Aplicación de la técnica del ADN polimórfico amplificado al Azar

UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS
FACULTAD DE FARMACIA Y BIO QUÍMICA
E.A.P. DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA
Aplicación de la técnica del ADN polimórfico amplificado
al Azar (RAPD) en el estudio molecular de Lama pacos
TESIS
para optar el Título Profesional de Químico Farmacéutico
AUTOR
Conrad Ortiz Alfaro
ASESOR
Amparo I. Zavaleta Pesantes
Lima – Perú
2004
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A Dios, a mis padres Vidal y Maura; a mis hermanas Sonia y Marilin; a Julia, Nathaly, José,
Italo y Jesús; Muchas Gracias por todo su apoyo, cariño y comprensión durante todo este
tiempo.
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Agradecimientos a:
Los miembros del Jurado Examinador y Calificador:
Presidenta:
Dra. María Elizabeth Gonzáles Loayza
Miembros:
Q.F. Gloria Gordillo Rocha
Q.F. Gustavo Guerra Brizuela
Dr. Víctor L. Izaguirre Pasquel
Por sus sugerencias y consejos que han permitido enriquecer este trabajo.
Un agradecimiento especial a:
Dra. Amparo I. Zavaleta Pesantes.
Con sus consejos y tiempo invertidos en el asesoramiento de este trabajo permitieron la
ejecución y el termino de esta tesis.
Dr. Raúl Rosadio Alcántara.
Por su apoyo y sugerencias dados en el presente trabajo
A Edith Tafúr y familia por brindarme su amistad y cariño inmerecidos.
A la Dra. Luisa Negron, por su constante apoyo.
A la Dra. Jane Wheeler, por sus consejos y confianza depositada en mi.
A los miembros de CONOPA, además de investigación encontré grandes amigos.
Al. Dr. Fernando Quevedo, por su apoyo y amistad.
Al Mg. Carlos Bell y familia, por su incondicional amistad brindada.
A Alfredo Mendoza, Por ser uno de mis mejores amigos y compañero en la universidad.
A la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la UNMSM, donde encontré un segundo hogar.
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Se aplica la técnica del ADN polimorfico Amplificado al Azar (RAPD) se aplica al estudio
molecular de Lama pacos (alpaca), esta metodología se propone debido a que las técnicas de
microsatélites y ADN mitocondrial, que actualmente se utilizan, no tienen un uso práctico
cuando se trata de analizar gran cantidad de muestras.
Para la estandarización del RAPD se utilizo ADN genómico a partir de sangre total y
cebadores de 10 nucleotidos siguiendo los protocolos estandarizados modificando básicamente la
concentración de MgCl2 a 2.5 mM permitiendo aumentar la intensidad de las bandas y una
mejor visualización. Se prosiguió con la identificación de cebadores informativos, de 23
cebadores fueron seleccionados 7 (OPF-05, OPI-04, OPB-03, OPI-18, OPB-11, OPA-18 y
OPI-14) por generar numerosas bandas por muestras analizadas. Estos cebadores permitieron
obtener perfiles diferentes entre alpacas híbridas y puras; en la muestra poblacional estudiadas no
se encontraron alpacas que tuvieran un perfil de bandas similares a los presentados por los
animales puros, esto explicaría el grado de hibridación que existe debido a un inadecuado
cuidado en el cruce, esto trae como consecuencia, por ejemplo, una baja calidad en la producción
de fibra por las alpacas y llamas híbridas disminuyendo el ingreso económico para las familias
campesinas. En 8 alpacas los cebadores OPB-03 y OPA-18 mostraron bandas polimorficas de
650 pb y 1000 pb respectivamente, este polimorfismo nos podría indicar alguna mutación o
variabilidad intraespecífica, ya que estos animales no presentan diferencias fenotípicas evidentes.
Palabras claves: Lama pacos, RAPD, ADN genómico, decanucleotido, suri, huacaya.
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The Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) is applied on the molecular study of Lama
pacos (Alpaca), this methodology is proposed because the microsatellites and DNA
mitochondrial techniques, which are used commonly, don't have a practical utility when is
necessary to analyze great quantity of samples.
Genomic DNA obtained from total blood and primers of 10 nucleotides were used to
standardize the RAPD technique following the standardized protocols, and concentration of
MgCl2 was modified at 2.5 mM which allowed an increase at the intensity and a better
visualization of the bands. After the standardization, the identification of informative primers
was realized, beginning with 23 primers, selecting only 7 (OPF 05, OPI 04, OPB 03, OPI 18,
OPB 11, OPA 18 and OPI 14), because the presence of several bands for the analyzed samples.
These primers let obtain different profiles between hybrid and pure alapacas; in the sample were
not found alpacas with a similar bands profiles to those presented by the pure animals, this would
explain the hybridization grade that exists due to an inadequate care in the crossing, this results
in, for example a low quality in the fiber production from the hybrid alpacas and llamas,
diminishing the economic entrance for the rural families. In 8 alpacas the primers OPB-03 and
OPA-18 showed polymorphic bands of 650 pb and 1000 pb respectively, this polymorphism
could indicate some mutation or intraespecific variability, since these animals don't present
evident phenotypic differences.
Key words: Lama pacos, RAPD, genomic DNA, decanucleotid, suri, huacaya.
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