Diapositiva 1 - Genética y Biología Molecular

Objetivos del tema
El alumno...
V.
METABOLISMO
DEL DNA
Revisará los diferentes procesos metabólicos en los
que el DNA es la molécula central, i.e., la replicación, la
reparación y la recombinación. Describirá la
enzimología de los diferentes procesos y destacará la
importancia de la fidelidad de la replicación y de la
necesidad de conservar la estructura y función del
DNA.
1. Replicación del
DNA
1.1. Comprenderá la importancia de los eventos que rigen la
duplicación del material genético.
1.2. Describirá el mecanismo semiconservativo de replicación de
DNA basado en la estructura de la doble hélice.
1.3. Asociará la replicación semidiscontinua del DNA con la
estructura de la doble hélice.
1.4. Distinguirá entre la cadena continua y discontinua en el DNA
molde.
1.5. Explicará la función de un origen de replicación.
1.6. Describirá las características generales mínimas de un
origen de replicación.
1.7. Distinguirá entre un origen de replicación eucarionte y un
origen de replicación procarionte.
1.8. Comprenderá la replicación bidireccional del DNA a partir de
un origen.
1.9. Describirá la función de la proteína DnaA en el
reconocimiento y unión al origen de replicación procarionte, así
como su función en la apertura de la zona de origen.
1.10. Describirá la función de helicasa (DnaB) en la apertura de
la doble hélice durante la replicación, así como la función de la
proteína DnaC.
1.11. Describirá la función de la proteína SSB durante la
replicación.
Conoci- Compren- Aplicamiento
sión
ción
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
Objetivos del tema
El alumno...
1.12. Comprenderá la importancia de la existencia de un extremo
3’OH para la síntesis de DNA y reconocerá la importancia de
primasa en la formación de la horquilla de replicación.
1.13. Distinguirá a las dos principales DNA polimerasas
procariontes.
1.14. Describirá las funciones de las diferentes de polimerasa III.
1.15. Comprenderá los conceptos de procesividad y fidelidad y
los asociará a las subunidades responsables.
1.16. Describirá la formación de fragmentos de Okazaki.
2. Topología del
DNA
Conoci- Compren- Aplicamiento
sión
ción
X
X
X
X
X
1.17. Reconocerá las actividades enzimáticas en polimerasa y su
función en la maduración de los fragmentos de Okazaki.
1.18. Comprenderá la función de ligasa en la maduración de los
fragmentos de Okazaki.
1.19. Comparará el reconocimiento del origen de replicación
procarionte y eucarionte.
1.20. Describirá la función de las principales DNA polimerasas
eucariontes (alfa, delta, epsilon).
1.21. Comparará la terminación de la replicación en eucariontes
y procariontes.
1.22. Describirá la función de las DNA telomerasas en la
replicación del DNA eucarionte.
2.1. Relacionará la topología del DNA con la manera en que
afecta los procesos de replicación, reparación y recombinación.
2.2. Describirá la función de las DNA topoisomerasas y DNA
girasa durante la replicación del DNA.
2.3. Comprenderá el mecanismo catalítico de las
topoisomerasas.
2.4. Distinguirá entre las topoisomerasas tipo I y tipo II.
X
2.5. Describirá la función de topoisomerasa IV durante la
terminación de la replicación en procariontes.
X
X
X
X
X
X
X
X
X
Replicación del DNA
Con base en la estructura del DNA.....
1.
La doble hélice de DNA con su
apareamiento entre cadenas
complementarias sugiere que
cada cadena sirve como molde
para la síntesis de una cadena hija
2.
Hay conservación en el contenido
A/T y G/C en todas las células de
un mismo organismo
Posibles mecanismos de replicación del DNA
Hebras parentales
Estructura del DNA
Doble Hélice
Replicación
Semiconservadora
Cadenas
complementarias
Conservadora
Dispersa al azar
¿Pruebas experimentales?
Hebras hijas
Experimento de Meselson y Stahl
Alimentar cultivos de E. coli con
fuente de 14N (ligero) o 15N (pesado)
y purificar el DNA
Purificar el DNA centrifugarlo
en un gradiente de CsCl
DNA con 14N
DNA con 15N
Migración
El DNA que tiene 15N migrará más en el
gradiente de CsCl, mientras que el DNA
que tiene 14N migrará menos.
Experimento de Meselson y Stahl
Comprobación del mecanismo semiconservador de replicación
E. coli se cultiva por
muchas generaciones
en un medio con N
“pesado”
Los resultados son
consistentes con
el mecanismo de
replicación semicoservadora
Luego se pasa a un
medio con N “ligero”
solo por una
generación
Se deja otro
ciclo de
replicación
DNA
bacteriano
durante
replicación
¿Es la replicación del DNA unidireccional o
bidireccional?
En bacterias, que tienen genoma circular cerrado
Replicación del DNA de E.
coli por 1.5 generaciones
en presencia de
nucleótidos marcados
Autoradiografía
Demostración experimental
Experimento de Gyurasits y Lake
DNA de Bacillus subtilis
Pulso de baja intensidad
en el inicio
Pulso de alta intensidad
Resultados del experimento de Gyurasits y Lake
• Horquillas en ambas direcciones muestran marca fuerte,
lo que indica que fueron activas durante el segundo
pulso. Ambas horquillas surgen de un punto inicial que
es el origen de replicación. Las horquillas se mueven en
direcciones opuestas.
• Evidencia de que la replicación del DNA es bidireccional
y a partir de un origen de replicación
Reacción química de la replicación
del DNA
DNA polimerasa
DNAn + dNTP
(DNA)n+1 + PPi
• Cada cadena de DNA sirve como molde para la
síntesis de una cadena nueva
• Los substratos son desoxiribonucleósidos 5’
fosfato (dNTPs: dATP, dTTP, dGTP, dCTP)
(nucleótidos)
• Las cadenas de DNA se separan y se sintetiza
la hebra complementaria de cada una, de manera
simultánea
• Las DNA polimerasas añaden dNTPs al molde
de la cadena madre en dirección 5’ a 3’
La DNA polimerasa requiere un
3’OH libre para poder polimerizar
Se produce un ataque nucleofílico del 3’ OH al
fosfato  del dNTP entrante
dNTP



