ESTRUCTURA DE LÍPIDOS Y MEMBRANAS BIOLÓGICAS

CÁTEDRA: BIOQUÍMICA
Carreras: Farmacia
Profesorado en Química
Licenciatura en Química
Licenciatura en Alimentos
ESTRUCTURA DE LÍPIDOS Y MEMBRANAS BIOLÓGICAS
ESTRUCTURA DE LÍPIDOS
1- Una mezcla de 1-palmitoil-2-estearoil-3-lauroil-glicerina y de ácido fosfatídico en
benceno se agita con un volumen igual de agua. Después de dejar que se separen las
dos fases, cuál será el lípido que se halle en mayor concentración en la fase acuosa y
por qué?
2- Se tiene una muestra de un triacilglicérido puro que por hidrólisis ácida rinde:
glicerina, ácido esteárico y ácido palmitoleico en una relación molar 1:1:2. El análisis
polarimétrico de la muestra indica que el triacilglicérido no posee actividad óptica.
Escriba en fórmulas el triacilglicérido de la muestra.
3- Se tiene una muestra de un fosfolípido puro que por hidrólisis ácida rinde cantidades
equimolares de: glicerina, ácido esteárico, ácido palmitoleico, ácido fosfórico y serina.
Escriba en fórmulas el fosfolípido.
4- El índice de saponificación de una muestra de mantequilla es 230. Calcular el PM
medio de los triacilglicéridos presentes.
5- Una muestra (5 g) de los triacilglicéridos extraídos de un aguacate necesitó 34 ml de
KOH 0,5 N para su hidrólisis completa y la conversión en jabones de sus ácidos
grasos. Calcule la longitud media de la cadena de los ácidos grasos de la muestra.
6- El índice de iodo de una muestra de mantequilla es 68. Si el índice de
saponificación de la muestra es 210 ¿Cuántos dobles enlaces, como promedio, hay en
las moléculas que la constituyen?
7- Se practicó una electroforesis a pH 7 de una mezcla de lípidos que contenía
cardiolipina, fosfatidilglicerina, fosfatidiletanolamina y fosfatidilserina. Indique cómo se
desplazarán estos compuestos ¿Hacia el ánodo, el cátodo o permanecerán en el
origen?
8- ¿Cuántos mililitros de NaOH 0,1 M y 10 M se necesitarán para hidrolizar
completamente 13,8 g de fosfatidiletanolamina? PM fosfatidiletanolamina: 689.
9- La cardiolipina (PM=1350), también llamada difosfatidilglicerol, está presente en
gran cantidad en la membrana interna de las mitocondrias. a) Calcular cuantos ml de
NaOH 0,5 M se consumirán para hidrolizar 1 g de cardiolipina. b) Si se sometiera una
muestra de cardiolipina a un tratamiento con base fuerte seguido de ácido fuerte, ¿cuál
sería la relación entre glicerol, ácido fosfórico, ácidos grasos?
10- Una muestra de ácido fosfatídico esterificado con colina es sometido a 2
tratamientos: a) Una parte de la misma es procesada con fosfolipasa A1 liberándose
1
ácido palmítico. b) En una segunda fracción de la muestra se determina el índice de
iodo que resultó ser igual a 74. El PM del compuesto en cuestión es 672. Escriba una
estructura que satisfaga los datos antes mencionados
11- Un extracto lipídico contiene tres lípidos en cantidades equimoleculares. Se
somete una muestra de dicho extracto a cromatografía a pH=14 y se observa que 2/3
de la misma migra y el resto permanece en el origen. A pH=2 sólo 1/3 de lo sembrado
migra. El análisis exhaustivo de los componentes del extracto da como resultado la
presencia de glicerol, ácido fosfórico, ácidos grasos y componentes nitrogenados en
relación molar: 5-3-9-1. ¿Cuales pueden ser los lípidos componentes de este extracto?
12- Para determinar la estructura de un lípido supuestamente homogéneo se somete
una muestra del mismo a dos procedimientos: a) En un primer paso se determina g
glicerol / g muestra. El resultado es 1/4,89. b) En un segundo paso y sobre otra porción
de la muestra se realizan hidrólisis alcalina y ácida. Los productos son sometidos a
cromatografía y la posterior identificación da como resultado la presencia de ácido
fosfórico-glicerol-ácidos grasos en relación molar 2-3-4. Escribir una estructura que
satisfaga los datos anteriores.
