QUANTA LiteTM dsDNA

NOVA Lite® ANA KSL
Para Diagnóstico In Vitro
Código de Producto:
708380, 708390
508385.10, 508380.30
Complejidad de CLIA: Alto
Aplicación
NOVA LiteTM ANA KSL es un ensayo por inmunofluorescencia indirecta para el screening y la determinación
semicuantitativa de anticuerpos antinucleares (ANA), antimitocondria (AMA), anti músculo liso (ASMA) y
anticuerpos parietales gástricos (GPA) en suero humano. La presencia de anticuerpos antinucleares puede
usarse en conjunción con otros tests serológicos y resultados clínicos para ayudar en el diagnóstico de
Lupus Eritematoso Sistémico (LES) y otras enfermedades reumáticas o del tejido conectivo.
Sumario y Explicación de la prueba
El término “anticuerpos antinucleares” describe una variedad de autoanticuerpos que reacciona con los
constituyentes de los núcleos celulares incluyendo el ADN, ARN y varias proteínas y ribonucleoproteínas.1
Estos autoanticuerpos aparecen con elevada frecuencia en pacientes con enfermedades reumáticas o del
tejido conectivo, y especialmente en el caso del lupus eritematoso sistémico. De hecho, prácticamente todos
los pacientes con LES son ANA positivos. Esta sensibilidad diagnóstica ha conducido a la incorporación del
ensayo ANA en los Criterios Revisados para la Clasificación de Lupus Eritematoso Sistémico de 1982
realizados por una subcomisión del Colegio Americano de Reumatología.2 Aunque los ensayos ANA son un
excelente test de screening para el LES (un resultado negativo prácticamente permite descartar la presencia
de LES3 activo), no son, de ningún modo, un ensayo específico. Los pacientes con otras enfermedades del
tejido conectivo, como la artritis reumatoide, el escleroderma y la dermatomiositis, dan con frecuencia
resultados positivos, y también pueden observarse valoraciones de ANA bajas en otros estados patológicos
y en la población normal.4 Pueden obtenerse resultados positivos para ANA en pacientes que han sufrido
quemaduras graves o infecciones víricas y también se han dado casos en algunas personas normales
sanas, especialmente en las poblaciones de mayor edad. Debido a esta ausencia de especificidad, se
recomienda que todas las muestras con resultados positivos para ANA se valoren según el punto final y que
se lleven a cabo ensayos más específicos para autoanticuerpos anti-ADN de doble cadena (dsDNA) y para
autoanticuerpos anti-antígeno nuclear extraíble (ENA).1-3
Se suelen detectar altos niveles de AMA asociados a la cirrosis biliar primaria. Se pueden detectar bajas
valoraciones de AMA en otros trastornos hepáticos como la hepatitis crónica activa y la cirrosis
criptogénica.5,6 Se encuentran niveles elevados de ASMA en el suero de un 70% de los pacientes con
hepatitis crónica activa. Además, el 50% de estos pacientes son ANA positivos, mientras que un 25%
presentan valoraciones de AMA bajas. Pueden observarse valoraciones de ASMA bajas en infecciones
víricas, tumores malignos e individuos normales.5,7
Los anticuerpos antiparietales gástricos se dan en un 90% de las muestras de suero de pacientes con
anemia perniciosa. Junto con otros datos clínicos y de laboratorio, un resultado GPA positivo ayuda a
distinguir la anemia perniciosa autoinmune de otras anemias megaloblásticas. Aunque se detecta en menos
del 2% de la población normal menor de 20 años, la incidencia de los anticuerpos antiparietales gástricos
aumenta en las mujeres mayores de 40 años y puede estar presente en hasta un 16% de la población
normal de más de 60 años.8,9
La inmunofluorescencia indirecta es el método de referencia para los tests de ANA, AMA, ASMA y GPA. Los
substratos más comunes son secciones finas de órganos de roedor o algunos tipos de líneas celulares. El
substrato seleccionado para el kit NOVA Lite® ANA KSL consiste en secciones de riñón, estómago y hígado
de ratón. El conjugado consiste en anticuerpos anti-IgG humana purificada por afinidad.
Procedimiento de trabajo
En la técnica de inmunofluorescencia indirecta, las muestras se incuban con un substrato de antígenos y
posteriormente se lavan para eliminar los anticuerpos que no han reaccionado. El substrato se incuba con
un conjugado específico marcado con fluoresceína y posteriormente se lava para eliminar el reactivo que no
se ha enlazado. Cuando se observan a través de un microscopio de fluorescencia, las muestras positivas
para autoanticuerpos mostrarán una fluorescencia de color verde manzana en las áreas de la célula o del
núcleo donde se ha enlazado el autoanticuerpo.