DNAn
molde
PPi
(DNA)n+1



Pero si…
La horquilla de replicación es bidireccional
Las cadenas
de DNA son
antiparalelas
Y la DNA
polimerasa solo
sintetiza en
dirección 5’ a 3’
Entonces….
¿Qué ocurre en la horquilla de replicación para que se puedan
sintetizar las dos hebras de manera complementaria y antiparalela?
Mecanismos para explicar la síntesis de
las cadenas complementarias
Síntesis continua requiere
que las DNA polimerasas
sintetisen DNA de 5’->3’ y
de 3’ -> 5’
Síntesis discontinua las dos
cadenas nuevas se sintetizan
en fragmentos, en dirección
de 5’->3
Síntesis semidiscontinua
una cadena se sintetiza en
forma continua y la otra en
forma discontinua, en
dirección de 5’->3.
La replicación del DNA es semidiscontinua
Experimentos de Reiji Okazaki
Durante la replicación
del DNA se sintetizan
fragmentos que varían
entre 1000 a 2000 nt en
E. coli y entre 100 a 200
nt en eucariotes
¿Explicación?
Replicación semidiscontinua:
Una hebra se sintetiza en forma continua y la otra discontinua
Cadena adelantada o guía (leading)/ Cadena retrasada (lagging)
5’
3’
5’
*
*
3’
3’
3’
5’
5’
3’
5’
5’
3’
Como la dirección de síntesis de la cadena discontinua es
opuesta a la dirección de apertura de la horquilla, se comienza
una nueva cadena.
En cambio, la cadena continua simplemente se sigue alargando.
Como la DNA polimerasa no puede polimerizar una hebra
nueva de DNA si no cuenta con un cebador que tenga un
3’OH libre, es necesario que estos cebadores sean
sintetizados previamente a que la DNA polimerasa actúe
Hebra “guía”
continua
Fragmentos
de Okazaki
Hebra
“retrasada”
discontinua
El crecimiento de ambas cadenas es en sentido 5’
3’
Los cebadores son sintetizados por una
DNA primasa
La DNA primasa emplea ribonucleótidos para sintetizar los cebadores
Generalidades de la
Replicación de DNA
•
•
•
•
•
Semiconservadora
A partir de un origen de replicación
Bidireccional
Semidiscontinua
Requiere de cebadores de RNA
La replicación
se divide en
tres fases
• Inicio
• Alargamiento
• Terminación
El inicio de la replicación comienza en el:
Origen de Replicación
En bacteria hay un solo origen de replicación
(OriC en E. coli)
Secuencias repetidas en
tandem (13 pb)
Cajas DnaA (9 pb)
1.
Activación por metilación de A en GATC
2.
Unión de DnaA “abre el DNA”
3.
Unión de DnaB y DnaC- actividad helicasa
ATP dependiente
4.
Unión de SSB para mantener separadas las
cadenas de DNA
DnaA, DnaB, DnaC y HU
en OriC
DnaA reconoce OriC y es la que inicia
Se unen 30 monómeros de DnaA en el OriC
Luego le siguen otras proteínas
Proteína DnaA
• La proteína DnaA es un monómero de 52
kDa. Tiene una muy alta afinidad por ATP
(Kd = 0.03 M) y lo hidroliza lentamente a
ADP en una forma dependiente de DNA.
Tiene un dominio de unión a ATP.
• Se une con alta afinidad y de forma
cooperativa a las cajas dnaA de oriC y se
ha calculado una estequiometría de 30