13- Por un procedimiento analítico se determinó que 4,45 g de un compuesto lipídico
polar contenía 1 g de glicerol y 1,07 g de ácido fosfórico. Por otro análisis se encontró
ácido palmítico. ¿Cuál es la estructura molecular de este compuesto? ¿Cuántos ml de
NaOH 10 M serán necesarios para hidrolizar completamente 20,45 g del mismo?
14- El análisis de una muestra de un esfingolípido puro brindó la siguiente información:
a) La hidrólisis exhaustiva rindió cantidades equimoleculares de ácido oleico,
esfingosina, los azúcares D-glucosa y D-galactosa, el aminoazúcar D-glucosamina y el
desoxiazúcar L-fucosa. (L-fucosa: 6 desoxi L galactosa).
b) Mediante hidrólisis controlada se separó la cabeza polar del lípido. Sobre la fracción
glucosídica purificada se realizaron estudios de metilación exhaustiva seguida de
hidrólísis, obteniéndose 2,6-di-0-metil-galactosa; 2,4,6-tri-0-metil-glucosa; 2-N,Ndimetil-3,4,6-tri-0-metil-glucosamina y 2,3,4-tri-0-metil-fucosa. Escriba al menos una de
las estructuras posibles del glucolípido que corresponda a los datos expuestos.
Considere que todos los enlaces glucosídicos son de tipo alfa.
RESPUESTAS
1. Va a ser más soluble el compuesto más polar.
4. 730
5. 18 carbonos
6. 2 dobles enlaces
7. ánodo, ánodo, origen, ánodo.
8. 400 mL, 6 mL.
9. 5,92 mL.
3 Glicerol:2Ac fosf.:4Ac grasos
10. C2 del fosfolípido esterificado con un ácido graso de 13 C y 2 dobles enlaces
11. cardiolipina, triglicérido, fosfolípido
12. cardiolipina con ácidos grasos con 16 átomos de carbono en promedio
13. 5 ml.
2
MEMBRANAS BIOLÓGICAS.
1-Indique las proteínas que se extraen de la membrana por tratamiento con:
a) soluciones salinas
b) detergentes
c) tripsina sobre la célula intacta
d) tripsina sobre preparaciones de membrana
2- a) Dibuje un esquema de una membrana celular, ubicando en la misma las
siguientes proteínas:
D proteína intrínseca, C proteína extrínseca externa y F proteína extrínseca interna.
b) Indique que proteínas serían liberadas de la membrana con cada uno de los
siguientes tratamientos:
I- Tratamiento de las membranas con detergente.
II- Tratamiento de las células con 0,1 M NaCl.
III- Tratamiento de las células en condiciones hipotónicas seguida de lavado con NaCl
0,1 M.
IV- Tratamiento de las células en condiciones hipotónicas seguida de lavado con
detergente.
3- La mayor parte de las membranas de las células normales contienen alrededor del
60% en peso de proteínas, y un 40% en peso de fosfoglicéridos.
a) Calcule la densidad media de una membrana, suponiendo que la proteína posee
una densidad de 1,33 g/cm3 y el fosfoglicérido una densidad de 0,92 g/cm3
b) Si se centrifuga una muestra del material membranoso en una solución de NaCl con
una densidad de 1,05 g/cm3. ¿Sedimentaría o flotaría?
4- Una proteína esférica de membrana de hepatocitos de rata de 150 kDa se marcó
con un anticuerpo fluorescente. Por experimentos tipo FRAP y SPT se determinó su
movilidad en membranas aisladas. La viscosidad efectiva de esta proteína en la
membrana es n=1.2 erg.seg/cm3 y su densidad 1,15 g/cm3. Dado que el coeficiente de
difusión de una molécula esférica es D=kT/6¶nr (k: constante de Boltzman 1,38 x l0-l6
erg/grado; T: temperatura absoluta y r: radio de una esfera). Indique: a) ¿Cuál es el
coeficiente de difusión a 34°C de la proteína en la membrana del hepatocito? b) ¿Cuál
es la distancia (s) atravesada por la proteína en la membrana a dicha temperatura en 1
seg? s=(4Dt)1/2
5- Se quiere estudiar la ubicación de tres proteínas: A, B, C en la membrana
plasmática del eritrocito humano. Se obtienen las siguientes evidencias
experimentales:
a) Se trata con detergente la membrana plasmática del eritrocito y se obtienen las tres
proteínas incógnitas, de las cuales C es glicoproteína.
