VALIDACIÓN DE TÉCNICAS ANALÍTICAS UTILIZADAS

Rev Cubana Farm 1998;32(2):106-12
Empresa de Productos Biológicos "Carlos J. Finlay"
VALIDACIÓN DE TÉCNICAS ANALÍTICAS UTILIZADAS
EN EL CONTROL DE LA CALIDAD
Miriam Díaz de Armas,1 Idania Hernández Oramas,2 Marcia Martínez de Santelices Cuervo,3 Ma. Victoria Licea Tornés,4 Lidaila Gómez Bañobre,5 Gloria Louro González,6 Yelina
Morera Fernández7 y Esther González Hernández8
RESUMEN
Se seleccionó una metodología y se elaboró un procedimiento normativo operacional para la
validación de métodos analíticos, utilizados en la evaluación de las producciones actuales
para los requerimientos de calidad. Se comprobó la utilidad de dicho procedimiento mediante la validación de los métodos volumétricos y espectrofotométricos que intervienen en el
control de la calidad del juego de reactivos para determinación de hemoglobina en sangre.
Se demostró mediante el diseño experimental y los procedimientos estadísticos empledos
que dichos métodos son lineales (r2>0,98), exactos (Fexp.< Ftab. y texp. < ttab.), precisos (CV£3
%) y específicos (respuesta no significativa), por lo cual son confiables para ser utilizados
en la comprobación de las especificaciones de calidad del juego de reactivos.
Descriptores DeCS: JUEGO DE REACTIVOS PARA DIAGNOSTICO; HEMOGLOBINA/
análisis; CONTROL DE CALIDAD.
La validación de un método analítico
es el proceso por el cual queda establecido
por estudios experimentales que la capacidad del método satisface los requisitos
para la aplicación analítica deseada.1 Ésta
se fundamenta en la determinación de diversos parámetros que se aplican de
acuerdo con la categoría a la que
pertenezcan.2
Para el desarrollo de un nuevo produc1
2
3
4
5
6
7
8
to es necesario la utilización de métodos
analíticos que permitan cuantificar el producto en forma de materia prima o como
principio activo de la formulación con un
alto grado de confiabilidad.3
En la actualidad los laboratorios de
control de la calidad de la Industria Médico-Farmacéutica no sólo se ocupan de analizar si un producto cumple o no con sus
requisitos de calidad mediante la utiliza-
Master en Ciencias. Licenciada en Farmacia. Investigadora Agregada.
Licenciada en Farmacia. Aspirante a Investigadora.
Licenciada en Química. Investigadora Agregrada.
Licenciada en Química. Aspirante a Investigadora.
Licenciada en Matemática.
Técnica en Productos Biológicos.
Técnica en Química Industrial.
Técnica en Metrología.
106
concentración del principio activo
en la solución de cianuro de potasio
1 % y en las tabletas de ferricianuro
de potasio,4 y de la técnica utilizada
para el análisis de la cianometahemoglobina en el ensayo funcional del juego de reactivos,5 se escogieron los parámetros adecuados según los criterios de validación que aparecen reportados en el Procedimiento
Normativo Operacional 3.09.001.96 de
la Empresa de Productos Biológicos "
Carlos J Finlay".
ción de métodos analíticos establecidos
para cada uno de ellos, sino también se esfuerzan para validar cada método analítico
utilizado en el control de la calidad de sus
productos.
Basado en este criterio el laboratorio
de control químico inició la validación de
sus métodos analíticos con la que interviene en el control de la calidad de un juego de reactivos que se encuentra en fase
de desarrollo, y posteriormente será sometido a un estudio de estabilidad.
En este trabajo se muestran los resultados obtenidos en la validación de las técnicas utilizadas en el control de la calidad
del juego de reactivos para la determinación de hemoglobina en sangre, compuesto por reactivo 1 (solución de cianuro de
potasio 1g/100 mL) y reactivo 2 (tabletas
de ferricianuro de potasio 200 mg/tab),4
así como los resultados de la validación
del método de análisis de la
cianometaglobulina utilizado en el ensayo
funcional del juego de reactivos.5
Validación de métodos volumétricos
Los métodos de valoración del cianuro de potasio y el ferricianuro de potasio,
fueron validados mediante la evaluación de
los parámetros siguientes:
- Linealidad: Se prepararon 6 soluciones
MÉTODOS
1.