subunidades de dnaA por oriC.
Proteína DnaB. Helicasa
Monómeros de 50 kDa que forman
un homohexámero.
Tiene dominios que se requieren
para:
• Interacción con la proteína DnaC
• Unión a DNA de cadena sencilla
• Unión a DNA de cadena doble
• Activación de la primasa
• Hidrólisis de ATP
La helicasa rodea una de las hebras del
DNA duplex y se desplaza logrando la
apertura de la doble hélica por exclusión
estérica.
Una hebra es excluida del canal interno,
mientras que la otra hebra es retenida en
el interior del anillo.
DnaB. Helicasa
Rompe los
puentes de
hidrógeno
entre las bases
Reconocimiento del oriC y formación del primosoma
2. La unión del complejo HUATP-DnaA desestabiliza la
doble hélice en la región P1
1. La proteína HU causa
torsiones en el DNA y
facilita su unión a la
proteína DnaA
3. Unión de
DnaB a la
región abierta
del DNA.
4. Unión de
DnaB y DnaC
Proteína de unión a DNA de cadena sencilla
(SSB, Single-strand DNA binding proteins)
Las proteínas SSB se une al DNA de cadena sencilla con alta
afinidad y así previene que se vuelva a formar el híbrido DNADNA.
Proteínas de unión a cadena sencilla
(SSB)
La unión de SSB es cooperativa y ayuda a la
polimerasa facilitando su actividad
Estructura de las SSB
• Una vez abierto el DNA, comienza la
síntesis
(Alargamiento)
DnaG Primasa
La primasa es una proteína
monomérica de 60 kDa que sintetiza
oligo-ribonucleótidos (cebadores o
primers) de 10 a 12 unidades de
longitud, usando rNTPs. Es
dependiente de molde y la
secuencia corresponde al origen de
replicación.
El extremo 3‘ del último
ribonucleótido es extendido como
DNA por la acción de la DNA
polimerasa. Se forma una unión
covalente entre RNA y DNA
DNA primasa
RNA polimerasa
que sintetiza los
cebadores de RNA
Hay tres polimerasas en Escherichia coli
La DNA polimerasa III cataliza la reacción de
polimerización durante la replicación
Con un alto grado de fidelidad
La actividad de DNA polimerasa
cataliza la adición de un dNTP al
extremo 3’-OH de un
polidesoxinucleótido
complementario al DNA molde, por
un mecanismo de desplazamiento
nucleofílico.
Propiedades de las DNA Polimerasas
FIDELIDAD Y PROCESIVIDAD
La FIDELIDAD se refiere al
seguimiento exacto de la secuencia
que sirve como molde. En promedio,
las DNA pols, 1 error por cada 108 nts
La actividad de exonucleasa 3’ 5’ de
la DNA polimerasa contribuye a la
fidelidad pues tiene actividad
correctora (proofreading).
Competencia cinética entre la actividad de Polimerasa y de Exonucleasa
La PROCESIVIDAD se refiere a la capacidad de una DNA
polimerasa de elongar una cadena de DNA por muchos nucleótidos
antes de disociarse del complejo que forma con el sustrato.
La DNA polimerasa I tiene una procesividad baja. Es distributiva.
La DNA polimerasa III tiene una procesividad alta.
Actividad de
exonucleasa 3’ 5’
Subunidades de la DNA polimerasa III de E. coli
Sub
# por
holoenzima
Mr
Función