b) Se someten fantasmas de eritrocitos al tratamiento con NaCl 1M liberándose la
proteína B.
c) Se preparan anticuerpos contra A, B y C en forma independiente. Estos se hacen
reaccionar con los eritrocitos intactos: sólo se unen a las células los anticuerpos contra
B y C (los anticuerpos no son capaces de atravesar la membrana plasmática).
d) Al suspender los eritrocitos en una solución salina hipotónica, estos se hinchan y
aumentan la permeabilidad de proteínas en ambos sentidos de la membrana. Al hacer
reaccionar los eritrocitos en estas condiciones con antiA, antiB y antiC, se observa
3
unión de todos ellos a la membrana plasmática.
Dibuje las posibles alternativas respecto a la posición de las proteínas A, B y C en la
membrana, clasificándolas de acuerdo al modelo del mosaico fluido.
6- Un laboratorio le encarga un liposoma que sirva para transportar por sangre una
proteína M con acción medicamentosa. La proteína M es un homodímero de PM
15.000 compuesto por 30% Ser, 20% Lys, 15% Gly, 10% Arg, 10% Phe, 5% Val, 5%
Glu, 3% Cys y 2% Tyr. El liposoma debe estar dirigido a células  de páncreas. A tal
fin diseña un sistema conteniendo:
a- una mezcla de esfingo y glicerofosfolípidos en relación molar 1:2
b- una glicoproteína N con alto contenido en Phe y cuya parte glucosidica determina
especifidad para unirse a células  de páncreas.
c- la proteína M.
Incuba esta mezcla siguiendo un protocolo adecuado y obtiene, para su satisfacción,
liposomas que responden a las expectativas terapeúticas al ser ensayadas en ratas.
Haga un esquema de los liposomas indicando la ubicación de cada uno de los
componentes de la mezcla. Qué esperaría obtener al tratar los liposomas en las
siguientes condiciones:
I- Medio isotónico con NaCl 0,15 M.
II- Medio con detergentes y 0,15 M NaCl.
III- Ruptura hipotónica seguida de un lavado con 0,15 M NaCl.
IV- Tratamiento con tolueno.
7- La conductancia de una bicapa lipídica que contiene un carrier para un determinado
antibiótico disminuye abruptamente cuando la temperatura desciende de 40°C a 36°C.
Cuando la bicapa lipídica contiene un canal para el antibiótico la conductancia varía
mínimamente ante el mismo cambio de temperatura. ¿Cómo explica esta observación?
8- El receptor de las proteínas de membrana de la hormona adrenalina en las células
animales es una proteína integral de membrana (PM 64.000) que se cree que
atraviesa la membrana 7 veces. Si se le diera la secuencia de aminoácidos de esta
proteína, ¿cómo se las arreglaría para predecir que regiones de la proteína forman las
hélices que abarcan la membrana?
9- Una proteína de membrana desconocida, X, se puede extraer por rotura de
membranas de eritrocito en una solución salina concentrada. La X aislada se puede
cortar en fragmentos mediante enzimas proteolíticas. Sin embargo, el tratamiento de
los eritrocitos primero con enzimas proteolíticas seguido de rotura y extracción de los
componentes de la membrana produce una X intacta. Por el contrario el tratamiento de
espectros de eritrocitos (que consisten en membranas producidas por rotura de las
células y eliminación de la hemoglobina) con enzimas proteolíticas seguida de rotura y
extracción produce una X muy fragmentada. ¿Qué indican estos experimentos sobre la
localización de X en la membrana plasmática?
10- A pH 7 el triptofano cruza una membrana formada por una bicapa
lipídica unas 1000 veces más lentamente que la sustancia
estrechamente relacionada indol. Sugiera una explicación para esta
observación.
