GL-PL-26. PROTOCOLO COLIFORMES TOTALES Y E

PROTOCOLO PARA LA DETERMINACIÓN DE COLIFORMES
TOTALES Y ESCHERICHIA COLI (UFC)
COD. GL-PL-26
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Documento inicial
REV. No.
DESCRIPCION
Celina Obregón
Loida Zamora
Loida Zamora
Apoyo a Procesos
Directora SILAB
Directora SILAB
Celina Obregón
Loida Zamora
Loida Zamora
Apoyo a Procesos
Directora SILAB
Directora SILAB
Martha García
Carlos Doria
Leanis Pitre
Ing. Química
Coordinador lab. de
calidad ambiental
ELABORÓ
REVISÓ
APROBÓ
Dir.SILAB
29-02-2016
09-11-2015
17-06-2013
FECHA
APROBADO: _______________________
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CONTENIDO
1. OBJETO .............................................................................................................. 3
2. APLICACIÓN ....................................................................................................... 3
3. DEFINICIONES ................................................................................................... 3
4. FUNDAMENTO DEL MÉTODO ........................................................................... 3
5. INTERFERENCIAS Y LIMITACIONES ................................................................ 4
6. TOMA DE MUESTRA, ALMACENAMIENTO Y PRESERVACIÓN...................... 5
7. MATERIALES Y EQUIPOS ................................................................................. 5
8. REACTIVOS Y MEDIOS DE CULTIVO .............................................................. 5
9. PROCEDIMIENTO .............................................................................................. 6
10. CÁLCULOS ....................................................................................................... 8
11. AUTORIDAD ..................................................................................................... 8
12. FORMATOS ...................................................................................................... 8
13. REFERENCIAS ................................................................................................. 8
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1. OBJETO
Describir la metodología a seguir para determinar Coliformes totales en muestras de
agua por medio de la técnica de filtración por membrana.
2. APLICACIÓN
La técnica de filtro de membrana (SM 9230 C) es aplicable a muestras de aguas
superficiales y residuales.
3. DEFINICIONES
Coliformes Totales: Son un grupo de bacterias gram negativa en forma de bacilo, no
esporuladas, oxidasas negativas, con capacidad de crecimiento aerobios o anaerobios
facultativos en presencia de sales biliares, que fermentan la lactosa con producción de
acido y gas a 35% +- 2 Cº. Presentan la enzima beta galaptosidasa.
Escherichia Coli (E- Coli): Bacilo gram negativo, capaz de desarrollarse en presencia de
sales biliares u otros agentes (tensoactivos) que tengan propiedades similares e
inhibitorias del crecimiento y que son capaces de fermentar la lactosa a temperaturas de
35ºC ± 2ºC, con producción de ácido, gas y aldehído en un lapso de 18 a 48 horas.
Oxidasa negativa, no esporógena y reduce el nitrato a nitrito. También es capaz de
producir indol a partir de triptofano a una temperatura de 44ºC ± 0.5 en un tiempo de 21 ±
3 horas. Poseen la enzima β-glucoronidasa, la cual es detectada por medios cromógenos
o fluorógenos.
Medio de Cultivo Selectivo: Medio que promueve el crecimiento de microorganismos
específicos, al tiempo que inhibe, total o parcialmente, el crecimiento de otros
microorganismos.
UFC/100 mL: Unidades Formadoras de Colonias por 100 mililitros
mL: mililitros
LDM: Límite de Detección del Método
Salmon-GAL: Sustrato cromogénico que reacciona con la enzima galactosidasa y las
colonias toman color rojo salmón.
X-glucoronide: Sustrato cromogénico que reacciona con la glucoronidasa y produce
color azul en las colonias.
4. FUNDAMENTO DEL MÉTODO
Las bacterias del grupo coliforme Los coliformes habitan generalmente en el intestino del
hombre y animales de sangre caliente y pertenecen al grupo de las enterobacterias.
