Microorganismos que intervienen en la generación de

Microorganismos que intervienen en la generación de biogás
Karla Cristel Cámara Moguel, José Ramón Laines Canepa, José Aurelio Sosa Olivier
[email protected]
Resumen
La digestión anaerobia es un proceso biológico degradativo en el que a través de sus fases
consecutivas y con óptimos parámetros fisicoquímicos, diversos complejos enzimáticos generan
biogás. La hidrólisis, primera fase elemental, se da cuando las enzimas celulolíticas, proteolíticas y
lipolíticas degradan las biomoléculas del sustrato a sus monómeros correspondientes para ser
utilizados por microorganismos de la siguiente fase hasta la metanogénesis. En la Universidad
Juárez Autónoma de Tabasco se desarrolla un proyecto cuyo objetivo es conocer las poblaciones
microbianas de la digestión anaerobia del rumen gástrico de ganado bovino y su correlación con los
gases que éstas generan durante la producción de biogás en un biodigestor de cúpula tipo Batch.
Para dicho estudio se tomaron muestras de cuatro puntos del biodigestor durante 45 días, los
parámetros fisicoquímicos se analizaron cada tercer día, los microbiológicos y la concentración de
gases, cada semana. Se utilizó el medio de cultivo EMB para identificar bacterias de la familia
Enterobacteriaceae; los gases se determinaron por cromatografía y los parámetros fisicoquímicos
con un conductor eléctrico marca Hanna HI9828. Las bacterias halladas fueron Escherichia coli,
Klebsiella pneumoniae, Enterococcus faecalis, Proteus mirabilis, Shigella flexneri. El volumen de
CH4 fue 59.34%, CO2 30.95%, N2 7.349% y 2.361% de O2; de H2S 15.451 ppm. La temperatura y
el pH no presentaron diferencias significativas (p>0.05); el oxígeno disuelto presentó un efecto
estadísticamente significativo (p=0.0396) entre los puntos de muestreo 1 y 4; en sólidos disueltos no
se encontró diferencias significativas (p>0.05, Kruskal-Wallis).
Palabras Clave: bacterias, biodigestor, bioquímica, digestión anaerobia, enzimas
1. Introducción
El desarrollo tecnológico e industrial y la elevada densidad poblacional generada al final del siglo
XX, han ocasionado considerables volúmenes de residuos sólidos urbanos (RSU) a nivel nacional e
internacional, constituyendo uno de los principales problemas ambientales de la sociedad
contemporánea, además de contribuir en la generación de focos de infección que perjudican la salud
humana como consecuencia de la falta de control, de alternativas de tratamiento y la ausencia de
leyes reguladoras. Investigaciones realizadas en América Latina para tratar estos residuos,
utilizando métodos fisico-químicos, químicos y biológicos han demostrado que estos últimos son
los más adecuados, siendo el de mayor perspectiva la digestión anaerobia (DA). La aplicación de
esta tecnología es considerada una de las más eficientes para el tratamiento de los RSU, debido a
que en la mayoría de los países latinoamericanos el contenido de Fracción Orgánica (FO) representa
entre un 40 – 75% [1]. La DA que se genera de manera natural en los rumiantes, involucra diversos
microorganismos, más de 200 tipos de bacterias y 20 tipos de protozoos ayudan a la vaca a usar los
nutrientes y son capaces de degradar materia orgánica en diferentes fases hasta producir una mezcla
de gases [2]. Debido a la fermentación ruminal, se producen diferentes gases cerca de 30-50
litros/hora en un bovino adulto, los cuales son eliminados a través del eructo. El contenido del
rumen y retículo es de aproximadamente de 30 a 60Kg en bovinos [3]. La DA es un proceso
complejo desde el punto de vista microbiológico; al estar enmarcado en el ciclo anaerobio del
carbono, es posible en ausencia de oxígeno, transformar la substancia orgánica en biomasa y
compuestos inorgánicos en su mayoría volátiles: CO2, NH3, H2S, N2 y CH4 [4]. El objetivo del
Hacia la sustentabilidad: Los residuos sólidos como fuente de energía y materia prima
© 2011 pp 640-644 ISBN 978-607-607-015-4
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presente trabajo fue entender la interacción de los microorganismos hidrolíticos del rumen en la
primera fase de la DA con la generación de biogás.