Reactivos
1.
Portaobjetos ANA KSL (Riñón/estómago/hígado de ratón) substrato, 4 o 8 pocillos/portaobjetos con
desecante
Kits solamente
2.
3.
4.
Conjugado de anticuerpos anti-IgG humana (Cabra) marcados con fluoresceína en tampón con Azul
de Evans y un 0.09% de azida sódica
Patrón Homogéneo ANA, 1 vial de tampón con un 0.09% de azida sódica y suero humano con
anticuerpos antinucleares, prediluido
Control Negativo para Sistemas IFA, 1 vial de tampón con un 0.09% de azida sódica y sin
anticuerpos de suero humano anti-ANA KSL, prediluido
1
5.
6.
7.
Concentrado de PBS (40x)
Medio de Montaje, 0.09% de azida sódica
Cubreobjetos
Advertencias
1.
2.
3.
4.
Todo material de origen humano usado en la preparación de los controles para este producto se ha
examinado resultando negativo para anticuerpos contra HIV, HBsAg, y HCV por métodos aprobados
por la FDA. Ningún método puede sin embargo ofrecer garantía completa que HIV, HBV, HCV o
otros agentes contagiosos estén ausentes. Por lo tanto, los Control de Patrón Homogéneo ANA y
Control Negativo para Sistemas IFA deben manejarse como si fueran material potencialmente
contagioso.10
Dado que se utiliza azida sódica como conservante, este producto puede ser tóxico por ingestión o
absorción a través de piel o mucosas. La azida sódica puede reaccionar con el plomo o cobre de las
tuberías para formar azidas metálicas potencialmente explosivas. Si se utilizan desagües para la
eliminación de reactivos se recomienda lavarlos con abundante agua para prevenir la formación de
dichas azidas metálicas.
Se recomienda utilizar el equipo protector apropiado al trabajar con este kit.
Los reactivos derramados deben limpiarse inmediatamente. Siga las normas aplicables en su
laboratorio acerca de la eliminación de residuos.
Precauciones
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Este producto es para ser usado en el Diagnóstico In Vitro.
La sustitución de componentes diferentes de los incluidos en el sistema puede generar resultados
inconsistentes.
Un lavado incompleto o ineficiente de los pocillos puede dar lugar a un fondo elevado.
La adaptación de este ensayo para su uso en procesadores automáticos u otros aparatos de
manipulación de líquidos, totalmente o en parte, puede producir diferencias en los resultados de la
prueba respecto a los obtenidos con el procedimiento manual. Es responsabilidad de cada
laboratorio el validar que su procedimiento automático produzca resultados dentro de unos límites
aceptables.
Una gran variedad de factores puede afectar al rendimiento del ensayo. Entre estos factores pueden
incluirse la temperatura de los reactivos al inicio del proceso, la potencia de la lámpara del
microscopio, la fiabilidad y reproducibilidad de la técnica de pipeteo usada, las condiciones de
lavado y la duración de los tiempos de incubación. Se requiere trabajar de una manera
consistente para obtener resultados precisos y reproducibles.
El conjugado anti Humano IgG puede experimentar cambios de color con el tiempo debido a la
exposición a la luz, estos cambios, sin embargo, no afectan a su rendimiento.
Se recomienda seguir estrictamente el protocolo.
Condiciones de Almacenaje
1.
2.
Guardar todos los reactivos del kit en nevera a 2 - 8°C. No congelar. Los reactivos son estables
hasta la fecha de caducidad si son almacenados y manipulados correctamente.
La solución de lavado diluida es estable 4 semanas a 2 - 8°C.
Recolección de Muestras
Este kit requiere suero como muestra. La adición de azida u otros conservantes a las muestras puede
afectar adversamente los resultados. No deben utilizarse muestras contaminadas, tratadas por calor o que
contengan partículas visibles. Deben asimismo evitarse las muestras lipémicas o hemolizadas.
Tras la recolección de las muestras de sangre, el suero debe ser separado del coágulo. El documento CLSI
(antes NCCLS) H18-A2 recomienda las siguientes condiciones de almacenaje para muestras: 1) Guardar
las muestras a temperatura ambiente no más de 8 horas. 2) Si el ensayo no se va completar en 8 horas,
refrigerar la muestra a 2 - 8°C. 3) Si el ensayo no se va completar entre 48 horas, o para enviar las
muestras, congelar a - 20°C o a temperatura inferior. Una vez descongeladas las muestras deben agitarse
bien antes de utilizarse.