Tradicionalmente se consideraba que los coliformes pertenecían a los géneros
escherichia, citrobacter, enterobacter, y klebsiella, pero de acuerdo con los métodos
taxonómicos modernos, el grupo es más heterogéneo.
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Las bacterias del grupo coliformes están asociadas con los organismos patogénicos y son
un buen índice del grado de seguridad bacteriológico del agua.
Cuando aparecen bacterias coliformes en el agua se asume que otra clase de
microorganismo capaces de causar enfermedades pueden están presentes.
La técnica de filtración por membrana es el método por medio del cual se atrapan en la
superficie del filtro estéril microorganismos cuyo tamaño es mayor que el tamaño del poro
0.45 µm, con ayuda de una bomba eléctrica que ejerce una presión diferencial sobre la
muestra de agua haciendo que se filtre. Los microorganismos de menor tamaño que el
específico del poro atraviesan la membrana o se quedan retenidos en su interior. Las
bacterias quedan en la superficie de la membrana y posteriormente es llevada a un medio
de enriquecimiento selectivo; en nuestro caso se utiliza el medio de cultivo choromocult, el
cual promueve el crecimiento y la identificación.
El agar selectivo contiene dos sustratos: el Sustrato Salmon GAL -6 cloro-3 indol y β - D
galaptopiranosido es un sustrato cromogénico que es usado para la detección de la
enzima galactosidasa de colonias bacterianas en un ensayo colorimétrico; que da como
resultado el cambio de la colonia a un color rojo salmòn. Esta reacción se observa cuando
hay coliformes totales.
Para diferenciar la E-coli de los coliformes totales se hace por medio del sustrato
cromogénico X-Glucorósido, el cual reacciona con la enzima glucoronidasa pero estas
también reaccionan con el sustrato salmón-gal produciendo colonias de color azul violeta.
El método de filtración por membrana es un método ágil y poco dispendioso, la lectura de
resultados se da en un menor tiempo con relación a otros métodos, además se puede
utilizar en pruebas de campo empleando accesorios adecuados. Cuando se trata de
muestras de agua con alta carga bacteriana es conveniente hacer diluciones de la
muestra y continuar con el procedimiento del método de siembra.
5. INTERFERENCIAS Y LIMITACIONES
- Aguas con elevada turbidez, pues la presencia de gran cantidad de partículas puede
dificultar el recuento.
- Aguas con un elevado número de microorganismos no coliformes materiales y equipos
contaminados.
- Medio de cultivo contaminado.
- Lavado de material ineficiente
- Fallas en la esterilización del material
- Área de Siembra contaminada.
- Conservación inadecuada de muestras.
- Toma de muestras inadecuadas.
Las interferencias se eliminan con procedimientos de calidad como:
Estandarización de los procedimientos, y dando el entrenamiento necesario al personal
que realiza los análisis y operaciones en el área de microbiología.
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Llevando un estricto programa de control de calidad analítico el cual incluye el análisis de
blancos, blancos de reactivos, controles con cepas certificadas y duplicados de muestras.
6. TOMA DE MUESTRA, ALMACENAMIENTO Y PRESERVACIÓN
Se toma la muestra del agua a analizar en un frasco de vidrio de color transparente o
ámbar, con tapón esmerilado, previamente esterilizado y bacteriológicamente inerte, con
capacidad de 250 mL. Se debe preservar la muestra de agua a una temperatura entre 1 y
5ºC y en oscuridad durante su transporte al laboratorio. Es conveniente que los
recipientes se mantengan en posición vertical y que el líquido de la muestra no se
derrame, igualmente el refrigerante no debe entrar en contacto con la muestra para evitar
su posible contaminación. La nevera de transporte debe contener hielos que mantengan
la temperatura de refrigeración, estas deben estar limpias y en lo posible desinfectadas
para evitar una fuente de contaminación. Las muestras no deben congelarse bajo ningún
motivo. De preferencia el análisis debe ser inmediato, y no se debe sobrepasar las 24
horas desde que fue tomada la primera muestra.