Requisitos previos a la validación. Para
garantizar la confiabilidad de los
resultados se aseguró el cumplimiento de los requisitos siguientes:6
- Calificación del personal en el uso de
los métodos a validar.
- Calibración de los instrumentos de
2.
medición y las medidas de capacidad
de vidrio utilizado.
Utilización de reactivos apropiados y
soluciones de trabajo valoradas.
Observación de las medidas de seguridad.
Selección de los parámetros apropiados de acuerdo con la clasificación del
método analítico y el tipo de
validación a realizar:
Para validar las técnicas analíticas
utilizadas para la evaluación de la
-
107
107
de concentraciones entre 70 y 120 %,
incluyendo el 100 %. Las concentraciones fueron las siguientes: cianuro de
potasio (7,0; 8,0; 9,0; 10,0; 11,0; 12,0
mg/mL); ferricianuro de potasio (4,6;
5,3; 6,0; 6,6; 7,3; 8,0 mg/mL). Se realizaron 3 réplicas de cada una. Se
determinó la recta de regresión lineal,
así como los coeficientes r y r2. Para el
test de linealidad se consideró el coeficiente de variación para el factor de
respuesta f (CVf), la desviación estándar
relativa de la pendiente (Sbrel) y la t de
Students práctica (Tp) y la F de Fisher
práctica (Fp) para p= 0,01.
Precisión (repetibilidad, reproducibilidad y robustez)
Repetibilidad y reproducibilidad: Se
evaluaron las muestras durante 10 d. La
concentración teórica del cianuro de
potasio fue de 1,0 mg/mL y la del
ferricianuro de potasio 6,6 mg/mL. Se
realizaron 4 réplicas por la mañana y 4
réplicas por la tarde, y se analizaron
estadísticamente los resultados obteni-
- dos en el día y entre días. Se determinó
- Linealidad: Se evaluó la linealidad del
el coeficiente de variación (CV) y se aplicó
la prueba Anova de clasificación simple.
Robustez: Se analizó mediante un diseño factorial 23, según la tabla de
Yourden y Steiner,6 considerando las
variables: reactivo recién preparado,
reactivo con días de preparado, temperaturas de trabajo diferentes (4 °C
y temperatura ambiente) y 2 analistas;
se realizó cada determinación por triplicado.
Exactitud: Para el método del
ferricianuro de potasio se realizó un
ensayo de recuperación, analizando 3
muestras de concentraciones diferentes (5,3; 6,6 y 8,0 mg/mL) por triplicado, preparadas a partir de un placebo.
sistema instrumental al estudiar 6 soluciones por triplicado en un rango de
concentraciones de 20 a 200 % (4,2;
8,5; 12,6; 16,8; 18,2; 21,0 g/dL). Se
comprobó estadísticamente ésta y se
evaluó la linealidad del método al
analizar 6 soluciones por triplicado en
un rango de concentraciones de 80 a
120 % (6,2; 8,2; 10,2; 12,6; 16,4; 18,2
g/dL). Se determinó la recta de
regresión lineal y se calcularon los
coeficientes de r y r2. Para el test de
linealidad se hallaron el coeficiente
de variación (CVf) para el factor de
respuesta f; la desviación estándar
relativa de la pendiente (Sbrel) y la F de
Fisher práctica (Fp) para p = 0,05.
Precisión (repetibilidad, reproducibilidad y robustez).
Repetibilidad y reproducibilidad: Se
consideraron muestras de concentrac i o n e s a l t a s ( 1 8 , 0 g / d L ) ,
medias (12,0 g/dL) y bajas (4,8 g/
dL) de hemolizados de producción
nacional y se estudiaron por el método
propuesto durante 10 d, mañana y
tarde, realizando 4 repeticiones en
cada sesión. Se determinó el coeficiente de variación (CV) y se aplicó
la prueba Anova de clasificación
simple.
Robustez: Se analizó mediante un diseño factorial 23 según la tabla de
Yourden y Steiner,6 considerando las
variables: 2 tiempos de incubación de
la reacción (15 y 40 min), 2 temperaturas de trabajo (temperatura ambiente
y 37 °C) y 2 analistas; se realizó cada
determinación por triplicado.
