
las
enzimas
de
restricción.
Tomado
https://biologiamolecularinteractiva.wordpress.com/about/enzimas-de-restriccion/
de
Enzimas de restricción
Enzimas de restricción
A
Sitio reconocimiento
EcoRI
corte
Extremos cohesivos
B
Sitio reconocimiento
SmaI
corte
Extremos romos
Mecanismo de acción de las enzimas de restricción: (a) extremos cohesivos y (b) extremos romos. Tomado y
modificado de http://synbio101.org/genetic-engineering/2-3-the-restriction-enzymes-as-molecular-scissors/
Vector de clonación

Molécula de ADN que vehiculizará al fragmento de
interés y permitirá su multiplicación.

Componentes:
•
Un origen de replicación.
•
Un gen marcador.
•
Sitio de clonación múltiple o sitio de restricción
múltiple: segmento corto de ADN con muchos
sitios de restricción distintos.
Vector clonación
Sitio múltiple
de clonación
Gen marcador
( por ejemplo selección a antibióticos)
Origen de replicación
Diagrama básico de un vector de clonación bacteriano (plásmido). Tomado y
modificado de http://oregonstate.edu/instruct/bb331/lecture04/FigF6.html
Plásmidos

Móleculas de ADN circular, doble banda, extracromosómicos.

Ventajas como vector de clonación:

•
Tamaño pequeño.
•
Circulares.
•
Replicación independiente del ADN cromosómico.
•
Presencia múltiples copias en la células bacteriana.
•
Presencia de genes de resistencia a antibióticos.
Transferencia
a
la
célula
hospedera
por
utilizando choque de calor o electroporación.
transformación
Vector de expresión

Estos vectores se caracterizan por poseer las secuencias
regulatorias (promotor, terminador, secuencias de unión
al ARNr) que permitan la adecuada expresión del gen de
interés.

Asimismo, poseen un sitio de replicación, un sitio de
clonación múltiple (MCS) y un gen marcador que permita
la selección de las células que incorporaron el vector.
Vector expresión
promotor
Gen de
selección
MCS
terminador
Origen de replicación
Diagrama
básico
de
un
vector
de
expresión.
Tomado
y
modificado
de
http://www.mobitec.com/cms/products/bio/04_vector_sys/constitutive_gene_expression_lactococcu
s.html
Paso 1: restricción y ligación del ADN
Vector de
clonación
Corte con
EcoRI
ADN de interés
Sitios de
corte
Corte con
EcoRI
ADN ligasa
Plasmido recombinante
Paso 2: Introducción del ADN en una célula
hospedera
ADN de interés
Vector de
clonación
Ligación del vector
de clonación
Ligación del ADN
de interés
Transformación
Transformación
Crecimiento en el medio con
el antibiótico
Transformación
No hay crecimiento en el
medio con el antibiótico
Paso 3: Selección de las células transformadas
Paso 4: Identificación de las células transformadas
PCR
Hibridación
Secuenciación
PCR
Fragmento de ADN original
Desnaturalización
Annealing
Extensión
Cebadores
Nucleótidos
Desnaturalización (94-96 ºC)
Annealing (35 ºC a 60 ºC)
Elongación (72 ºC)
Esquema general de la reacción en cadena de la polimerasa. Tomado y modificado de
https://zh.wikipedia.org/wiki/%E8%81%9A%E5%90%88%E9%85%B6%E9%93%BE%E5%B
C%8F%E5%8F%8D%E5%BA%94
Electroforesis
Técnica de electroforesis: separación de moléculas según su tamaño en una
matriz
porosa.
Tomado
y
modificado
de
http://www.bio.utexas.edu/faculty/sjasper/bio212/biotech.html
Hibridación

Construcción
bicatenario
artificial
por
complementarias
el
de
un
ácido
apareamiento
de
dos
ácido
nucleico
de
bases
nucleicos
monocatenarios.

Sonda: fragmento determinado de ADN o ARN
marcado química o radioactivamente y que es
utilizada
nucleicos.
para
localizar
secuencias
de
ácidos
Southern blot
Enzimas de restricción
ADN
Transferencia a la mebrana
electroforesis
Sonda marcada radioactivamente
Hibridación
Detección
Esquema
general
de
la
técnica
Southern
blot.
Tomado
y
modificado
de
http://www.biotechacademy.dk/Undervisningsprojekter/Gymnasialeprojekter/genteknologi/teori/4genteknologisketools
/southern-blot
Northern blot
Muestra
ARN
electroforesis
Transferencia a la
mebrana
Sondas marcadas
radioactivamente
Detección
hibridación
Esquema
general
de
la
técnica
https://vimeo.com/channels/563554/69633383
Northern
blot.
Tomado
y
modificado
de
Western blot
Detección de la señal
Anticuerpo
secundario
Anticuerpo primario
Proteína
Membrana de nylon con las proteínas
Esquema
general
de
la
técnica
Western
blot.
Tomado
y
modificado
http://www.leinco.com/includes/templates/LeincoCustom/images/WesternBlotFinal.gif
de
Secuenciación química de ADN
Corte de las bases
nitrogenadas en
Secuenciación química del ADN desarrollada por Maxam y Gilbert . Tomado y
modificado de http://pt.slideshare.net/suryasaha/sequencing-32243702
Secuenciación de ADN
Secuenciación del ADN desarrollada por Sager. Tomado y modificado de
http://www.geopaloma.com/biologia_2b/unidades/ejercicios/act14biointema6.ht
m
Aplicaciones
Insulina recombinante
Vacunas recombinantes Bacterias transgénicas
Plantas transgénicas
Animales transgénicos