7. MATERIALES Y EQUIPOS
-
Incubadora 35 Cº ± 2 Cº
Autoclave temperatura 121 Cº 15 psi
Balanza
Equipo de filtración de membrana
Cuenta colonias
Destilador de agua.
Plancha de calentamiento
Bomba de vacio
Horno
Nevera
Cabina de flujo laminar
Pinza plana
Cajas de petri
Matraz Erlenmeyer
Micropipeta o pipeta volumétrica clase A
Mechero de alcohol
Trampa de vacio
Frasco tapa azul
Filtros de membrana estériles certificados de acetato de celulosa de 0.45 µm de poro,
con cuadrícula
Puntas azules y puntas amarillas
Papel Kraft
Gradillas
Asa de platino redondeada (bacteriológica)
Espatula
Tubos de ensayo con tapa
8. REACTIVOS Y MEDIOS DE CULTIVO
- Agua desionizada
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- Agar choromocult
- Alcohol antiséptico
- Agua peptonada: tamponada al 1%:Disolver 1.0 g en 100 mL
- EDTA (ácido etilendiamino tetracético): se usa como agente quelante en muestras de
agua con alto contenido de cobre o zinc o níquel mayor a 0.1 mg/L, que reduzca la
toxicidad del metal. La cantidad debe ser 0.3 mL de EDTA al 15% para un volumen de
muestra de 120 mL
- Tiosulfato de sodio (Na2S2O3): se usa como agente declorante que neutraliza todos los
residuos halógenos e impide el mantenimiento de la acción bactericida durante el
transporte de la muestra. Para muestras de agua potable adicionar 0.63 mL de tiosulfato
de sodio al 0.025 N para un volumen de muestra de 500 mL, el cual neutraliza hasta 5
mg/L de cloro residual. En muestras residuales tratadas con cloro la cantidad es de 0.1
mg/L de tiosulfato al 10% para un volumen de muestra de 120 mL, la cual neutralizará
hasta 15 mg/L de cloro residual.
Nota: Los medios de cultivo se preparan siguiendo las especificaciones del fabricante.
No se debe dejar sobrecalentar (hervir) ni autoclavar. Retirar y permitir que enfríe hasta
temperatura de 42 a 50ºC. Servir en cajas pequeñas petri . Para servir se debe colocar los
mecheros encendidos alrededor y esterilizar toda el área. Deje que se solidifique
El agar se debe servir aproximadamente entre 2 y 4 mL de agar
pequeñas y dejar solidificar.
en cajas de petri
9. PROCEDIMIENTO
9.1 FASE PREANALITICA
-
Preparar agua peptonada al 1%, dependiendo del volumen que se va a emplear
Esterilizar los frascos y las cajas de petri a 121ºC por 15 minutos y 15 psi.
Esterilizar embudos, frizas, pinzas a 121ºC por 15 min.
Preparar el medio de cultivo según las recomendaciones del fabricante
9.2 FASE ANALITICA
- Desinfectar completamente el área de trabajo
- Verificar que todo el material a utilizar estè estéril.
- Colocar el poltafiltro estéril sobre la base del manifold, poniendo primero la goma de
caucho, luego va la friza, la membrana y por útimo el embudo el cual debe ser bien
enroscado para que no se salsa la muestra como la intoduzca.
- Con las pinzas estériles (pasada por alcohol antiséptico y un segundo por el mechero
colocar la membrana de celulosa estéril con la cuadrìcula hacia arriba sobre la friza.
- Colocar el embudo sobre la friza, fijándolo con mucho cuidado.
- Llene el embudo con los 100 mL de la dilución escogida
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- Alistar dos frascos con 100 mL de agua de peptona tamponada estéril al 1% como
mínimo para cada muestra. De acuerdo a las diluciones que vaya a realizar, extraiga del
frasco que contiene el agua peptonada un volumen igual al determinado de acuerdo a la
dilución.