Exactitud: Se comparó el juego de
reactivos diseñado con un juego de
reactivos de la firma comercial
Wiener, en un total de 100 muestras
de pacientes en paralelo y por
duplicado. Los resultados obtenidos
por ambos métodos se compararon
mediante un análisis de regresión lineal.
-
Se halló la varianza, la G de Cochran y
la t de Student experimental para p = 0,05
en el ensayo de recuperación.
Para el método del cianuro de potasio
se preparó un patrón de analito al 100 %
de concentración (1g/100 mL) y una
solución placebo a la cual se añadió la
cantidad necesaria de analito para obtener
la concentración al 100 %; ambas soluciones se valoraron utilizando el mismo
método analítico. Se determinó la F de
Fisher y la t de Student para p = 0,05.
- Especificidad: Considerando el factor
degradante, previamente seleccionado, se evaluaron conjuntamente una
solución de producto degradado y una
solución patrón al 100 % de concentración, utilizando el mismo método
analítico.
-
-
Validación de un método espectrofotométrico
El método de la cianometahemoglobina utilizado en el ensayo funcional
del juego de reactivos para determinación
de hemoglobina en sangre, se validó de
acuerdo con los criterios establecidos
según bibliografía consultada.7
Los parámetros son los siguientes:
108
- Sensibilidad: Los límites de detec-
pleadas en la cuantificación de los principios activos cianuro de potasio y
ferricianuro de potasio, cumplen con los
rangos de aceptación de acuerdo con el
estudio estadístico realizado para los
parámetros estudiados (linealidad, precisión, exactitud y especificidad), en las concentraciones seleccionadas y las condiciones de trabajo establecidas.
En la tabla 2 se observan los valores
obtenidos para el ensayo funcional del juego de reactivos desarrollado, considerando para su evaluación los parámetros de
linealidad, precisión a concentraciones bajas, medias y altas del analito (como se recomienda en la bibliografía consultada);
además de exactitud y sensibilidad del método, los cuales se encuentran dentro de
los rangos de aceptación establecidos.
ción y cuantificación se calcularon
teóricamente utilizando el valor de la
ordenada en el origen obtenida para la
recta de calibración en el ensayo de
linealidad. Los límites calculados se
comprobaron experimentalmente mediante el análisis repetitivo de 10
muestras de 2 soluciones preparadas
a las concentraciones obtenidas y los
resultados fueron evaluados por un
Anova de clasificación simple.
RESULTADOS
En la tabla 1 se presentan los resultados obtenidos en la validación de 2 métodos volumétricos. Como se puede observar en esta tabla, las técnicas analíticas em-
TABLA 1. Resultados de la validación de métodos volumétricos
Parámetro
Linealidad
Procesamiento
estadístico
Valoración del
cianuro de potasio
Valoración del ferri- Criterios de
cianuro de potasio
aceptación
. Coeficientes de
correlación y
determinación
. Test de linealidad
r2 = 0,9989
r = 0,9994
r2 = 0,9925
r = 0,9962
r2 ³ ,98
r £ 0,99
CVf = 0,63 %
Sbrel = 0,84 %
texp = 118,50
Fexp = 14092,62
FAexp = 2,64
CVf = 1,89 %
Sbrel = 1,98 %
texp = 46,05
Fexp = 2120,78
FAexp = 4,17
CVf £ 5 %
Sbrel £ 2 %
texp ³ t(16; 0,01) =2,92
Fexp ³ F(1; 16; 0,01) = 8,53
FAexp³FA (4; 12; 0,01)=5,41
a = -0,15
IC(a) = (-0,32; 0,10)
texp = 1,95
CVrepet=0,40 %
a = -0,18
IC(a) = (-0,17; 0,29)
texp = 1,27
CVRepet = 0,28 %
a »0
IC(a) incluye el 0
texp < t(16; 0,05) = 2,12
CVRepet £ 3 %
CVReprod = 1,83 %
CVReprod £ 3 %
CVReprod < 2 CVRepet
Diferencias no sigDiferencias no significativas
nificativas
Fexp = 1,31
Fexp < F(9; 70; 0,01) = 2,82
Diferencias no signi- Diferencias no sigficativas para
nificativas
cada factor
Fexp < F(9; 9; 0,05) = 3,18
texp < t(18; 0,05) = 2,10
Gexp = 0,30
Gexp < G(3; 3; 0,05) = 0,87
texp = 0,13
texp < t(8; 0,05) = 2,30
No hay respuesta
Respuesta no
significativa
. Test de proporcionalidad
Precisión
. Coeficientes de
. Repetibilidad y
variación
Reproducibilidad
. Robustez
Exactitud
Especificidad
. Test de Anova
de clasificación
simple
. Factorización
.