Procedimiento
Materiales Suministrados (kits)
708380
25
1
1
1
2
1
1
8-pocillos Portaobjetos ANA KSL Substrato
15mL FITC Conjugado de anticuerpos anti-IgG
1.0mL Control de Patrón Homogéneo ANA
1.0mL Control Negativo para Sistemas IFA
25mL Concentrado de PBS (40x)
10mL Medio de Montaje
25 Cubreobjetos
2
708390
10
1
1
1
1
1
1
4-pocillos Portaobjetos ANA KSL Substrato
7mL FITC Conjugado de anticuerpos anti-IgG
0.5mL Control de Patrón Homogéneo ANA
0.5mL Control Negativo para Sistemas IFA
25mL Concentrado de PBS (40x)
7mL Medio de Montaje
10 Cubreobjetos
Material suministrado (portaobjetos)
508385.10 10 x 4- pocillos con substrato ANA KSL
508380.30 30 x 8- pocillos con substrato ANA KSL
Material necesario no incluido
Micropipetas con capacidad para pipetear de 15 a 1000μL
Agua destilada o desionizada
Frascos lavadores o pipetas Pasteur
Cámara húmeda
Recipiente de 1L de capacidad (para diluir PBS)
Cubeta de Coplin
Microscopio de fluorescencia con una emisión de fluorescencia de 495nm y un filtro de barrera de 515nm
Metodología
Antes de empezar
1.
2.
3.
Llevar todos reactivos y muestras a la temperatura ambiente (20 - 26°C) y agitar.
Diluya el concentrado de PBS: IMPORTANTE: Diluya el concentrado de PBS a 1:40 añadiendo el
contenido de la botella de concentrado de PBS a 975mL de agua destilada o desionizada y mezcle
completamente. El tampón de PBS se utiliza para diluir las muestras de pacientes y como tampón de
lavado. El tampón diluido puede almacenarse un máximo de 4 semanas a una temperatura de 2 8°C.
Diluya las Muestras de los Pacientes:
a.
Screening Inicial: Diluya las muestras de los pacientes a 1:20 con un tampón de PBS diluido
(esto es, añada 50μL de suero a 950μL del tampón de PBS).
b.
Titulación: Realice series de diluciones dobles a partir de la dilución inicial de screening para
todas las muestras positivas con el tampón de PBS diluido (p. ej. 1:40, 1:80,... 1:5120).
Procedimiento de Ensayo
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Preparación de los portaobjetos con substrato: Espere a que el portaobjetos con substrato
alcance la temperatura ambiente antes de extraerlo de su funda. Etiquételo y colóquelo en una
cámara húmeda adecuada. Añada 1 gota (70 – 90µL) de control positivo y negativo sin diluir en los
pocillos 1 y 2 respectivamente. Añada 1 gota (70 – 90µL) de la muestra del paciente diluida a los
pocillos restantes.
Incubación del portaobjetos: Incube el portaobjetos durante 30 + 5 minutos en una cámara
húmeda (una servilleta de papel humedecida colocada plana en el fondo de un recipiente cerrado de
plástico o cristal le permitirá mantener las condiciones de humedad adecuadas). No permita que el
substrato se seque durante el procedimiento de ensayo.
Lavado de los portaobjetos: Tras la incubación, utilice un frasco de lavado o una pipeta para lavar
suavemente el suero con el tampón de PBS diluido. Oriente el portaobjetos y el chorro del tampón
PBS de forma que le permita evitar, en la medida de lo posible, que la solución pase por encima de
varios pocillos a la vez. Evite dirigir el chorro directamente sobre los pocillos para que no se
dañe el substrato. Si está deseado, ponga los portaobjetos en un tarro de Coplin del almacenador
intermediario diluido de PBS por hasta 5 minutos.
Adición de conjugado fluorescente: Expulse el exceso de tampón PBS. Sitúe el portaobjetos de
nuevo en la cámara húmeda y cubra inmediatamente cada pocillo con una gota de conjugado
fluorescente. Incube los portaobjetos durante otros 30 + 5 minutos.
Lavado de los portaobjetos: Repita el paso 3.
Cubreobjetos: Los procedimientos para los cubreobjetos varían de un laboratorio a otro; sin
embargo, recomendamos el siguiente procedimiento:
a.
Sitúe un cubreobjetos en una toallita de papel.
b.
Aplique el medio de Montaje siguiendo una línea continua en el borde inferior del
cubreobjetos.
c.