- Mezclar bien la muestra y restituir el volumen original con la alícuota de la muestra.
Utilizar micropipeta y punta estéril. Mezclar muy bien antes de realizar las diluciones.
- Filtrar a través de la membrana. Cuando haya pasado todo el líquido adicionar más agua
peptonada para hacer un enjuague de las paredes del embudo y aplique vacio de nuevo.
Cuando se termina de filtrar, se cierra las llaves del manifold, se apaga la bomba de
vacío.
- Tomar la membrana con las pinzas estériles y colóquela sobre una caja de petri que se
haya marcado con anterioridad
- Incubar la caja en posición invertida y dejar por 24 horas a 36ºC
9.3 FASE POSTANALITICA
- Contar el número de colonias resultantes después del tiempo en mención, de acuerdo
con el color cuando el medio posee menos de 200 UFC/100 mL
- Recontar coliformes totales: Contar todas las colonias, las de color rojo salmòn más las
azules oscuras. El resultado se obtiene por la multiplicación del número total de colonias
de la caja más representativa por el inverso de la dilución.
- Contar como colonias individuales aquellas que tienen aspecto de colonias y crecen muy
cerca unas de otras, sin tocarse siempre que la distancia entre ellas sea al menos igual
al diámetro de la colonia más pequeña. Contar como una unidad las cadenas de
colonias que parezcan ser consecuencia de la desintegración de un grupo de bacterias.
Las colonias que se forman como una película entre el agua y el borde de la superficie
del agar cuando no se filtra bien, se deben contar como una sola.
- Recontar E- coli: contar solamente las colonias que Técnico Analista titular o suplente
y/o Auxiliares presenten color azul violeta sin tener en cuenta las de Coliformes totales
(rojo salmón).
- Confirmar las colonias E. coli dudosas, realizando la prueba del indol, agregado dos
gotas de reactivo Kovacas, el cual un produce un halo rojo alrededor de la colonia.
- Los resultados se reportan en UFC/ 100 mL, utilizando la ecuación del numeral 5.1.6 de
este procedimiento.
Nota: Los coliformes totales incluyen todas las colonias tanto las de color rojo salmón
(coliformes totales) más las de color violeta o azul (E. coli) y se multiplica por el inverso de
la dilución analizada.
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Para E-coli: se cuentan solamente las colonias de color violeta o azul, se multiplica por el
inverso de la dilución analizada
10. CÁLCULOS
- Si no observa colonias de coliformes totales a la muestra a analizar reporte como 0
UFC/100 mL
- Cuente en cajas que contengan entre 20 UFC y 100 UFC y no > de 300 UFC usando la
siguiente ecuación :
UFC Coliformes Totales / 100 mL 
N colonias por caja *100
ml muestras filtradas
Ante verificaciones cuente las colonias verificadas y ajuste el resultado al recuento
anterior usando la siguiente fórmula:
Porcentaje de Verificación 
N colonias verificadas *100
Total colonias sujetas a verificaci ón
Sume las colonias verificadas al total de coliformes contados. Si los recuentos son
menores de veinte 20 UFC en el mayor volumen de muestra analizado, cuente todas las
colonias de coliformes presentes y exprese el resultado como UFC /100 mL.
11. AUTORIDAD
Director técnico: Posee autoridad para decidir acerca del uso de equipos y la realización,
suspensión, reanudación o reprogramación de una prueba.
Responsable de calidad: Decide sobre la repetición de una prueba.
Técnico Analista titular o suplente y/o Auxiliares: Autoridad para decidir el encendido
de equipos, si se requiere, tomar las muestras, realizar las lecturas pertinentes y repetir
las pruebas cuando sea necesario.
12. FORMATOS
Datos para análisis microbiológicos. GL-F-26
13. REFERENCIAS
Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. Membrane Filter
Techiques. 9230 C American Public Health Association, American Water Works
Association, Water Pollution Control Federation. 21st ed., New York, 2005.pp 9-88
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