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División de Ciencias Biológicas y de la Salud
Ingeniería Bioquímica Industrial
INGENIERÍA ENZIMÁTICA
PROBLEMARIO
Dr. Sergio Huerta Ochoa
NOTA: Los ejercicios presentados en este problemario, son una recopilación de problemas:
encontrados en internet en páginas de libre acceso y de otras Universidades e Instituciones,
y pretenden ser una herramienta para reforzar conceptos de cinética enzimática.
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Ingeniería Bioquímica Industrial
1. ECUACIÓNDE MICHAELIS-MENTEN
Considera una enzima industrial importante, la cual cataliza la conversión de un
sustrato para formar un producto con un valor agregado mayor. La enzima sigue el
siguiente mecanismo:
Un análisis inicial de las tasas de reacción para la reacción en solución, con E0 = 0.10
µM y varias concentraciones de sustrato S0, produce los siguientes parámetros de la
ecuación de Michaelis-Menten:
Vmax = 0.60 µM/s; KM = 80 µM.
Un tipo de experimento diferente indica que la constante de la tasa de asociación, k1,
es
k1 = 2.0 x 106 M-1s-1 (2.0 µM-1s-1).
Estima el valor de k2 y k-1.
Solución:
De la definición de Vmax tenemos:
k2 =
Vmax = k 2 [E 0 ]
Vmax 0.6 ⋅ µM/s
=
= 6 ⋅ s -1
[E0 ] 0.1 ⋅ µM
De la definición de la constante de Michaelis-Menten, KM, tenemos:
k + k2
K M = −1
k1
(
) (
)
k −1 = K M k1 − k 2 = (80 ⋅ µM ) 2 ⋅ µM −1s −1 − 6 ⋅ s −1 = 154 ⋅ s −1
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En experimentos de laboratorio, se utilizaron dos decarboxilasas (A y B) obtenidas de
diferente microorganismo (ver tabla). Decida cual enzima demuestra un mayor
coeficiente de especificidad, (Vmax/ Km), recuerde que entre mayor sea el valor del
coeficiente de especificidad más específica es la enzima por el substrato.
Enzima A
Velocidad
[S]
(mM)
(µM/min)
0.0002
0.3373
0.0002
0.3364
0.0005
0.6945
0.0005
0.6957
0.001
1.0764
0.001
1.1407
0.005
1.9636
0.005
1.7706
0.01
2.0641
0.01
2.0751
Enzima B
Velocidad
[S]
(mM)
(µM/min)
0.005
0.3962
0.005
0.3857
0.01
0.6163
0.01
0.6413
0.05
1.5606
0.05
1.5689
0.1
1.9862
0.1
1.7909
0.25
2.2011
0.25
2.2047
Solución:
3.5000
y = 0.5081x + 0.4224
R² = 0.999
3.0000
2.5000
Vmax =
2.36719094
(µM/min)
KM
=
1.20279143
(μM)
Vmax/KM =
1.968
2.0000
1.5000
min
-1
1.0000
0.5000
0.0000
0
2
4
6
3.0000
y = 10.814x + 0.4323
R² = 0.9967
2.5000
Vmax =
2.31346294
(µM/min)
KM
=
25.0185663
(μM)
Vmax/KM =
0.092
2.0000
1.5000
1.0000
0.5000
0.0000
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
min
-1
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La Enzima A es más específica
Para un experimento de una reacción catalizada enzimáticamente, se utilizó una
concentración inicial de sustrato 20 µM y una concentración de enzima 5 nM,
obteniéndose la siguiente curva de progreso:
Tiempo
(min)
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
Sustrato
(µM)
20.00
18.32
16.64
14.97
13.30
11.63
9.96
8.31
6.66
5.02
3.40
Calcula la constante de especificidad, α[=] (µM min)-1 definida como:
k
α = cat
KM
Solución:
Utilizando la ecuación
[S ]0 − [S ] = − K + V
t
M
max
[
S ]0
[
S]
ln
ln 0
[S ]
[S ]
y transformando los datos para obtener los ejes adecuados
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(So-S)/[ln(So/S)]
ln(So/S)
x
y
0.087685 22.8089171 19.1482267
0.18369012 21.7758032 18.2705913
0.28974888 20.7075863 17.3632081
0.40819718 19.5983716 16.4210948
0.5422881 18.4403825 15.4376837
0.69674291 17.2229954 14.4040112
0.87878828 15.9310272 13.3072822
1.10030511 14.5414212
12.128099
1.38291271 13.0160059 10.8344243
1.77265446 11.2825147 9.36582479
25
20
15
10
y = 0.8488x - 0.2134
5
0
10
15
20
25
t/[ln(So/S)]
0.8488 µM/min
0.2134 µM
Vmax =
Km =
k cat =
Vmax 0.8488µM ⋅ min −1
=
= 169.76 min −1
[E ]t
0.005µM
α=
k cat 169.76 min −1
=
= 795.5µM −1 min −1
KM
0.2134µM
En un experimento se midió la tasa inicial de una reacción enzimática, v, a varias
concentraciones de substrato [S]. La concentración de la enzima es 3 nM. Se graficó
[S]/v versus [S] y se observó una línea recta en la cual el intercepto-y es 590.6 s y la
pendiente es 0.3684 s µM-1. ¿Cuál es el valor de KM y el de Vmax para esta reacción
enzimática? ¿Cuál es el valor de kcat para esta enzima?
Solución:
[S]/v
Se observa que se utilizó la ecuación de Hanes-Woolf
[S ] = 1 [S ] + K M
v Vmax
Vmax
KM/Vmax
Los datos del problema son:
m = 0.3684 s µM-1
-KM
1/Vmax
[S]
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b = 590.6 s
1
Vmax =
= 2.7144 ⋅ µM ⋅ s −1
0.3684
K M = 590.6 ∗ Vmax = 590.6 ∗ 2.7144 = 1,603.12 ⋅ µM
Sabemos que Vmax = kcat [E]t, por lo tanto
Vmax 2.7144 ⋅ µM ⋅ s −1
k cat =
=
= 904.8 ⋅ s −1
[E ]t
0.003 ⋅ µM
Calcule la concentración de sustrato necesaria para observar un 75% de la velocidad
máxima de una reacción enzimática con una constante de afinidad, KM, 3 µM.
Solución:
Re-arreglando la ecuación de Michaelis-Menten
[S ]
v
=
Vmax K M + [S ]
despejando [S] tenemos
KM
3 ⋅ µM
[S ] =
=
= 9 ⋅ µM
 1
  1

