Ensayo de toxicidad aguda con el pez Xiphophorus montezumae

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Ensayo de toxicidad aguda
con el pez Xiphophorus
montezumae
Guillermina Alcaraz Zubeldia,
Maribel Badillo Alemán
y Cecilia Vanegas Pérez
C lasificación
del ensayo :
AE
Principio de la prueba
Los lineamientos que se presentan se centran en la evaluación de la toxicidad
aguda de compuestos tóxicos en juveniles de peces poecílidos de Xiphophorus montezumae. La especie se propone como organismo de prueba para la
evaluación del efecto tóxico agudo de contaminantes en cuerpos de agua
dulceacuícolas. En los ensayos agudos, la respuesta final a evaluar es la mortalidad de los organismos, al cabo de un tiempo determinado de exposición a
compuestos tóxicos. La sensibilidad de los organismos se determina a través
de la estimación de la concentración letal media durante el tiempo (x) de la
exposición (CL50-x h).
El pez cola de espada de Moctezuma, X. montezumae, es una especie endémica de México que se distribuye en el noroeste de México en las cuencas
del río Tamesí en Tamaulipas, al norte de Veracruz y en los afluentes del río
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Amplia experiencia
Ensayos de toxicidad aguda con el pez Xiphophorus montezumae
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Pánuco en San Luis Potosí. Sin embargo, su localidad tipo es en el manantial Capuchinas y Río Verde, cerca de Rascón en San Luis Potosí (Espinoza,
1993).
X. montezumae es un organismo bentopelágico de agua dulce, con forma
corporal alargada, comprimida y con un pedúnculo caudal muy ancho. Las
hembras miden en promedio 6.5 cm de longitud y los machos 5 cm. Su coloración es amarilla en todo el cuerpo, con escamas marginadas en negro en la
región dorsal. Son organismos con dimorfismo sexual externo; los machos
presentan una elongación en la parte baja de la aleta caudal con forma de pincho o espada y su aleta anal se transforma en gonopodio al llegar a la madurez
sexual (figura 9.1). El gonopodio empieza a distinguirse alrededor de los 4
meses de edad y se caracteriza por un ensanchamiento del tercer radio anal,
con una segmentación más evidente. De tal manera, los machos juveniles no
se distinguen de las hembras hasta que empiezan a desarrollar el gonopodio
y la espada (Espinoza, 1993).
Figura 9.1. Dimorfismo sexual en organismos adultos de Xiphophorus montezumae
A) hembra y B) macho
A
B
Material
Acuarios de vidrio para el mantenimiento de los organismos de 40 L (26 x 30
x 50 cm) y 80 L (60 x 40 x 37 cm). Acuarios de vidrio de 20 L (41 x 26 x 20
cm) para los bioensayos. Cristalería: vasos de precipitados, matraces Erlen-
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meyer, probetas, etc. Espátulas. Accesorios de acuario: mangueras, piedras de
aireación, redes de mano, etc. Alimento en hojuelas (45% proteína); alimento
vivo (Artemia sp.).
Equipo
Pipetas automáticas de diferentes volúmenes (5µL -50µL, 50µL-100µL,
100µL-1000µL), balanza analítica, oxímetro, potenciómetro, termómetro, salinómetro, sistema de filtración mecánica, uv y biológica, sistema de aireación
continua, sistema para el control del fotoperíodo, equipo para la determinación
de amonio total y nitrito (por ejemplo espectrofotómetro, electrodos, etc).
Reactivos
Sal de acuario, tiosulfato de sodio y reactivos para las técnicas de determinación de amonio total y nitrito (por ejemplo azul de indofenol y sulfanilamida).
Organismos de prueba
Origen de los organismos
Los organismos juveniles de X. montenzumae que se utilicen en las pruebas
de toxicidad deben ser capturados en alguna de las localidades tipo de San
Luis Potosí (Manantial Capuchinas y Río Verde) o bien ser descendientes
directos de organismos silvestres reproducidos y criados en el laboratorio o
en algún acuario comercial.
Se recomienda la reproducción de estos organismos en condiciones controladas debido a su fácil cultivo y al gran número de descendientes que se pueden obtener. Para garantizar la calidad de los reproductores se deben utilizar
organismos adultos sanos. Durante su traslado al laboratorio, desde el sitio de
captura en el medio natural o desde un ambiente de cultivo, los organismos
deben ser manipulados lo menos posible para disminuir el estrés.
