CLASIFICACIÓN VARIETAL MEDIANTE EL ESTUDIO DE PENTOSAS Y HEXOSAS A TRAVÉS DE CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO ANIÓNICO DE ALTA EFICACIA ACOPLADA CON DETECCIÓN AMPEROMÉTRICA DE PULSOS 1 1 1 1 Humberto Manzano . Raquel Romano , Luciana Garcia , Omar Bauzá , Lía Gerschenson (1) 2 Normas Analíticas Especiales, Subgerencia de Investigación para la fiscalización Instituto Nacional de Vitivinicultura San Martín 430-Ciudad- Mendoza (CP 5500)- Argentina [email protected] (2) Departamento de Industrias, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires, Ciudad Universitaria, Pabellón II, CP C1428EHATel.:54 11 45763449 y Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET). e-mail: [email protected] Resumen: Para demostrar de manera objetiva la autenticidad de los vinos monovarietales comerciales de Argentina, se ha desarrollado un sistema analítico y estadístico, mediante la elaboración de un banco de datos de vinos microvinificados de origen indudable y el análisis de sus carbohidratos residuales, que permiten predecir la pertenencia varietal. En el presente trabajo se han podido diferenciar 4 variedades de vinos tintos cosecha 2010 identificando xilosa, arabinosa, ribosa, ramnosa, glucosa, fructosa y sacarosa mediante análisis por Cromatografía de Intercambio Aniónico de Alta Eficacia (HPAEC), acoplada con la Detección Amperométrica de Pulsos (PAD). Esta técnica permitió la cuantificación directa de carbohidratos no derivatizados a niveles de picomoles con una mínima preparación de muestra. Posteriormente mediante análisis estadístico discriminante se creó un modelo de predicción, el que podrá ser aplicado a vinos comerciales para su clasificación varietal. Palabras claves: pentosas, hexosas, cromatografía iónica, HPAEC ÉTUDE SUR LA CLASSIFICATION VARIÉTALE PAR PENTOSES ET LES HEXOSES PAR ÉCHANGE D'ANIONS CHROMATOGRAPHIE COUPLÉE À HAUTE EFFICACITÉ PULSE DÉTECTION AMPÉROMÉTRIQUE 1 1 1 1 2 Humberto Manzano . Raquel Romano , Luciana Garcia , Omar Bauzá , Lía Gerschenson 1 Normas Analíticas Especiales, Subgerencia de Investigación para la fiscalización Instituto Nacional de Vitivinicultura San Martín 430-Ciudad- Mendoza (CP 5500)- Argentina [email protected] 2 Departamento de Industrias, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires, Ciudad Universitaria, Pabellón II, CP C1428EHATel.:54 11 45763449 y Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET). e-mail: [email protected] Résumé: Afin de démontrer objectivement l'authenticité des vins de cépage commerciaux de l'Argentine, a développé un système d'analyse et de statistiques, en développant une 1 base de données microvinificados vins d'une incontestable origine et l'analyse des pentoses et les hexoses, qui membres de prévoir des variétés. Dans le présent travail ont été distingués 4 différentes millésime 2010 des vins rouges d'identifier le xylose, l'arabinose, le ribose, le rhamnose, le glucose, le fructose et le saccharose par analyse par chromatographie de haute performance par échange d'anions (HPAEC), couplé avec l'impulsion détection ampérométrique (PAD). Cette technique permet une quantification directe des hydrates de carbone dérivés à des niveaux picomole avec préparation de l'échantillon minimal. Plus tard, par l'analyse statistique discriminante a créé un modèle de prédiction, qui peut être appliquée à la classification des vins commerciaux variétale. Mots-clés: pentoses, hexoses, chromatographie ionique, HPAEC VARIETAL CLASSIFICATION STUDY BY PENTOSES AND HEXOSES THROUGH ANION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY COUPLED WITH HIGH EFFICIENCY PULSE AMPEROMETRIC DETECTION 1 1 1 1 2 Humberto Manzano . Raquel Romano , Luciana Garcia , Omar Bauzá , Lía Gerschenson 1 Normas Analíticas Especiales, Subgerencia de Investigación para la fiscalización Instituto Nacional de Vitivinicultura San Martín 430-Ciudad- Mendoza (CP 5500)- Argentina [email protected] 2 Departamento de Industrias, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires, Ciudad Universitaria, Pabellón II, CP C1428EHATel.:54 11 