− 1

− 1 
 v / Vmax
  0.75 
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2. PROBLEMAS DE INHIBICIÓN
Calcule vi y el grado de inhibición causado por un inhibidor competitivo bajo las
siguientes condiciones:
a). [S]=2x10-3 M y [I]=2x10-3 M
b). [S]=4x10-4 M y [I]=2x10-3 M
c). [S]=7.5x10-3 M y [I]=1x10-5 M
Asume que KM=2x10-3 M, KI=1.5x10-4 M y Vmax=270 nM/min.
Solución:
En cada inciso calculamos la velocidad sin (v0) y con (vi) efectos de inhibición
a).
Vmax [S ]
(
270nM / min ) 2 x10 6 nM
v0 =
=
= 135nM / min
K M + [S ]
2 x10 6 nM + 2 x10 6 nM
(
vi =
(
(
b).
v0 =
)

17.61nM / min 
 ∗ 100 = 1 −
 ∗ 100 = 86.96%
135nM / min 


Vmax [S ] (270nM / min )(4x10 5 nM )
=
= 45nM / min
K M + [S ]
2x10 6 nM + 4x10 5 nM
Vmax [S ]
(270nM / min )(4x10 5 nM )
=
= 3.72nM / min
 [I ] 

2 x10 6 nM 
6
5
 + [S ] (2x10 nM )1 +
 + 4x10 nM
K M 1 +
5
K
1
.
5
x
10
nM


i 

 v
i% = 1 − i
 v0
c).
v0 =
vi =
)
Vmax [S ]
(270nM / min ) 2 x10 6 nM
=
= 17.61nM / min
 [I ] 