.
.
.
Test
Test
Test
Test
de Fisher
de Student
de Cochran
de Student
-
Diferencias no significativas
Fexp =1,43
Diferencias no significativas para
cada factor
Fexp = 1,35
texp = 0,51
No significativa
109
109
CVReprod = 1,60 %
TABLA 2. Resultados de la validación del método espectrofotométrico
Parámetro
Linealidad
Procesamiento estadístico
Coeficientes de
correlación y
determinación
Test de linealidad
Método
r 2 =0,9997
r = 0,9998
r2 ³ 0,98
r³ 0,99
CVf = 0,61 %
Sbrel = 0,25 %
texp = 399,86
Fexp = 159887,55
FAexp = 3,68
CVf = 0,45 %
Sbrel = 0,41 %
texp = 242,64
Fexp = 58876,97
FAexp = 4,98
CVf £ 5 %
Sbrel £ 2 %
texp ³ t(16; 0,01) = 2,92
Fexp³ F(1;16; 0,01) = 8,53
FAexp£ FA(4;12; 0,01) = 5,41
-
a = 0,15
a»0
IC(a) = (-0,20; 0,50) IC(a) incluye el 0
texp = 0,009
texp < t(16; 0,05) = 2,12
C onc. bajas
Conc. medias Conc. Altas
CVRepet = 0,43 % 0,16 %
0,14 %
CVReprod = 0,11 % 0,22 %
0,02 %
Test de Anova
de clasificación
simple
Diferencias no significativas
Fexp = 0,31
1,21
Robustez
Factorización
Diferencias no significativas
Exactitud
Análisis de regresión lineal
Sensibilidad
Coeficiente de
variación
Criterios de aceptación
Sistema instrumental
r2 = 0,9990
r = 0,9995
Test de proporcionalidad
Precisión
Repetibilidad y Coeficientes de
Reproducibilidad variación
Resultados
r2 =
Fexp
IC(b)
IC(a)
b =
a =
b =
0,9960
= 8856,66
= (0,96; 1,01)
= (-0,09; 0,43)
0,9859
0,15
2,88
LD = 0,16 g/dL
LC = 0,52 g/dL
DISCUSIÓN
Al evaluar estadísticamente la
linealidad de los métodos analíticos validados y del sistema instrumental para el
método
espectrofotométrico,
se
obtuvieron coeficientes de correlación (r)
y de determinación (r2) que demuestran
que existe regresión entre las variables
concentraciones y las respuestas medidas.
Para confirmar que dicha regresión era
lineal se aplicaron diferentes test de
linealidad, considerando el análisis de la
110
0,68
CVRepet£ 3 %
CVReprod £ 3 %
CVReprod < 2 CVRepet
Diferencias no significativas
Fexp < F(9; 70; 0,01) = 2,82
Diferencias no significativas
para cada factor
r2 >0, 98
Fexp > F(1;98;0,01) = 6,85
IC(b) incluye el 1
IC(a) incluye el 0
b» 1
a
3
LD =
b
CV = 0,52 %
CV £ 3 %
CV = 0,62 %
10 a
LC =
b
varianza (FAexp) el tests más riguroso que
corroboró la linealidad de los métodos y
del sistema instrumental. De igual forma
se comprobó que se cumple la condición
de proporcionalidad y el error sistemático
de cada método es despreciable.
Por otra parte, el estudio de precisión
mostró una buena repetibilidad y
reproducibilidad de los resultados de
acuerdo con los criterios de aceptación,
mientras que los factores estudiados para
cada método en el ensayo de robustez no
influyeron significativamente en los
resultados, por lo cual podemos considerar que dichos métodos son precisos.
Para evaluar la exactitud se aplicaron
diferentes procedimientos experimentales
y estadísticos que responden a las
características propias del método analítico validado. En el caso del método de valoración del ferricianuro de potasio se
comprobó que el rango de concentraciones estudiado no influye en la variabilidad
de los resultados, ya que se cumplió con
el criterio del test de Cochran (G exp),
además no se obtuvieron diferencias significativas entre la recuperación media y
el 100 % al aplicar el test de Student (texp),
confirmando la buena exactitud del
método.
