La importancia de la replicación del ADN en la medicina REPLICACIÓN La replicación del material genético es esencial a la vida Propiedades generales del proceso de replicación mitosis Biosíntesis del ADN El mecanismo de la replicación Errores en la replicación son el origen de las enfermedades hereditarias meiosis Errores en la replicación son causa primaria de canceres La maquinaria de la replicación La Replicación en Eucariotas Existen patologías por incapacidad de reparar errores cometidos en la replicación Telómeros y Telomerasas mitosis Los patógenos tambien replican. Entender estos procesos permite establecer terapias especificas Transcriptasas Reversas Muchos antibioticos inhiben la replicación de microorganismos 1 2 El experimento de Meselson y Stahl Tres posibles modelos de replicación •La replicación es semiconservativa •Cada hebra se usa como molde para sinte tizar otra • Los nucleótidos se unen por complementariedad • Se sintetiza una cadena nueva a partir de cada hebra vieja • Se respeta la disposición antiparalela de las hebras 3 4 Direccionalidad de la replicación Origenes, Origenes, burbujas y horquillas de replicación La replicación se inicia en sitios particulares (orígenes de replicación) Cada origen define un replicón (unidad de replicación independiente) A partir de cada origen la replicación avanza bidireccionalmente Se forma una burbuja de replicación formada por dos horquillas que avanzan en direcciones opuestas horquilla 1 5 6 Replicación de ADN circular y lineal 1. 2. 7 horquilla 2 Theta Cromosoma bacteriano 3. Lineal Replicones simples o múltiples Cromosoma eucariota Círculo rodante Bacteriófagos 8 Reacción de Síntesis La replicación es semidiscontinua Todas las polimerasas catalizan la elongación de cadena in dirección 5´-3´ Las dos hebras están orientadas en dirección antiparalela Solo una hebra avanza continuamente leyendo una hebra molde en dirección 3´Æ5´ La hebra complementaria se debe sintetizar en fragmentos discontinuos En la síntesis de la nueva cadena se generan: • enlaces fosfodiester (covalentes) • puentes de H entre las bases complementarias 9 La síntesis ocurre en dirección 5´Æ3´ 10 La hebra retrasada se sintetiza en fragmentos de Okazaki La replicación es semisemi-discontinua 11 12 La replicación es un proceso complejo El mecanismo de la replicación Señales: Ori C Ter INICIACION Reconocimiento de origenes de replicación separación de hebras Posicionamiento de maquinaria transcripcional ELONGACION Crecimiento bidireccional de las horquillas de replicación Replicación semiconservativa, semidiscontinua, coordinada TERMINACION Reconocimiento de señales de terminación Desensamble de replisomas Enzimas principales: ADN polimerasas Primasas Ligasas Helicasas Topoisomerasas Mapa de genes involucrados con la replicación y reparación en E. coli 13 14 Inicio de la replicación en procariotas: Separacíon de las hebras Proteína DnaA Repetidos 13 pb ricos en AT Repetidos 9 pb Ensamblaje del replisoma Proteína DnaA se une a AND superenrrollado en OriC. Genera tensión disociando repetidos adyacentes La helicasa comienza disociación de hebras Se asocian proteínas de unión a cadena simple 15 16 Elongación 17 Resolución de la replicación en la hebra retardada 18 ADN Polimerasa I Terminación Secuencias terminadoras Retienen las horquillas de replicación Contienen secuencias que facilitan la decatenación y separación de los cromosomas resultantes Requieren elementos de terminación particulares 19 Kornbnberg, 1957 ACTIVIDAD POLIMERASA • Necesita Mg++ como cofactor • La energía es provista por la liberación de PPi • El ADN actúa como molde • Necesita un cebador que ofrezca un exrtremo 3´OH libre para agregar nucleótidos • La elongación ocurre en dirección 5´Æ 3´ 20 ADN Polimerasa I FIDELIDAD DE LA REPLICACIÓN ACTIVIDAD EXONUCLEASA • Esta dada por la actividad exonucleasa 3´-´5´ • Requerimiento de primers •3´Æ5´ “Proofreading” corrección de síntesis • Imposibilidad de la polimerasa de agregar nucleótidos si no hay apareamiento exacto en los nucleótidos previos • Implica la imposibilidad de replicación en dirección 3´-5´. •5´Æ3´ “Nick Translation” reemplazo de cebadores 21 22 El anillo corredizo y la procesividad ADN Polimerasa III La DNA Pol III es la enzima principal en la replicación Multimérica, con varias subunidades ??? 3’Æ5’ exonucleasa El core de DNA Pol III es poco procesivo El anillo corredizo asegura una muy alta procesividad core Pol C: polimerasa dimerización Anillo corredizo clamp loader (cargador del anillo) 23 24 Coordinación de hebras Avance de la horquilla de replicación La DNA Pol III funciona como dímero Las hebras crecen de modo coordinado, avanzando en la dirección de la horquilla 25 26 27 28 Primasa: Primasa: síntesis del cebador ADN polimerasas procariotas Polimerasas Características I II III Subunidades 1 >4 >10 103.000 88.000 830.000 si si si Peso Molecular Exonucleasa 3´Æ5´ Exonucleasa 5´Æ3´ si no no Vel.Polimerización (nt/seg) 16-20 40 250-1.000 Procesividad (*) 3-200 1.500 >500.000 * Nucleótidos incororados antes de disociarse del ADN Las DNA Polimerasas son enzimas elongadoras Necesitan un cebador 3´OH 29 30 Helicasa: Helicasa: Separación de las hebras de ADN Girasa (topoisomerasa II ) Eliminación de tensión durante la replicación QUINOLONAS QUINOLONAS (ácido (ácido nalidíxico) nalidíxico) Se Se une une a a la la subunidad subunidad A A de de la la DNA DNA girasa girasa (topoisomerasa) (topoisomerasa) espectro: espectro: Gram-positivos Gram-positivos e e infecciones infecciones urinarias urinarias 31 32 Resolución de los cromosomas duplicados ADN Polimerasas Eucariotas Localización Función Funcíón similar en E.coli alfa delta Beta epsilon gama nuclear nuclear nuclear nuclear mitocondrial replicación retardada Cebado DNA Pol I DNA Pol III DNA Pol II + + + + + Exonucleasa 3´Æ5´ - + - + + Asociada a DNA primasa + - - - - Acepta primer de ARN + + - ? - Acepta primer de ADN + + + + + Sensible a afidicolina + + - + - Polimerización 5´Æ3´ 33 34 La replicación en los eucariotas es similar a la bacteriana La replicación en los eucariotas es similar a la bacteriana La unión de PCNA (proteína tipo anillo corredizo) desplaza a la polimerasa α y recluta a la polimerasa δ que continua la sintesis de la hebra continua Reconocimiento de origenes y unión de helicasa (antigeno T) La helicasa comienza la disociación de hebras Se une el complejo formado por la primasa y polimerasa α, a la hebra retardada, se sintetiza el cebador Se asocian proteínas de unión a cadena simple que mantienen las hebras en condiciones para la replicacion (RPA) Se une la proteína RFC a la he bra retardada y la polimerasa α procede a la síntesis de los fragmentos de Okazaki Se une un complejo formado por la primasa y polimerasa α, y se sintetiza el cebador Se une la proteína RFC y comienza la síntesis por la polimerasa α 35 36 replicación reparación reparación? replicación continua La horquilla de replicación eucariota El problema de replicar los extremos de moléculas de ADN lineales Como se inicia la replicación en el extremo 5´? 37 38 Replicación en los telómeros REPLICACIÓN DE LA CROMATINA Telomerasa •Enzima que cataliza la síntesis de los extremos •Ribozima que contiene una molécula de ARN que sirve como molde •El ARN guía la adición de los nucleótidos correctos •Niveles variables de actividad de la telomerasa •regulan la división celular y el envejecimiento 39 40