Para la reproducción de X. montezumae se colocan parejas de un macho y
una hembra en un acuario de 40 L de capacidad durante una semana, a una
temperatura de 25°C. Posteriormente, se retira al macho dejando a la hembra
sola hasta el parto. Una vez que hayan nacido las crías, éstas se transfieren a
un acuario de crianza de 20 L de capacidad, no excediendo más de 30 crías
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por acuario. Al cabo de un mes de nacidas, las crías deben ser trasladadas
a un acuario de 40 L hasta que alcancen la talla deseada. La aireación del
acuario que contiene a las crías debe ser mínima para que toda la energía
de los recién nacidos se traduzca en un excelente crecimiento. El acuario de
cría debe carecer de grava en el fondo, ya que la grava provoca que las crías
queden atrapadas en el fondo hasta que mueren.
En condiciones controladas de laboratorio, las hembras de X. montezumae
llegan a tener entre 30 y 100 crías por parto y hasta 3 partos con un solo apareamiento. El tiempo de gestación es de 30 días aproximadamente. Inmediatamente después del nacimiento las crías deben ser alimentadas. Éstas pueden
alcanzar en un lapso de 2.5 a 3 meses la talla de 30 mm de longitud estándar,
talla recomendada para realizar las pruebas de toxicidad.
Para los ensayos de toxicidad se recomienda utilizar descendientes de
diferentes padres, (siempre y cuando sean de la misma edad) para considerar
la variabilidad biológica normal de la especie. De tal manera, las crías descendientes de diferentes padres pueden ser agrupadas para su mantenimiento.
Aclimatación y mantenimiento de los organismos
Las condiciones físicas y químicas del agua en que se mantienen los organismos
en el laboratorio dependen del origen y del estadio de los mismos. Los reproductores capturados del medio natural o transferidos de un ambiente de cultivo
se mantienen durante los primeros cinco días en las condiciones de captura o
cultivo. Posteriormente, la temperatura se ajusta a una tasa de 1 °C/día, hasta
alcanzar las condiciones de evaluación requeridas (siempre dentro de los intervalos adecuados para la especie). Una vez alcanzadas las condiciones requeridas,
los adultos de X. montezumae deben ser mantenidos en éstas al menos durante
siete días antes de dar inicio a la etapa de reproducción.
Durante el período de aclimatación y mantenimiento de los organismos
los parámetros fisicoquímicos deben mantenerse en condiciones adecuadas
para la especie y los diferentes estadios (reproductores, crías y juveniles)
(tabla 9.1).
El control de la concentración de amonio, nitrito y nitrato en el agua se
mantiene a través de recambios parciales de agua. El volumen y frecuencia
del recambio de agua debe permitir mantener bajos los niveles de los compuestos nitrogenados para evitar su acumulación y acción tóxica sobre los
organismos (Lewis y Morris, 1986; Randall y Tsui, 2002). Durante la etapa
de mantenimiento y aclimatación, el fotoperíodo se debe mantener 12 horas
Ensayos de toxicidad aguda con el pez Xiphophorus montezumae
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Tabla 9.1. Parámetros fisicoquímicos para el mantenimiento adecuado de los diferentes
estadios de Xiphophorus montezumae en condiciones controladas
Temperatura
Dureza
Amonio
pH
Oxígeno Disuelto
Salinidad
20 a 27 °C
60-80 mg/L CaCO3
<1.0 ppm
7a8
6.0 mg/L
0.1
luz :12 horas oscuridad (de 3000 a 4000 luxes de luz). Diariamente se deben
registrar y controlar los parámetros fisicoquímicos del agua.
El agua utilizada tanto para el mantenimiento de los organismos como
para los bioensayos de toxicidad debe ser previamente filtrada con filtro mecánico, carbón activado y UV, garantizando así las condiciones de calidad de
la misma. El agua no debe estar en contacto con bombas o tuberías metálicas
y debe prepararse agregando 14.5 g de sal de acuario (comercial) y 3.5 g de
tiosulfato de sodio por cada 20 L de agua, manteniéndola en oscuridad bajo
aireación intensa, al menos 48 horas antes de su uso.