Elimine el exceso de tampón PBS y ponga en contacto del borde inferior del portaobjetos con
el borde del cubreobjetos. Deje caer suavemente el portaobjetos sobre el cubreobjetos de
forma que el medio de Montaje fluya hacia el borde superior del portaobjetos sin que se
formen burbujas de aire ni se queden atrapadas.
3
Control de Calidad
El Control de Patrón Homogéneo ANA y el Control Negativo para Sistemas IFA deberían ensayarse para
cada portaobjetos con el fin de asegurar que todos los reactivos y los procedimientos se han llevado a cabo
de la forma adecuada. Los controles adicionales de suero adecuados deberán prepararse alicuotando las
mezclas de suero humano y almacenándolo a < -70oC. Para que los resultados se consideren válidos,
deben cumplirse todos y cada uno de los siguientes criterios. Si alguno de ellos no se cumple, el resultado
del test se considerará inválido y el ensayo deberá repetirse.
1.
El Control de Patrón Homogéneo ANA sin diluir debe ser > 3+.
2.
El Control Negativo para Sistemas IFA debe ser negativo.
Interpretación de los Resultados
Reacción Negativa. Se considerará una muestra como negativa si la tinción nuclear específica es igual o
inferior al Control Negativo para Sistemas IFA. Las muestras pueden mostrar diversos grados de tinción de
fondo debido a los anticuerpos heterófilos o a niveles inferiores de autoanticuerpos contra algunos
constituyentes del citoplasma, como las proteínas contráctiles.
Reacción Positiva. Tinción específica de los núcleos celulares. Se puede observar toda una serie de
patrones de tinción dependiendo de la especificidad de los anticuerpos.
Determine el patrón de tinción de cada muestra y pondere su intensidad de acuerdo con los siguientes
criterios:
4+
Fluorescencia verde manzana brillante
3+
Fluorescencia verde manzana claro
2+
Fluorescencia positiva claramente visible
1+
La menor fluorescencia específica que permite diferenciar claramente una estructura celular
de la fluorescencia de fondo
Interpretación de los patrones. Pueden presentarse diversos patrones de tinción nuclear y citoplasmática
dependiendo de los tipos y de las cantidades relativas de autoanticuerpos presentes en la muestra. Pueden
presentarse los siguientes patrones de tinción:
Homogéneo: Tinción sólida del núcleo con o sin enmascaramiento aparente de los nucleolos.
Antígenos Nucleares presentes: ADN de doble cadena, ADN de cadena simple, histonas.
Enfermedad asociada: Las valoraciones elevadas sugieren la presencia de LES; las valoraciones
inferiores sugieren la presencia de LES u otras enfermedades del tejido conectivo.
Periférico: Tinción sólida, primordialmente alrededor de la región más exterior del núcleo y tinción más
débil hacia la parte central del núcleo.
Antígenos Nucleares presentes: ADN de doble cadena, ADN de cadena simple, DNP, histonas.
Enfermedad asociada: Las valoraciones elevadas sugieren la presencia de LES; las valoraciones
inferiores sugieren la presencia de LES u otras enfermedades del tejido conectivo.
Moteado: Tinción fina o de apariencia granulosa del núcleo, generalmente sin tinción fluorescente de los
nucleolos.
Antígenos Nucleares presentes: Sm, RNP, Scl-70, SS-A, SS-B, y otros sistemas
antígeno/anticuerpo todavía sin caracterizar.
Enfermedad asociada: Las valoraciones elevadas sugieren la presencia de LES (anticuerpo antiSm), enfermedades combinadas del tejido conectivo (anticuerpo anti-RNP), escleroderma
(anticuerpo anti-Scl-70), o el complejo síndrome de Sjogren-sicca (anticuerpo anti-SS-B); las
valoraciones inferiores sugieren otras enfermedades del tejido conectivo.
Nucleolar: Tinción con motas grandes y gruesas en el núcleo, generalmente un número inferior a 6 por
célula, con o sin motas finas ocasionales.
Antígenos Nucleares presentes: 4-6S ARN y otros antígenos nucleares desconocidos.
Enfermedad asociada: Las valoraciones elevadas son frecuentes en el escleroderma y el síndrome
Sjogren.
Mitocondrial (AMA): Una tinción granular discreta de los túbolos renales distales y/o proximales. Las
células parietales metabólicamente activas del estómago contienen elevadas concentraciones de
mitocondrias y pueden presentar también tinciones positivas.
Antígenos presentes: Varios tipos de antígenos mitocondriales.