N
H
11- En la tabla se muestra la composición porcentual en aminoácidos de tres
4
proteínas: A, B y C de similar peso molecular, aisladas de membranas de eritrocitos de
carnero. Además se conocen los siguientes datos:
a) El tratamiento de los eritrocitos con 0,15 M NaCl en condiciones isotónicas libera
sólo una de las proteínas, la que fue caracterizada como proteína básica (pI= 9,3)
b) La ruptura hipotónica de los eritrocitos, seguida de un lavado con 0,15 M NaCl,
resultó en la liberación de dos de las proteínas.
c) La liberación de las tres proteínas requirió el tratamiento de las membranas con
detergente.
En base a estos datos dibuje un esquema de las membranas de los eritrocitos de
carnero ubicando en el mismo las proteínas A, B y C. Clasifique cada proteína de
acuerdo a su ubicación en la membrana.
AMINOACIDOS
Alanina
Arginina
Aspártico
Cisteína
Fenilalanina
Glicina
Glutámico
Histidina
Leucina e Isoleucina
Lisina
Metionina
Prolina
Serina
Tirosina
Treonina
Triptofano
Valina
A
5
6
10
2
4
4
12
12
4
6
3
1
13
6
8
2
2
B
9
3
4
1
17
5
3
2
17
2
9
1
2
2
2
9
12
C
4
15
7
3
4
3
8
8
3
18
2
2
9
7
5
1
1
12- De un cultivo a 25ºC de la bacteria Anacystis nodum se obtuvieron células de las
que se aislaron 6 componentes mayoritarios: 3 lípidos (A, B y C) y 3 proteínas (P, Q y
R). Los 3 componentes lipídicos presentaron las siguientes características:
a) El lípido A puro rindió luego de la hidrólisis completa, glicerol, ácido esteárico, ácido
oleico, ácido fosfórico y treonina en cantidades equimoleculares.
b) El lípido B no mostraba actividad óptica y luego de la hidrólisis completa rindió
glicerol, ácido esteárico y ácido oleico.
c) El lípido C rindió luego de la hidrólisis completa cantidades equimoleculares de
esfingosina, ácido esteárico, D-glucosa y D-galactosa. Se determinó que las uniones
glucosídicas son de tipo alfa.
Los tres componentes proteicos presentaron las siguientes características:
a) P es una proteína globular homotetramérica que fue liberada por simple ruptura
hipotónica de la célula bacteriana.
b) Q es una glicoproteína de estructura dimérica formada por las subunidades alfa y
beta, que se caracterizan por poseer un elevado porcentaje de Ala, Val, Phe, Trp y
Leu. La liberación de la proteína Q sólo se consiguió luego de un tratamiento con
detergentes. Se determinó que la subunidad alfa contenía la porción glucosídica de la
proteína.
5
c) R es una proteína monomérica con un elevado contenido de Ser, Tyr y Lys.
d) Se obtuvieron anticuerpos específicos para P (IgGP), R (igGR) y para cada una de
las subunidades Q. Diversos estudios mostraron que el tratamiento de las células
bacterianas intactas con NaCl 0,2 M no libera ninguna de las proteínas y que en estas
condiciones sólo IgGalfa reacciona con su antígeno. La reacción de IgGbeta, IgGP e IgGR
requiere de la ruptura hipotónica previa de las células bacterianas.
En base a estos datos, escriba en fórmulas los lípidos A, B y C y haga un esquema de
la célula bacteriana ubicando los componentes lipídicos y proteicos.
¿Qué cambios esperaría encontrar en los componentes si creciera la bacteria a 37ºC?
Justifique su respuesta.