Los peces se mantienen en tanques medianos o grandes (40 a 80 L de
capacidad) equipados con sistemas de filtro biológico o filtros de cascada,
considerando una densidad de 1 g de peso húmedo (PH) de organismo por
cada 2 L de agua. Debe cuidarse que el sistema de filtración genere poca
corriente.
Para la alimentación de los reproductores y juveniles se recomienda una
dieta combinada de alimento comercial en hojuelas y de tipo congelado o
vivo (Artemia sp). Para las crías, se recomienda el suministro ad libitum de
alimento vivo (nauplios de Artemia sp). El patrón de alimentación diario
consiste en el suministro de alimento vivo o congelado por las mañanas y de
hojuelas comerciales por las tardes (tabla 9.2); las hojuelas comerciales deben
tener un mínimo de 45% de contenido proteico (tabla 9.3).
Durante el período de aclimatación y mantenimiento, los organismos deben ser revisados constantemente. Si se presenta más del 10% de mortalidad
en el grupo, se observan indicadores de enfermedad o se detecta algún tipo
de condición funcional o conductual inadecuada, el lote debe ser descartado
para experimentación.
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Tabla 9.2. Patrón de alimentación para el mantenimiento de diferentes
estadios de Xiphophorus montezumae en condiciones de laboratorio
Estadio
Alimento comercial en hojuelas,
Suministro
% proteína
de alimento comercial
Crías
Juveniles
Reproductores
45
45
45
No
Ad libitum
10% PHc
Suministro de
alimento vivo
(Artemia sp)
ad libitum
10 % PHc*
10 % PHc*
*PHc: Peso húmedo corporal
Tabla 9.3. Valor nutricional de las hojuelas comerciales suministrados como alimento a los
diferentes estadios de X. montezumae
Composición
Porcentaje %
Proteína cruda
Grasa cruda
Fibra cruda
Humedad
Fósforo
Vitamina C
46
8.0
2.0
6.0
1.3
3 mg/kg
Compuestos tóxicos de prueba
Para evaluar la toxicidad aguda de compuestos aislados, éstos deben tener un
elevado grado de pureza (grado reactivo). Si el compuesto tóxico de prueba
(compuesto aislado; extracto) es soluble en agua, la solución madre debe ser
preparada en agua deionizada. Si el compuesto tóxico de prueba es estable en
solución, debe prepararse una solución madre única al inicio de las pruebas. Si
el compuesto tóxico de prueba no es estable en solución (por ejemplo sujeto a
oxidación u otras transformaciones químicas o biológicas) una nueva solución
debe prepararse previo a su uso. Si el compuesto tóxico de prueba no es soluble
en agua, una solución acuosa madre debe ser obtenida por la solución inicial
del compuesto en un disolvente acarreador (por ejemplo acetona, etanol, propilenglicol, etc.). En este caso, en las pruebas experimentales se debe considerar
Ensayos de toxicidad aguda con el pez Xiphophorus montezumae
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un grupo testigo del disolvente, evaluando el volumen máximo adicionado.
Si se evalúan mezclas complejas (por ejemplo efluentes, lodos, etc.), la mezcla
inicial será considera como la “solución madre” (100%) a partir de la cual se
efectuarán las diluciones experimentales correspondientes.
El volumen máximo de la solución madre que se adiciona a los acuarios
experimentales debe ser el menor volumen posible que no modifique las
características del medio experimental (por ejemplo volumen y pH), preferentemente no mayor del 0.5% respecto al volumen total. La concentración
del compuesto problema debe ser determinada analíticamente en submuestras
del medio al menos al inicio y al término de los bioensayos. Sin embargo,
si se presumen transformaciones o cambios en las concentraciones de los
compuestos tóxicos se deben evaluar las concentraciones reales durante el
transcurso de las pruebas. Si se efectúan recambios del medio, se deben evaluar
las concentraciones reales antes y después del recambio.
Procedimiento de prueba
Cámaras experimentales
Los bioensayos deben ser de tipo estático o semi-estático. El agua que se
utiliza en las pruebas debe ser previamente preparada como se señaló con
anterioridad.
Los acuarios experimentales deben ser de vidrio, preferentemente de 20
L de capacidad. Los acuarios deben ser lavados previamente con detergente
libre de fosfatos y disolventes; posteriormente deben ser enjuagados con HCl
al 10% y en seguida con agua corriente y destilada antes de su uso (UNEP/
FAO/IAEA, 1986).