45763449 y Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET). e-mail: [email protected] Abstract: To demonstrate objectively the authenticity of commercial varietal wines from Argentina, an analytical and statistical system, has been developed by developing a database of wines microvinificados of undoubted origin and analysis of pentoses and hexoses, which allow us to predict varietal. In the present work have been able to distinguish 4 different vintage 2010 red wines identifying xylose, arabinose, ribose, rhamnose, glucose, fructose and sucrose by chromatography analysis by High Performance Anion Exchange (HPAEC), coupled with pulse amperometric detection (PAD). This technique allows direct quantification of carbohydrates derivatized at picomole levels with minimal sample preparation. Later by discriminant statistical analysis has created a model prediction, which can be applied to commercial wine varietal classification. Keywords: pentoses, hexoses, ion chromatography, HPAEC 2 Introducción La autenticidad de un alimento se puede definir como la concordancia existente entre las propiedades del producto en sí mismo y las propiedades que el comprador espera de él. Así, en un vino sería la concordancia entre las características del vino contenido en la botella y las características, explícitas o no, que le atribuyen en la etiqueta de la botella (variedad, origen geográfico, crianza, forma de elaboración, etc.). Estas características aumentan el valor agregado del producto y, por esta razón, son susceptibles de adulteraciones que implican graves perjuicios económicos para el consumidor. El avalar analíticamente la procedencia de origen de la materia prima y el producto final, implica garantizar la trazabilidad, la seguridad alimentaria y la calidad(1). En este marco, se hace necesario la implementación de sistemas analíticos para el reconocimiento de la pertenencia y clasificación varietal. Está comprobado que las técnicas de las huellas digitales basadas en la composición química y el análisis estadístico multivariado de resultados analíticos puede usarse para la identificación y clasificación de productos agrícolas específicos de acuerdo a la variedad de origen (2). Estos métodos asumen que la identificación de los compuestos químicos expresan no solo las características analíticas intrínsecas sino también las contribuciones atribuidas al suelo, clima y variedad. En este trabajo se propone un procedimiento que mediante la determinación de los azúcares residuales, y la aplicación del análisis multivariado particularicen su origen varietal. Los azúcares reductores del vino son hexosas (en particular glucosa y fructosa) y pentosas (principalmente arabinosa y xilosa y en menor proporción galactosa, manosa, celobiosa, rafinosa, arabinosa, ramnosa, xilosa y ribosa). Las pentosas no son fermentecibles por las levaduras, pueden variar de 0,4 a 2 g/l y la manera adecuada de comprobar que ha fiinalizado la fermentación es cuantificando glucosa/fructuosa(3). En la actualidad, analíticamente, en el caso de vinos procedentes de uvas tintas, se analiza el perfil de antocianos y de ácido shikimico, para clasificar los vinos de acuerdo con su procedencia varietal, mediante análisis por cromatografía líquida de alta precisión (HPLC)(4). La posibilidad de poder sumar variables clasificadoras para diferenciar y caracterizar varietalmente vinos tintos monovarietales, mediante el análisis del perfil de azúcares de acuerdo al año de elaboración, por cromatografía iónica otorgaría una herramienta objetiva de evaluación de los vinos. Las variedades analizadas fueron Cabernet Sauvignon, Malbec, Tempranillo y Syrah. Se utilizó una base de datos, a partir de microvinificaciones de vinos tintos de variedad ampelográficamente certificadas, con el objetivo de establecer para cada una de ellas la pertenencia a la variedad que le dió origen. Se obtuvieron resultados aceptables. Materiales y Métodos Materiales Muestras de uva de origen indudable de la variedad Cabernet Sauvignon, Malbec, Tempranillo y Syrah, microvinificadas en forma tradicional estandarizada. 