13- Se realizó un estudio con células adiposas de oso pardo, obteniéndose los
siguientes resultados:
a) Se identificaron 6 componentes mayoritarios en estas células, 4 lípidos (A, B, C y
D) y 2 proteínas (X e Y).
b) El lípido A puro luego de hidrólisis completa rindió esfingosina, ácido palmítico y
Ser en cantidades equimoleculares. El lípido B mostraba actividad óptica y luego de
hidrólisis rindió glicerol, ácido palmítico y ácido esteárico en una relación molar
1:2:1. El lípido C fue identificado como colesterol. El lípido D rindió luego de
hidrólisis completa glicerol, ácido oleico, ácido esteárico, ácido fosfórico y Thr en
cantidades equimoleculares.
c) El componente X se identificó como una glicoproteína con un alto contenido de
Phe, Val, Leu y Trp. De esta glicoproteína se obtuvieron 2 anticuerpos diferentes
IgG1 e IgG2.
d) La proteína Y era globular y tenía un PM de 360.000.
e) El tratamiento de los adipocitos intactos en un medio isotónico con 0,15 M NaCl no
liberó ninguna proteína y en estas condiciones sólo IgG1 se unió a X.
f) La ruptura hipotónica de los adipocitos, seguida de un lavado con 0,2 M NaCl,
liberó en solución a la proteína Y y en estas condiciones tanto IgG1 como IgG2 se
unieron a X.
La liberación en solución de X e Y requirió de un tratamiento con detergente.
En base a estos datos escriba en fórmulas los lípidos A, B y D y haga un esquema
completo de los adipocitos indicando la localización de los componentes mayoritarios
A, B, C, D, X e Y.
14- La fosfolipasa A2 hidroliza el ácido graso de la posición beta de los fosfolípidos,
dando ácidos grasos libres y los lipoderivados correspondientes. Cuando esta enzima
actúa sobre glóbulos rojos suspendidos en medio isotónico no se produce hemólisis. El
análisis de los fosfolípidos de membrana de glóbulos rojos tratados con fosfolipasa A
indica que cerca de los dos tercios del contenido de fosfatidiletanolamina y
fosfatidilserina resiste la acción de la enzima mientras que el tercio restante es
hidrolizado. Cuando se trabaja con glóbulos rojos hemolizados todos los fosfolípidos
son sensibles a la hidrólisis enzimática. ¿Qué puede deducir de este experimento
acerca de la ubicación de los fosfolípidos en la bicapa lipídica?
15- Usted ha estado trabajando para caracterizar el metabolismo lipídico de una cepa
bacteriana termofílica capaz de resistir temperaturas mayores a 50ºC. Como parte de
ese trabajo, ha determinado la composición de los lípidos de membrana de esta
bacteria. A efectos comparativos, realiza la misma medición en una cepa de una
especie cercana que es termosensible, no creciendo ésta a temperaturas mayores a
6
37ºC. Asigne cada serie de datos a la cepa correspondiente y explique su decisión.
Composición de lipídos
% Serie A
% Serie B
Fosfolípidos con ácidos grasos saturados
25
57
Fosfolípidos con ácidos grasos insaturados
41
19
Esteroles
18
10
Otros
16
14
16- La enzima X es una proteína de membrana mitocondrial interna y está formada por
dos polipéptidos (a de 40.000 de peso molecular (PM) y b de 22.000 de PM) unidos
por fuerzas no covalentes. Se dispone de preparaciones de membranas mitocondriales
abiertas y de mitocondrias sometidas a diversos tratamientos, obteniéndose las
siguientes fracciones:
TRATAMIENTOS
I) Membranas mitocondriales abiertas + detergente
10.000g x 60 min
P1
S1
II) Membranas mitocondriales abiertas + NaCl 0.5 M
10.000g x 60 min
P2
S2
III) Vesículas de membrana interna (right side out) + tripsina
10.000g x 60 min
P3
S3
IV) Membranas mitocondriales internas abiertas + tripsina
10.000g x 60 min
P4
S4
V) Mitocondrias obtenidas de células tratadas con cloranfenicol (F5).
En las distintas fracciones se ensayó la actividad enzimática y la composición
polipeptídica de la proteína X.