2
132,000
Actividad polimerasa

2
27,000
Exonucleasa 3’5’

2
10,000
Se requiere para la union de
DnaB

2
71,000

2
52,000

1
35,000
’
1
33,000

1
15,000

1
12,000

4
37,000
Unión estable al molde,
dimerización del núcleo
Abrazadera que carga las
subunidades  al DNA
Pinzas que forman una rueda
sobre el DNA y aseguran
óptima procesividad
Núcleo de
la
polimerasa
Abrazadera
complejo 
proteínas 
Pinza rodante
La DNA pol III es altamente
procesiva gracias a las
subunidades 
Modelo del
dímero para la
DNA Polimerasa
Función en la horquilla de replicación
La DNA pol III es la que replica las dos hebras a la
vez
Corrige errores con actividad exonucleasa 3’5’
La replicación de la hebra retrasada se interrumpe
cada 1000 nt approx
DNA polimerasa I
La DNA pol I rellena los
espacios entre fragmentos
de Okazaki
Utiliza actividad
exonucleasa 5’3’ para
eliminar los cebadores de
RNA
Función de la DNA polimerasa I en
la replicación
Función de la DNA ligasa en la
replicación
1. Formación del
intermediario
Enzima ATP
2. Transferencia
del adenilo al 5’-P
3. Formación
del enlace
fosfodiéster
La DNA ligasa de E. coli es una enzima de 75 kDa. Es muy lábil.
Terminación de la replicación en
procariontes
Las dos horquillas de
replicación se aproximan a la
misma región que contiene
las cajas Ter. Son secuencias
de 22 pb, tambien llamados
sitios de terminación. Están
presentes en tandem (seis)
en forma invertida.
A estas secuencias se unen
las proteínas TUS (TBP).
La presencia de estas
proteínas de unión a DNA
causa que se detenga el
avance de las horquillas.
Tus: termination utilization
substance TBP: Termination
binding protein. Proteína de 36
kDa que afecta la actividad de
la DNA helicasa (DnaB).
TERMINACIÓN. Desenrrollamiento y Síntesis
reparativa.
Las dos hebras duplex, productos de la
replicación están enrrolladas
La topoisomerasa IV contribuye a la
desnaturalización y descatenación de las
hebras. Mutantes en el gene de TopoIV
exhiben cromosomas que no se han
separado totalmente.
Ocurre síntesis reparativa para llenar los
huecos
¿Cómo se asegura la célula que
su DNA se replica sólo una vez?
Porque la replicación sólo inicia cuando el DNA está completamente
metilado . Así, cuando la hebra nueva, recién sintetizada no está
todavía metilada, la replicación no se puede iniciar nuevamente.
Las enzimas Dam
metilasas regulan
el inicio en el
origen de
replicación
Los cromosomas eucariontes tienen múltiples
origenes de replicación
No todos los orígenes de replicación
se activan al mismo tiempo
REPLICACIÓN DE DNA EN EUCARIONTES
En eucariontes, la replicación comienza en muchos sitios a lo
largo de los cromosomas.
Los orígenes de replicación de
metazoarios no están definidos por
una secuencia específica, como el oriC
Sino que consisten en:
• Sitios de inicio de alta frecuencia
• Sitios de inicio de baja frecuencia
Los orígenes de replicación se establecen durante la fase G1 del
ciclo celular y dependen de varios parámetros:
Estructura nuclear
