BENEMÉRITA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE PUEBLA FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

BENEMÉRITA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA
DE PUEBLA
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA Y ALIMENTOS
TESIS
“Análisis de restricción de genes carotenogénicos”
PARA OBTENER EL TÍTULO DE:
QUÍMICO FARMACOBIÓLOGO
PRESENTA:
Jannette Alonso Herrada
DIRECTOR DE TESIS:
Dra. Alma Angélica Del Villar Martínez
CeProBi-IPN
ASESOR:
M.C. Francisco González Salomé
BUAP
Septiembre de 2008
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ÍNDICE
Índice de figuras ............................................................................... vii
Índice de tablas ................................................................................ viii
I. Resumen ....................................................................................... 1
II. Introducción ................................................................................. 3
III. Antecedentes ............................................................................... 5
IV. Planteamiento del problema ........................................................ 7
V. Justificación ................................................................................. 8
VI. Hipótesis ..................................................................................... 9
VII. Objetivos .................................................................................... 10
VIII. Marco teórico ............................................................................ 11
A. Importancia de los pigmentos carotenoides .............................. 11
1. Importancia nutricional................................................ 12
2. Importancia nutracéutica ............................................. 13
B. Ruta de biosíntesis de carotenoides ......................................... 14
C. Avances en el estudio de genes carotenogénicos ....................... 17
D. Enzimas de restricción ............................................................ 19
E. Vectores de clonación ............................................................. 23
F. Plásmidos ............................................................................... 25
G. Extracción de DNA plasmídico ................................................. 30
1. Crecimiento bacteriano ................................................ 30
2. Ruptura o lisis de la bacteria........................................ 31
ii
3. Purificación .................................................................. 31
H. Análisis de patrones electroforéticos ........................................ 33
IX. Diagrama de trabajo .................................................................... 35
X. Materiales y métodos de investigación .......................................... 36
A. Materiales ................................................................................ 36
1. Material biológico ......................................................... 36
B. Métodos ................................................................................... 36
1. Mantenimiento de cepas............................................... 36
2. Preparación de medio de cultivo ................................... 37
3. Uso de antibióticos en el medio de cultivo..................... 37
4. Extracción de DNA plasmídico...................................... 38
5. Restricción enzimática ................................................. 39
6. Análisis de patrones electroforéticos ............................. 39
7. Descripción de secuencias de genes carotenogénicos .... 40
XI. Resultados y discusión ............................................................... 41
A. Mantenimiento de cepas y morfología colonial ......................... 41
B. Extracción de DNA plasmídico ................................................. 45
C. Diagrama del plásmido pBluescript con los genes
carotenogénicos: psy, pds, lcy-b y lcy-e de cempaxúchil ........... 48
D. Identificación de secuencias importantes en las secuencias genéticas de: psy, pds, lcy-b y lcy-e de cempaxúchil ........................ 50
E. Análisis de restricción enzimática de los genes carotenogénicos:
psy, pds, lcy-b y lcy-e de cempaxúchil ..................................... 54
iii
XII. Conclusiones.............................................................................. 63
Anexos ............................................................................................. 64
A. Preparación del agar LB (Luria-Bertani) ................................... 64
B. Esterilización por filtrado del antibiótico .................................. 64
C. Concentración de antibiótico para preparar agar o medio
líquido LB (Luria-Bertani) ........................................................ 65
D. Soluciones ............................................................................... 66
E. Preparación del gel de agarosa ................................................. 67
Bibliografía ....................................................................................... 68
I.
INTRODUCCIÓN
Los carotenoides son pigmentos de origen natural, que dan coloración a un
sin número de alimentos tanto vegetales como animales, su importancia no solo
radica en que son precursores de vitamina A y por tanto poseen un alto valor
nutricional, sino también en sus propiedades como antioxidantes, se han realizado
muchos estudios en diferentes organismos, tales como plantas o sistemas
bacterianos.
El estudio de la ruta de biosíntesis de carotenoides es importante debido a
que permite determinar puntos importantes en la regulación, un punto dentro de la
ruta de biosíntesis de carotenoides en cempaxúchil es controlado por el gen psy
iv
que codifica para la enzima fitoeno sintasa la cual interviene en la condensación
de dos moléculas de geranilgeranil pirofosfato (GGPP), para la formación del
fitoeno primer carotenoide de la ruta; de igual forma el gen pds codifica para la
enzima fitoeno desaturasa y esta enzima a su vez interviene en las dos primeras
desaturaciones
del
fitoeno
convirtiéndolo
en
fitoflueno
y
caroteno,
respectivamente; la conversión del -caroteno a neurosporeno y posteriormente a
licopeno ocurre por la acción de la enzima -caroteno desaturasa, por otra parte el
gen lcy-b codifica para la enzima -licopeno ciclasa, la cual cataliza la formación
de los anillos -ionona en los extremos de la molécula de licopeno, al igual que la
enzima -licopeno ciclasa que cataliza la formación de los anillos y es codificada
por el gen lcy-e.
Los genes psy, pds, lcy-b y lcy-e anteriormente mencionados se clonaron
de una biblioteca de cDNA de flores de cempaxúchil (Tagetes erecta), el
mantenimiento de los genes resulta posible a través de su incorporación en
Escherichia coli la cual es una bacteria comúnmente utilizada para estos fines, ya
que ha demostrado ser una excelente alternativa como huésped, y favorece la
multiplicación de los plásmidos que contienen genes carotenogénicos. El
mantenimiento del sistema bacteriano se logra a través de siembras programadas
en medios de cultivo específicos adicionados con antibióticos de selección; de
esta manera, se logra la conservación y multiplicación de los genes clonados
provenientes de T. erecta y se facilita el uso de estos genes en estudios
posteriores.
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