2. Materiales y Métodos
2.1 Área de estudio
El biodigestor se encuentra ubicado en la División Académica de Ciencias Biológicas (DACBiol)
de la Universidad Juárez Autónoma de Tabasco (UJAT) en la ciudad de Villahermosa Tabasco,
México. El rumen utilizado, fue transportado del frigorífico de la Unión Ganadera de la ciudad de
Villahermosa a la DACBiol. Para la fermentación del rumen gástrico se utilizó un biodigestor en
forma de cúpula tipo Batch con una capacidad de DA de 67m3, con un volumen total de sustrato de
7,300Kg.
2.2 Muestreo
Nomenclatura de las muestras. Muestra 1 (M1), a la entrada del influente, primer día. Las Muestras
2 a la 6 (M2-M6), se nombran en razón de los días de muestreo: M2-20 días, M3-35 días, M4-42
días, M5-49 días y M6-56 días.
Lugar de muestreo para M2-M6. Tubos de recirculación y extracción de sólidos de PVC de 6‘‘
colocados tangencialmente a lo largo del biodigestor (Celda).
Tamaño de submuestra para M2-M6. 4 de 2L cada una.
2.3 Análisis fisicoquímicos
641
Se determinó a cada submuestra, los siguientes parámetros: pH, temperatura (°C), sólidos disueltos
(SD, ppt) y oxígeno disuelto (OD, ppm). El equipo utilizado fue un medidor multiparamétrico
portátil con receptor GPS, modelo HANNA HI 9828®, cada tercer día desde la alimentación del
biodigestor hasta llegar a su capacidad de DA.
2.4 Preparación de diluciones y siembra en Agar Eosina y Azul de Metileno (EMB)
Muestra representativa. De las 4 submuestras, que conformaban cada una de las muestras, se le
aplicó el método de cuarteo hasta tener una muestra de 0.5L.
Diluciones. A tubos de cultivo que contenían un volumen de 9ml de solución de NaCl 0.85%
estéril, se les agregó 1ml de la muestra representativa de rumen, realizando diluciones seriadas de
1:10 (10-1) hasta 10-10.
Siembra. Se procedió a realizar las siembras de las muestras en cajas Petri con medio de cultivo
EMB, después de la siembra se incubaron durante 48h a 37°C. La siembra se hizo para las seis
muestras tomadas de rumen del biodigestor con dos repeticiones por dilución. Para el conteo de
colonias, se utilizó el método directo en placa.
2.5 Análisis de gases
Semanalmente se tomaron tres muestras de biogás, en bolsas de Tedlar ® (Keika Ventures, Chapel
Hill, North Caroline, USA) de 10 L, bolsas apropiadas para el muestreo de gases debido a sus
durabilidad y a que el material de construcción de éstas (fluoruro de polivinilo) es químicamente
inerte a los componentes del biogás. Estas muestras se enviaron al laboratorio del complejo
Procesador de Gas (CPG) Cactus l de PEMEX, donde se determinó la composición del biogás
utilizando un cromatógrafo de gases Varian, modelo GC-450 ®.
2.6 Diseño estadístico
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Para los resultados de los parámetros medidos (Temperatura, pH, SD, OD) se utilizó un diseño
completamente aleatorizado ANCOVA (una vía) tomando como covariable el tiempo. El estudio
estadístico de las bacterias cultivadas en medio EMB fue realizado por conteo directo tomando un
mínimo de microorganismos de 30 por placa. Para el análisis estadístico se utilizo el paquete
estadístico STATGRAPHICS 5.1. Para el diseño de las graficas se utilizó el programa
SIGMAPLOT 11.0.