Se determinó igualmente que el método de valoración del cianuro de potasio
es exacto, ya que no existen diferencias
significativas entre los resultados, ni por
su varianza (test de Fisher) ni por la diferencia de medias (test de Student); mientras que para el método de determinación
de la cianometahemoglobina se obtuvo un
98 % de equivalencia con el método de referencia de la firma comercial Wiener y
una recta de regresión lineal: y=0,9859 x
+ 0,1754, que garantiza la exactitud del
método.
Además, se comprobó que ambos métodos volumétricos son específicos, ya que
los productos de degradación en un caso
no interfieren en la valoración, mientras
que en el otro la respuesta es insignificante.
Los límites de detección (LD) y
cuantificación (LC) calculados para el
método de determinación de la
cianometahemoglobina, fueron corroborados experimentalmente. El método es sensible, ya que no se encontraron diferencias
significativas entre los resultados obtenidos para cada límite y los coeficientes de
variación para cada uno de ellos fueron
menores que el coeficiente de variación
permitido para el método.
Todos los resultados obtenidos en la
validación de los métodos volumétricos y
espectrofotométrico permiten asegurar
que son confiables, ya que cumplen los criterios de validación reportados por Castro
y otros en 1989 y por Aguilar y otros en
1992. Además ambos métodos pueden ser
utilizados tanto en el control de la calidad
como en el estudio del juego de reactivos
para determinación de hemoglobina en sangre.
De esta manera se comprobó experimentalmente la utilidad del procedimiento
establecido para la validación de métodos
analíticos; y queda abierto el camino a la
validación de todos los métodos analíticos en el control de la calidad.
AGRADECIMIENTOS
Agradecemos a la licenciada Yaimí Farias
Domínguez por su desinteresada colaboración y
sus sabios consejos en la interpretación estadística de los resultados.
SUMMARY
A methodology was selected and a normative operative procedure was prepared for the
validation of analytical methods used in the evaluation of the present productions for quality
requirements. The usefulness of this procedure was proved by the validation of the volumetric
and spectrophotometric methods taking part in the quality control of the reagent kits for
determining haemoglobin in blood. It was demostrated by the experimental design and the
statistical procedures used that such methods are lineal (r2 > 0.98), exact (Fexp < Ftab and Texp < ttab),
precise (CV £ 3 %) and specific (no significative response). Therefore, they are reliable and
may be used in the checking of the quality specifications of the reagent kits.
Subject headings: REAGENT KITS, DIAGNOSTIC; HEMOGLOBINS/analysis; QUALITY
CONTROL.
111
111
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. Aguilar G, Alcántara A, Chárvel A, García JL, Garzón A, Guerrero ME, et al. Validación de métodos analíticos.
Comité de Elaboración de Guías Oficiales de Validación de la Dirección General de Control de Insumos para la
Salud, SSA. Colegio Nacional de Químicos Farmacéuticos Biológicos. México AC, 1992.
2. United States Pharmacopoeial Convention. USP XXII. United States Pharmacopoeia. 22 ed. Easton: Mark
Printing; 1990:1225,1710.
3. Rampazoo P. Standardisation and Validation of Analytical Methods in the Pharmaceutical Industry. II Farmaco
1990;45:807-15.
4. Analar. Standards for Laboratory Chemicals. 6 ed. London: Analar Standards LTD; 1967:390-1, 395.
5. Beal PJ, Cook LP, Lovric VA. Hemoglobin. Pathology 1974;6:251-4.
6. Castro M, Gascón S, Pujol M, Sans JM, Vicente L. Validación de métodos analíticos. Asociación Española de
Farmacéuticos de la Industria. Monografía AEFI. Sección Catalana. Comisión de Normas de Buena Fabricación
y Control de la Calidad. Edición Hewlett Packard, 1989.
7. Calpena AC, Escribano E, Fernández C. Validación de los métodos analíticos. Farm Clin 1991;7(9):749-58.
Recibido: 24 de noviembre de 1997. Aprobado: 31 de enero de 1998.
Lic. Miriam Díaz de Armas. Empresa de Productos Biológicos "Carlos J. Finlay". Infanta No. 1162, municipio
Centro Habana, Ciudad de La Habana, Cuba.
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