Enfermedad asociada: Las valoraciones elevadas indican cirrosis biliar primaria.
Músculo liso (ASMA): Se considera específica de los ASMA una tinción discreta de las capas musculares
internas de los vasos sanguíneos del riñón y/o las capas musculares del estómago.
Antígenos presentes: Actina.
Enfermedad asociada: Las valoraciones altas son indicadoras de la hepatitis crónica activa de tipo
autoinmune.
Anticuerpos anticélula parietal gástrica (GPA): Tinción del citoplasma de la célula parietal. Estas células
se encuentran en la mucosa gástrica del estómago. Puesto que los AMA también tiñen las células
parietales, deben comprobarse también los túbulos renales antes de concluir la presencia de GPA.
Si la muestra es GPA positiva, los túbulos renales serán negativos.
Antígenos presentes: Bomba de protones (h/K ATPasa).
Enfermedad asociada: Estos anticuerpos se encuentran en los casos de anemia perniciosa y
gastritis atrófica.
4
Es importante que el usuario sepa hasta qué punto puede confiar en los patrones para determinar la
especificidad de los autoanticuerpos, excepto en el caso del patrón nuclear y el patrón centromérico, en los
que cada uno de los antígenos está muy bien definido y sus patrones son característicos. Ya que muchos
autoanticuerpos, o combinaciones de los mismos, pueden inducir un patrón moteado u homogéneo, se
recomienda la realización de ensayos de seguimiento de los autoanticuerpos (tales como para el ADN de
doble cadena o ENA) en todas las muestras moteadas u homogéneas.
Limitaciones del Procedimiento
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Las valoraciones elevadas de ANA sugieren enfermedades del tejido conectivo pero no deberían
tener una validez diagnóstica. Los resultados de ANA deberían considerarse en combinación con
otros resultados serológicos así como con el historial clínico del paciente.
Los patrones de ANA cambian frecuentemente cuando la muestra se valora según el punto final.
Este fenómeno se debe a que los anticuerpos con menor valoración están por debajo de la
sensibilidad del sistema, puesto que se ensaya con una muestra más diluida.
Varios factores externos influyen en la sensibilidad del ensayo, como pueden ser el tipo de
microscopio de fluorescencia utilizado, la potencia y antigüedad de la lámpara, los aumentos
utilizados, el sistema de filtros y la subjetividad del técnico.
Si se utiliza un filtro paso banda en lugar de un filtro de barrera 515, puede observarse un aumento
de la tinción de los artefactos.
Para etiquetar los portaobjetos utilice solamente un lápiz. La utilización de cualquier otro instrumento
de escritura puede ocasionar una tinción de los artefactos.
Todas las cubetas de Coplin que se utilicen en el lavado de los portaobjetos deben estar limpias de
residuos de tintura. La utilización de cubetas de Coplin con residuos de tintura puede provocar la
tinción de los artefactos.
Los resultados de este ensayo deben utilizarse conjuntamente con hallazgos clínicos y otras
pruebas serológicas.
La funcionalidad del ensayo no ha sido establecida para matrices diferentes del suero.
Los portaobjetos comercializados por separado se clasifican como “reactivos específicos para los analitos”.
Salvo que se trate de componentes del kit NOVA Lite® ANA KSL, las características analíticas y de
rendimiento no están establecidas.
Valores Esperados
Se ensayó una serie de muestras de pacientes con enfermedades del tejido conectivo, pacientes con
enfermedades hepáticas autoinmunes, pacientes con anemia perniciosa, así como 200 muestras aleatorias
de donantes de sangre, utilizando el kit NOVA Lite® ANA KSL. Los resultados se muestran a continuación:
Número de positivos* con NOVA Lite® ANA KSL
Grupo de pacientes
Número
ANA
AMA
ASMA
GPA
LES
105
101
5
9
1
Lupus inducido por la medicación 24
24
0
0
0
Artritis reumatoide
40
28
1
1
0
Hepatitis crónica activa
25
10
4
21
0
Cirrosis biliar primaria
30
5
27
3
0
Anemia perniciosa
15
0
0
0
14
Normales
200
3
2
6
1
* La cantidad total de positivos puede superar la cantidad de pruebas realizadas debido a la presencia de
patrones múltiples en un solo pocillo.
5
Referencias
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
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Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control and
Prevention/National Institutes of Health, Fifth Edition, 2007
Fabricante:
INOVA Diagnostics, Inc.
9900 Old Grove Road
San Diego, CA 92131
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May 2010
Revision 16
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