Para las pruebas, se recomienda, por cada gramo de tejido húmedo de
animal (g PH), utilizar un mínimo de 1 L de agua (1 g PH/L), y de manera
ideal una relación de 2 L/ g PH.
Parámetros fisicoquímicos
En el transcurso de las pruebas deben registrarse y mantenerse constantes el
pH, la temperatura, la dureza y el oxígeno disuelto (la aireación debe ser de
burbujeo fino y constante durante el tiempo de exposición). El fotoperíodo
se mantiene en 12 horas luz: 12 horas oscuridad (entre 3,000 y 4,000 luxes
de luz).
134 Ensayos para agua dulce
Alimentación
La alimentación de los animales se debe suspender 24 horas antes iniciar las
pruebas y durante el desarrollo de las mismas (96 horas), con el fin de evitar
interferencia por los procesos digestivos. Para períodos de exposición mayores, se recomienda alimentar a los organismos; el suministro del alimento
debe ser de manera ideal una vez al día (sólo de hojuelas comerciales; 10%
PHc) retirando el alimento remanente después del período de alimentación
(2 horas) y posteriormente retirando las heces producidas. En este caso, el
agua de los acuarios debe ser recambiada diariamente, preferentemente el 75%
del volumen total, y las soluciones y concentración de los compuestos tóxicos
deben ser ajustadas apropiadamente. En el caso del 100% de recambio se recomienda contar con series adicionales de acuarios, con las concentraciones
respectivas de los compuestos problema para transferir cuidadosamente a
los organismos.
Organismos de prueba
Los organismos experimentales expuestos a los diferentes niveles del(los)
compuesto(s) tóxico(s) deben ser similares en talla (longitud estándar) y en
peso. Para ello, una submuestra representativa de los organismos provenientes del mantenimiento (mínimo 30 organismos) debe ser pesada y medida
para garantizar la evaluación de peces de pesos homogéneos. Se recomienda
que los bioensayos se realicen con juveniles de X. montezumae de 0.8 a 1.1 g
PH. Los organismos que mueran durante el transcurso de las pruebas o que
sobrevivan a la misma deben ser pesados y medidos al final de la prueba.
Durante el transcurso del procedimiento experimental, los organismos deben
manipularse lo menos posible para evitar la posible influencia del estrés sobre
la respuesta tóxica.
Duración de las pruebas y recambio
El período de exposición depende de los objetivos que se persigan. Las pruebas
de toxicidad aguda deben realizarse por un período de 96 horas. En caso de
que sea necesario prolongar las pruebas por períodos mayores a 96 horas, los
organismos deberán ser alimentados durante este tiempo para evitar alteraciones nutricionales. Cuando se requiera alimentar a los animales, se deben
realizar recambios de agua después del retiro de las heces.
Ensayos de toxicidad aguda con el pez Xiphophorus montezumae
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Las soluciones del compuesto problema deben ser renovadas al menos
una vez cada 24 horas. En todos los casos en que se realicen recambios se
deben tomar muestras de las soluciones de exposición antes y después de los
recambios para determinar analíticamente las concentraciones del compuesto
tóxico problema.
Pruebas de intervalo de toxicidad
Para estimar la toxicidad de un compuesto se deben efectuar pruebas del intervalo de toxicidad. Cuando se carece de información relativa a la toxicidad
de la muestra problema se deben utilizar progresiones de las concentraciones
en escala logarítmica; cuando existe información disponible, por ejemplo en
otras especies de Xiphophorus, se pueden utilizar progresiones de las concentraciones en escala aritmética. En el caso de mezclas complejas (por ejemplo,
efluentes, lodos, etc.) se efectúan las diluciones correspondientes (por ejemplo,
10, 20, 40, 60 y 80%) a partir de la mezcla original (100%).
Se considera un mínimo de seis concentraciones experimentales y un grupo
testigo sin adición del compuesto problema; en el caso de que el compuesto
problema se haya disuelto en algún disolvente, se debe considerar un testigo
del disolvente utilizado. Por cada concentración se considera al menos una
réplica. En cada cámara experimental y para cada concentración se exponen
un mínimo de 10 organismos. Los peces se eligen de los sistemas de mantenimiento y se colocan al azar en los acuarios experimentales de exposición.