Estructura de la cromatina
Secuencia de DNA
Modificaciones en el DNA
Permite modificar el número y localización de los orígenes de
replicación
DNA polimerasas en células eucariotas
Proliferating-Cell Nuclear Antigen (PCNA)
• PCNA es una proteína de 29
kDa.
• Forma un trímero alrededor del
DNA.
• Incrementa la procesividad de
la DNA pol delta hasta 40 veces.
•Se ha demostrado su interacción
in vitro con más de 50 proteínas.
Entre ellas:
• Ciclina D1, cdk2 y el inhibidor
de cdks
Comparación de la replicación del DNA
en E. coli y en células humanas
E. coli
Cél humanas
Cantidad de DNA, pb/ cél.
3.9 106
109
Velocidad avance horquilla m/min
30
3
Velocidad de replicación, nt / seg
850
60-90
Número de orígenes de replicación
/ célula
1
103-104
Tiempo 1 replicación genómica (h)
0.27
8
Tiempo 1 división celular (h)
0.33
24
Los orígenes de replicación
más estudiados son de
levadura
Origen de replicación en eucariotas
Complejo prereplicativo
Terminación de la replicación en
eucariontes
El dilema de los cromosomas lineales
Durante la terminación
en procariontes, hay
hidrólisis del cebador
pero el extremo 3’ de la
cadena funciona para
cebar la síntesis que así
completa la cadena.
Sin embargo, en los
cromosomas lineales de
eucariontes, después de
eliminar al cebador no hay
forma de completar la
síntesis.
Esto implica que los cromosomas se irían acortando después de
cada ronda de duplicación
Terminación en eucariontes
El dilema de los cromosomas lineales. La Solución.
Telomerasa. Enzima que adiciona
secuencias cortas que se repiten
en los extremos de los
cromosomas. Telómeros.
Las secuencias repetidas varían
entre especies:
Tetrahymena
TTGGGG
Humano
TTAGGG
Paramecium
TTGGGG
Trypanosoma
TTAGGG
Arabidopsis
TTTAGG
La telomerasa es una DNA polimerasa que utiliza
RNA como molde
La telomerasa está
compuesta por dos
subunidades:
• Subunidad catalítica
(proteína)
• Subunidad de RNA
asociada
Funciona como molde
para alargar una de
las cadenas.
Mecanismo de acción de la telomerasa
Mecanismo de acción de la telomerasa
El resultado:
La telomerasa está presente en
células embrionarias, pero en
células somáticas su actividad es
muy baja.
Topología del DNA
• Tiene implicaciones en los procesos de
Replicación, Recombinación y Reparación
La replicación
causa
superenrollamiento
La replicación causa
superenrollamiento
DNA duplex
parental relajado
DNA
circular
Replicación
Región
Región
superenrollada
superenrollada
Las proteínas DnaB y DNA
Girasa resuelven el problema
Proteína
DnaB
DNA Girasa
En eucariontes, durante la
replicación hay modificaciones
en los octámeros de histona
Las histonas parentales se
distribuyen
proporcionalmente entre las
nuevas cadenas
El patrón de nucleosomas se hereda a
las cadenas hijas
Las topoisomerasas
Las topoisomerasas
Tipo I
cortan 1 sola hebra
Las topoisomerasas
Tipo II
cortan las 2 hebras
Topoisomerasa IV
Girasa
Topoisomerasa IV
participa en la
terminación de la
replicación de
moléculas circulares
Decatenación