3 Métodos Determinación analítica Análisis por Cromatografía de Intercambio Aniónico de Alta Eficacia (HPAEC), acoplada con la Detección Amperométrica de Pulsos (PAD), con las siguientes condiciones: Columna: tipo poliestireno divilbenceno sulfonada con aminas cuaternaria de 240 mm de largo, 4 mm de diámetro y 5µm de diámetro. Precolumna intercambiadora aniónica y entrampadora de aminoácidos. Horno: 30ºC. Presión de trabajo: 1700 psi. Inyección: 10 μl. Detector: amperométrico de pulsos. Colección de datos: 1 Hz. Electrodo de referencia: pH/Ag/ClAg. Rango de pH de trabajo: 10 a 13. Fase Móvil: Agua, Hidróxido de Sodio, Acetato de Sodio y Clorhídrico con gradiente de elución inicial de 90:10 Agua- Hidróxido de Sodio. Flujo: 0,25 ml/min. Determinación estadística Mediante el paquete estadístico Stat Graphics Centurión XV se realizó el estudio de Análisis Discriminante, el cual se puede considerar como un análisis de regresión donde la variable dependiente es categórica (variedad) y tiene como categorías a cada uno de los cuatro grupos; a su vez las variables independientes (carbohidratos residuales) son continuas y determinan a qué grupos pertenecen los objetos. Se pretende encontrar las variables que mejor discriminen o distingan a los objetos. Se utilizó la base de datos para establecer en cada una de ellas la pertenencia o no a la variedad de origen. Se otorgaron a todas las variables las mismas probabilidades de discriminación. Resultados Este procedimiento fue diseñado para desarrollar un conjunto de funciones discriminantes, el cual puede ayudar a predecir VARIEDAD con base en los valores de otras variables cuantitativas. Cincuenta y tres casos fueron utilizados para desarrollar un modelo que discrimine entre los cuatro niveles de VARIEDAD. Diez variables predictoras fueron introducidas. Las dos funciones discriminantes con valores-P menores que 0.05 son estadísticamente significativas con un nivel de confianza del 95.0% como se observa en Tablas 1, 2 y 3. Variable de clasificación: VARIEDAD Variables independientes: ARABINOSA FRUCTOSA GLUCOSA DESCONOCIDO DESCONOCIDO 4 RAMNOSA RELACIÓN G/F RIBOSA SACAROSA XILOSA Número de casos completos: 53 Número de grupos: 4 Tab. 1 Funciones discriminantes Función Discriminante 1 2 3 Eigenvalor Porcentaje Relativo 5.81829 78.23 1.33811 17.99 0.280724 3.77 Correlación Canónica 0.92376 0.75651 0.46818 Tab. 2 Funciones derivadas Funciones Derivadas 1 2 3 Lambda de Wilks 0.0489783 0.333948 0.780808 Chi-Cuadrada 135.7370 49.3546 11.1341 GL 30 18 8 Valor-P 0.0000 0.0001 0.1942 Tab. 3 Porcentaje de casos correctamente clasificados: 96.23% Actual VARIEDAD CABERNET SAUVIGNON Tamaño Predicho de CS Grupo 24 24 MALBEC 22 SYRAH 2 TEMPRANILLO 5 (100.00%) 0 (0.00%) 0 (0.00%) 0 (0.00%) VARIEDAD MALBEC SYRAH TEMPRANILLO 0 0 0 (0.00%) 20 (90.91%) 0 (0.00%) 0 (0.00%) (0.00%) 2 (9.09%) 2 (100.00%) 0 (0.00%) (0.00%) 0 (0.00%) 0 (0.00%) 5 (100.00%) En la Fig. 1 de funciones discriminantes se observa que existen diferencias significativas entre los vinos provenientes de vinos monovarietales Cabernet Sauvignon, Malbeck, Syrah y Tempranillo. 5 Gráfica de Funciones Discriminantes 6.6 VARIEDAD CABERNET SAUVIGNON MALBEC SYRAH TEMPRANILLO Centroides Función 2 4.6 2.6 0.6 -1.4 -3.4 -3.9 -1.9 0.1 2.1 Función 1 4.1 6.1 Fig. 1: Diferenciación de vinos monovarietales Conclusión: Se concluye que fue posible diferenciar con una probabilidad total del 96,23% vinos monovarietales de las variedades estudiadas el análisis de sus azúcares residuales por cromatografía iónica y análisis discriminante. Por lo tanto, sería posible su inclusión dentro de los sistemas analíticos de antocianos, aminoácidos, cationes y aniones para lograr la diferenciación completa de las variedades implicadas en el presente estudio. Bibliografía 1. 2. 3. 4. Ley General de Vinos Nº 14.878. Douglas G. A., J Martin B.: “Comparing several groups using Analysis of variance” BMJ; 312 pp. 1472 a 1473. (1996) http://www.accuvin.com/SpanishHomePage.html Resolución C23/2006 Instituto Nacional de Vitivinicultura (INV). 6