3. Resultados y discusión
3.1 Análisis microbiológicos
Hubo crecimiento de bacterias que fermentan lactosa así como microorganismos que no fermentan
lactosa en las muestras M1, M2, M3, M5 y M6. En la única muestra que no se encontró bacterias
que no fermentan lactosa fue en la M4.
Dentro del complejo mundo bacteriano del rumen, la bacteria más abundante en esta investigación
fue Klebsiella, bacteria que fermenta lactosa además de producir gases; seguida de E. coli que
también fermenta lactosa y glucosa con producción de gas y ácidos orgánicos; Enterobacter
aerogenes fermenta lactosa con producción de gas H2; Shigella no fermenta lactosa y no produce
H2S. Las bacterias menos abundantes fueron Proteus mirabillis, Salmonella y Candida spp. en
orden descendente teniendo las dos primeras la misma proporción (Figura 1).
La mayor actividad bacteriana en el biodigestor se dio en el punto cuatro de muestreo para las
muestras M2 y M4 (Figura 2). En la M4, muestra tomada a los cuarenta y dos días hubo el mayor
crecimiento bacteriano (2.27E+05 cel/ml) seguido de M2, muestras que fueron tomadas a los veinte
días (1.22E+05 cel/ml). El menor crecimiento bacteriano se dio en las muestras que se tomaron a
los treinta y cinco días (M3) teniendo crecimiento solo en el punto de muestreo cuatro. Las
muestras M5 y M6 tuvieron su mayor actividad microbiana en los puntos uno y tres
respectivamente para descender su actividad catalítica en el punto cuatro.
3e+5
Abundancia (cel/ml)
3e+5
2e+5
2e+5
1e+5
5e+4
le
bs
ie
lla
K
nt
er
ob
ac
te
r
sp
p
Bacterias
E
C
S
al
m
an
di
da
on
el
la
ol
i
.c
E
hi
ge
lla
S
P
ro
te
us
0
Figura 1. Abundancia de enterobacterias que forman la microbiota del rumen de ganado bovino fermentado
en un biodigestor tipo Batch
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2.5e+5
M2
M3
M4
M5
M6
Microorganismos cel/ml
2.0e+5
1.5e+5
1.0e+5
5.0e+4
0.0
0
1
2
3
4
5
Puntos de muestreo
Figura 2. Crecimiento bacteriano de cinco muestras de rumen (de M2 a M6) tomadas en los cuatro puntos de
muestreo del biodigestor
3.2 Análisis fisicoquímicos
0.7
0.6
b
0.5
OD (ppm)
643
La concentración de oxígeno disuelto (OD), fue mayor en el punto de muestreo cuatro (0.5ppm) y
menor en el uno (0.1ppm) presentando un efecto estadísticamente significativo (p=0.0396,
ANCOVA) entre ambos puntos (Figura 3); el pH y la temperatura no presentaron diferencia entre
los cuatro puntos de muestreo manteniendo valores entre 6.4 - 6.5, 28.4 - 29.3 °C respectivamente
(ANCOVA p>0.05), El rango óptimo del pH para lograr una mayor eficiencia en la biodigestión es
entre 6.6 a 7.6 [5]. El equilibrio ácido-base que tiene lugar en la operación de los biodigestores
anaerobios es muy importante por la presencia de los diversos tipos de microorganismos que están
en el medio y que requieren ser neutralizados para restituir el pH [6]. Los sólidos disueltos tuvieron
concentración de 2.2 – 2.5ppt, no presentaron diferencias significativas (Kruskal-Wallis p>0.05).
0.4
0.3
0.2
ab
ab
a
0.1
0.0
-0.1
0
1
2
3
4
5
Puntos de muestreo
Figura 3. La concentración de oxígeno disuelto fue medida al sustrato (rumen de ganado bovino) durante su
fermentación en cuatro puntos del biodigestor. Letras desiguales muestran diferencias significativas, letras
iguales no presentan diferencias.
