APÉNDICE 1 Preparación del Medio de Cultivo Eagle Modificado

APÉNDICE 1
Preparación del Medio de Cultivo Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM)
El DMEM es una modificación del medio basal medium Eagle (BME), contiene una
mayor concentración de aminoácidos y vitaminas, así como la adición de antibióticos y
la suplementación con suero fetal bovino.
Reactivos

DMEM (GIBCO CAS. 12100-061)

L-arginina. HCl (SIGMA A-5131)

L-asparagina anhidro (SIGMA A-4159)

NaHCO3 (SIGMA S-5761)

Piruvato de sodio (Biowhittaker Walkersville, CAS 13-115E)

L-glutamina (Biowhittaker Walkersville, CAS17-605E

HEPES (SIGMA-ALDRICH. H-3784)

Penicilina/ estreptomicina

β- mercaptoetanol (Merck. 4213005)
Aparatos

Báscula digital (Sartorius)

Bomba de vacío

Sistema de filtración (sterile aseptic system, Millipore corporation, Bredford, MA
01730)

Campana de flujo laminarn(Purifer classII Biosafety cabinet, delta series,
LABCONCO)

Pipetor

Micropipetas de volumen variable

Baño de agua (Isotemp 220 Fisher Scientific)
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
Incubador de CO2 (Isotemp, Fisher Scientific. USA)
Equipo Auxiliar

Pipetas serológicas de 10 mL

Espátulas

Filtro Millipore de 0.45 µm

Vaso de precipitados de 1L

Agua desionizada

Frascos de vidrio de 500 y 1000 mL

Probeta de 1000 mL

Matraz Kitazato de 1L

Puntas para micropipeta
Procedimiento
1. Para preparar un litro de medio, verter aproximadamente 300 mL de agua deionizada en
un vaso de precipitados de 1L,posteriormente llevar a cabo las mediciones que se
enlistan a continuación:
Sustancia
Cantidad
DMEM
13.37g
L-arginina HCl
0.116g
L-asparagina anhidro
0.036 g
NaHCO3
2.0 g
HEPES
2.38 g
β- mercaptoetanol
3.5 µL
Piruvato de sodio
10.0 mL (100 mM)
L- glutamina
7.5 mL (200 mM)
Penicilina
1.0 mL (1000 X)
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2. Los reactivos se agregan al vaso de precipitados con agua al momento de medirlos
excepto los que se señalan en la tabla con itálicas, pues estos deben de añadirse en la
campana una vez que el resto de los reactivos se encuentren disueltos en un volumen
final de 1L.
3. Posteriormente se prepara el sistema de filtración conteniendo una membrana de 0.45µm
y se conecta a un matraz Kitazato de una salida, en la cual se coloca la manguera del
sistema de vacío.
4. Una vez que se filtra todo el medio se deposita en un frasco estéril de 1L y se etiqueta
debidamente (Indicando el contenido, nombre de quien lo elaboro y la fecha).
5. Se realiza una prueba de esterilidad colocando aproximadamente 5 mL del medio de
cultivo en un tubo falcón estéril, el cual se incuba por 48 horas bajo condiciones
similares a las de los cultivos celulares. Se revisa que el tiempo señalado no se presente
evidencia de contaminación.
6. Mantener el medio de cultivo bajo refrigeración a 4°C hasta su uso.
Suplementación del medio DMEM con 5% de suero fetal bovino (D5F).
Depositar 95 mL del medio de cultivo en un frasco estéril de vidrio y agregar 5 mL de
suero fetal bovino previamente decomplementado mediante calentamiento a 56°C
durante 45 minutos en un baño de agua.
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APÉNDICE 2
Preparación de Reveladores Específicos Para Grupos de Metabolitos
Cloruro Férrico

Cloruro férrico
5g

Agua destilada
100 mL
Reactivo de Dragendorff

Carbonato de bismuto
5g

Ioduro de potasio
25 g

Ácido clorhídrico concentrado
12 mL

Agua destilada
100 mL
En un baño de hielo, disolver e carbonato de bismuto en 50 mL de agua, adicionando
cuidadosamente el ácido; posteriormente agregar gradualmente el ioduro de potasio;
después de la completa disolución, completar el volumen para 100 mL con agua.
Reactivo de Liebermann-Burchard

Ácido sulfúrico concentrado
0.1 mL

Anhídrido acético
5 mL
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