7
Actividad
enzimática (*)
I
P1
0
S1
100
II
P2
0
S2
0
III
P3
100
S3
0
IV
P4
0
S4
0
V
F5
0
(*) Expresada en unidades arbitrarias
Polipéptido a
NO
SI (40 kDa)
SI (40 kDa)
NO
SI (30 kDa)
NO
SI (20 kDa)
NO
SI
Polipéptido b
NO
SI (22 kDa)
NO
SI (22 kDa)
SI (22 kDa)
NO
NO
NO
NO
Puede concluirse que:
a) El polipéptido ___________ es una proteína integral de membrana.
b) El polipéptido ___________ es una proteína periférica.
c) La actividad enzimática de la proteína X depende de la presencia de:
i)a, ii) b, iii) a y b.
d) El polipéptido que es periférico está ubicado en la membrana interna mitocondrial
sobre la cara:
i)
de la matriz mitocondrial
ii)
del espacio intermembrana.
e) ¿En que compartimentos celulares se sintetizan los polipéptidos a y b?
f) ¿Que le indica el hecho de que el tratamiento con tripsina de las vesículas de
membrana interna right side out (III) no afecte a la actividad enzimática?
g) Haga un esquema de un trozo de membrana mitocondrial y ubique, con su
orientación correcta, a y b de acuerdo con lo respondido a las preguntas anteriores.
17- Membrana de levaduras.
a) Indique los lípidos que podrían ser componentes de las mismas.
Ácido láurico
Esfingomielina
Triacilglicérido
Fosfatidilserina
Fosfatidilcolina
Gangliósido
Fosfatidilinositol
Ácido oleico
Colesterol
Ácido linolénico
Ácido linoleico
Cerebrosido
Ácido palmítico
Prostaglandina
Ácido esteárico
b) Indique el compuesto que utilizaría para la extracción de las proteínas
extrínsecas de estas membranas.
Cloruro de sodio
Etanol
Sacarosa
Tritón X-100
Cloroformo
SDS
Celulasa
KOH
Urea
Betamercaptoetanol
Albúmina
Inositol
c) Indique entre los ácidos grasos listados en el ítem a) el que más probabilidad
tiene de ser encontrado en organismos criófilos.
8
RESPUESTAS
1. a) Periféricas b) Periféricas, ancladas a lípidos e integrales c) Hidrólisis de parte de
la proteína integral que se expone al medio fuera de la membrana d) Hidrólisis interna
y externa de segmentos proteicos de proteína integral ubicados fuera de la membrana.
2. I- C, D, F. II- C. III- C, F. IV- C, D, F
3. 1,17 g/cm3, sedimentaría
4. a) 5 10-9 cm2/s b) 0,00014 cm
5 A intrínseca con proyección hacia el lado citosólico, B extrínseca externa, C
intrínseca
6. I- -. II- M, N, EL y FL. III- M. IV- EL, FL, N y M
7. Ver diferencias entre “carrier” y canal.
8. Ver índice hidropático
9. Indican que es interna y extrínseca
10. Porque el Trp está cargado lo que dificulta su paso por difusión
11. A proteína extrínseca interna, B proteína intrínseca, C proteína básica extrínseca
externa
12. Se aumenta el % de ácidos grasos saturados.
13. Proteína X es integral. Fracción 1 (atacada por IgG1) expuesta al exterior de la
célula. Fracción 2 hacia el interior. La proteína Y no forma parte de la membrana y se
libera cuando se rompe la célula. Y es extrínseca interna.
14. Fosfatidiletanolamina y fosfatidilserina se hallan en mayor porcentaje en la cara
interior de la membrana del glóbulo rojo.
15. A termosensible; B termofílica.
16. a) a; b) b; c) iii) a y b; d) ii;
e) a núcleo; b mitocondrias f) b no es esencial
para la catálisis.
9
MATERIAL SUPLEMENTARIO
Definiciones útiles:
-Indice de saponificación es el número de mg de KOH necesarios para saponificar 1 g
de triacilglicérido.
PM KOH = 56
-Indice de Iodo es el número de gramos de I2 absorbidos por 100 g de aceite o grasa.
PM I2 = 254.
-PA fósforo: 31. PA nitrógeno: 14.
10
Ácidos grasos: saturado y con una insaturación cis
Triacilglicérido
11
Glicerofosfolípidos
Porciones hidrofóbicas e hidrofílicas de un glicerofosfolípido
12
La unión a la ceramida es a través de un enlace glucosídico.
13
14
Sitios de corte de fosfolipasas.
Esquema de membrana según el modelo de mosaico fluido
15
Glicoforina
Índice hidropático
16