3.3 Composición de biogás
La tabla 1 muestra la composición de biogás obtenido en la fermentación de rumen de ganado
bovino en un biodigestor de cúpula tipo Batch con un tiempo de retención de 63 días con
recirculación cada tercer día. Grant et al., reportan un rendimiento de CH4 entre 47 y 64% de una
mezcla de estiércol de pollo y vaca con un tiempo de retención de 60 días, y de 41 a 72% con una
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mezcla de estiércol de pollo y cerdo [7]. La Comisión Nacional de Energía (CNE) reporta que la
composición promedio de CH4 en la generación de biogás es de 50-79% [8].
Tabla 1. Composición del biogás
Gases
Metano (CH4)
Bióxido de carbono (CO2)
Nitrógeno (N2)
Oxígeno (O2)
Ácido sulfhídrico (H2S)
Composición
59.34%
30.95%
7.35%
2.30%
15.45 ppm
4. Conclusión
La diferencia significativa encontrada en los puntos de muestreo 1 y 4 para la concentración de
oxígeno disuelto se debió a la pendiente del terreno, sin embargo esto no afectó ni la producción de
gas metano ni la actividad hidrolítica de las bacterias debido a que en este punto del biodigestor se
encontró la mayor actividad catalítica. Las bacterias con mayor actividad hidrolítica (Klebsiella, E.
coli y Enterobacter aerogenes) son microorganismos capaces de fermentar lactosa y producir gases
H2S y H2; Shigella bacteria abundante en las últimas muestras no fermenta lactosa y no produce
ácido sulfhídrico. Este dato además de la buena recirculación que se le dio al biodigestor podría ser
la causa de la baja concentración de H2S que se obtuvo.
Referencias Bibliográficas
[1] Sandoval C. J., Carreño M., Fernando E., Vergara M. ―Caracterización microbiológica de lodos
anaerobios utilizados en el tratamiento de la fracción orgánica de los residuos sólidos urbanos‖.
Scientia et Technica Año XIII, No 35, Agosto de 2007. Universidad Tecnológica de Pereira. pp.
509-510.
[2] DeLaval, 2006. Fisiología Básica. Consultada marzo 2011. [Online]. Disponible:
http://www.delaval.es/Dairy_Knowledge/EfficientFeeding/Basic_Physiology.htm
[3] Nava C. y A. Díaz. 2001. Introducción a la Digestión Ruminal. Departamento de Nutrición
Animal. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia UNAM. Consultada marzo 2011. [Online]
Disponible: http://www.veterin.unam.mx/fmvz/enlinea/Ruminal/digest_ruminal.htm
[4] Soria M., Ferrera R., Etchevers J., Alcántar G., Trinidad J., Borges L., Pereyda G. ―Producción
de biofertilizantes mediante biodigestión de excreta liquida de cerdo‖. Revista de divulgación
científica, Terra volumen 19, No. 4, 2001. pp.354.
[5] McCarty, P.L. 1964. Anaerobic waste treatment fundamentals. Part two, Environmental
Requirements and Control. ―Chemistry and microbiology‖. Vol. 95, No. 10. 1964. pp. 122-123.
[6] Mejía M., G. 1996. Digestión anaerobica. Folleto Técnico 1. Universidad Autónoma de
Yucatán. Mérida, Yuc., México.
[7] Grant S., Marshalleck A., Brown N. ―La producción de la energía y la mitigación de
contaminación en las granjas avícolas de Jamaica y Pensilvania‖. Fourth LACCEI International
Latin American and Caribbean Conference for Engineering and Technology (LACCET‘2006).
Mayagüez, Puerto Rico. 2006. pp.6-8.
[8] Comisión Nacional de Energía. Consultada abril 2011. [Online]. Dsiponible:
http://www.cne.cl/cnewww/opencms/03_Energias/Otros_Niveles/biocombustible_tipoenergia/bioga
s.html.
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