Previo a la adición de los compuestos en estudio, los organismos se mantienen
un mínimo de 24 horas en aclimatación en los acuarios de exposición, sin
proporcionar alimento. La adición de la solución de prueba debe efectuarse de
manera muy lenta, con una agitación suave para evitar una posible exposición
de los organismos a la elevada concentración de la solución madre, garantizando la completa mezcla del compuesto tóxico en el medio y cuidando de
no estresar a los organismos expuestos.
La mortalidad se registra a lo largo del tiempo de exposición, con observaciones a las 0, 2, 4, 8, 12 y cada 12 horas posteriores hasta el término del
ensayo. Los organismos muertos durante el período de exposición deben
ser removidos lo antes posible para evitar el deterioro de la calidad del agua.
Además de la mortalidad, se registran cambios en el comportamiento de
los peces (por ejemplo alteraciones del equilibrio, nado errático, cambios
en la actividad locomotora y en la conducta alimentaria, etc.). La falta de
respuesta de los organismos cuando sean tocados suavemente con una varilla
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de vidrio se considera como criterio de mortalidad. Si en el transcurso de
las pruebas, la mortalidad de los grupos testigo excede el 10%, la prueba se
invalida; el uso de factores de corrección por la mortalidad de los testigos
no es válido.
Prueba definitiva
A partir de los resultados de la prueba de intervalo de toxicidad, se establecen
las concentraciones adecuadas para evaluar la toxicidad aguda del compuesto
tóxico. Se sigue el mismo procedimiento señalado previamente, si bien se recomienda en este caso evaluar un mínimo de dos réplicas por concentración
experimental. Al igual que en la prueba de intervalo de toxicidad, la mortalidad
se registra a lo largo del tiempo de exposición, con observaciones a las 0, 2,
4, 8, 12 y cada 12 horas posteriores hasta el término del ensayo. En la tabla
9.4 se integran las condiciones de prueba recomendadas para los ensayos de
toxicidad con juveniles de X. montezumae.
Tabla 9.4. Condiciones recomendadas para las pruebas de toxicidad aguda
con juveniles de Xiphophorus montezumae
Tipo de ensayo
Temperatura
Calidad de luz
Fotoperíodo
Volumen del acuario
Volumen de la solución de prueba
Agua de dilución
Edad de los organismos
Número de peces por réplica
Número de réplicas
Duración de la prueba
Efectos medidos
Resultado final
Aceptabilidad de los resultados
Estático o semi-estático
25 ± 1 °C
Blanca-fría
12 horas luz :12 horas oscuridad
20 L
18 L
Filtrada, reposada y fuertemente aireada
Juveniles de 0.1 a 1.1 g PH
10
2
96 horas
Respuesta final: mortalidad
Respuestas adicionales: alteración en la
actividad y la conducta alimentaria.
CL50 y TL50
Sobrevivencia en el grupo testigo ≥ 90%
Ensayos de toxicidad aguda con el pez Xiphophorus montezumae
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Expresión de resultados
A partir de los resultados de mortalidad obtenidos de las pruebas de toxicidad
aguda se determina la concentración letal media (CL50) o el tiempo medio
de muerte (TL50). Para el análisis no se consideran los datos de los grupos
testigos, las concentraciones o tiempos en que la sobrevivencia sea 100% o
bien las concentraciones con 100% de mortalidad.
Para la determinación de la CL50 o TL50, se utilizan los programas específicos
de cómputo diseñados para este fin. Preferentemente se utilizan modelos tipo
Probit : X, Probit : log X o arcoseno: X, seleccionando el modelo de mejor
ajuste. La validez de los modelos se determina a través de la prueba de X2.
En cada caso se obtienen los valores de CL50-t ± I.C. y TL50-x ± I.C. (I.C. =
intervalo de confianza; α = 0.05).
Validación de las pruebas definitivas
Los bioensayos se consideran válidos siempre y cuando cumplan con las
siguientes especificaciones:
a) La mortalidad del grupo testigo no sea mayor del 10%.
b) La concentración real de los compuestos no exceda el 20% de la concentración nominal de los mismos.
c) La variabilidad entre las réplicas no exceda el 20%.
d) Los cálculos (CL50-t ± I.C. y TL50-x ± I.C.) se deben realizar con las concentraciones del compuesto tóxico determinadas analíticamente.
e) El valor calculado de la CL50 debe estar incluido dentro del intervalo de
concentraciones experimentales y el modelo Probit debe ser significativo
para asegurar la confiabilidad de los resultados.
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