2x10 6 nM 
6
6
 + [S ] 2x10 nM 1 +
 + 2 x10 nM
K M 1 +
5
 1.5x10 nM 
 Ki 
 v
i% = 1 − i
 v0
vi =
)

 3.72nM / min 
 ∗ 100 = 1 −
 ∗ 100 = 91.74%
45nM / min 


(
)
Vmax [S ] (270nM / min ) 7.5x106 nM
=
= 213.16nM / min
K M + [S ]
2 x106 nM + 7.5x106 nM
(
)
Vmax [S ]
(270nM / min ) 7.5x10 6 nM
=
= 210.21nM / min
 [I ] 

1x10 4 nM 
6
6
 + [S ] 2x10 nM 1 +
 + 7.5x10 nM
K M 1 +
5
 1.5x10 nM 
 Ki 
 v
i% = 1 − i
 v0
(
)

 210.21nM / min 
 ∗ 100 = 1 −
 ∗ 100 = 1.38%
 213.16nM / min 

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(a) ¿Qué concentración de inhibidor competitivo se requiere para producir 75% de
inhibición a una concentración de sustrato de 1.5x10-3 M si KM=2.9x10-4 M y KI=2x10-5
M? (b) ¿A qué concentración debe incrementarse el sustrato para re-establecer la
velocidad al valor original sin inhibición?
Solución:
a). La fórmula del grado de inhibición para inhibición competitiva es:
100[I ]
i% =

[S ]  + [I ]
K i 1 +
K M 

Despejando [I]

[S ]  (75) 2 x10 −5 M 1 + 1.5 x10 −3 M 
i% K I 1 +
 2.9 x10 −4 M 
K M 


 = 3.7 x10 − 4 M
[I ] =
=
100 − i%
(100 − 75)
b)
Sin inhibición
v
Con inhibición
(
)
(Ec. Michaelis)
v0
[S]0
(Inhibidor Competitivo)
vi
v0 = vi
[S]i
[S]
De la gráfica observamos que v0 = vi , igualando las ecuaciones de velocidad tenemos:
Vmax [S ]0
Vmax [S ]i
=
K M + [S ]0

[I ]  + [S ]
K M 1 +
i

 KI 
Despejando [S]i tenemos
−4


[S ]i = [S ]0 1 + [I ]  = 1.5x10 −3 M 1 + 3.7 x10−5 M  = 2.93x10 −2 M
2 x10 M 

 KI 
(
)
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Calcule KI para un inhibidor no-competitivo si una concentración de inhibidor
[I]=2x10-4 M produce 75% de inhibición de una reacción catalizada enzimáticamente.
Solución:
Para un inhibidor no-competitivo el grado de inhibición está dado por
100[I ]
i% =
K i + [I ]
despejando KI
 100 
 100 
K I = [I ]
− 1 = 2x10− 4 M 
− 1 = 6.67 x10−5 M
i
75


 %

(
)
Calcule (a) la velocidad y (b) el grado de inhibición de una reacción catalizada
enzimáticamente en presencia de 6x10-4 M de sustrato (KM=1x10-3 M) y 2.5x10-4 M de un
inhibidor no-competitivo (KI=3x10-5 M). La Vmax=515 nM/min.
Solución:
v0 =
(
)(
)
Vmax [S ]
5.15x10-7 M / min 6 x10−4 M
=
= 1.93x10-7 M / min
K M + [S ]
1x10-3 M + 6 x10− 4 M
Vmax
[S ]
 [I ] 
1 +

K I 

vi =
=
K M + [S ]
5.15x10−7 M
6 x10− 4 M
−4
 2.5x10 M 
1 +

3x10−5 M 

= 2.07 x10−8 M / min
−3
−4
1x10 M + 6 x10 M
(
)
 v 
 2.07x10-8 M / min 
 ∗ 100 = 89.29%
i% = 1 − i  ∗ 100 = 1 −
-7
v
1.93x10
M
/
min


0 

Considere una reacción enzimática, en presencia de un inhibidor competitivo. La
constante de Michaelis (KM) es 3.5 x 10-4 M, la constante de inhibición (Ki) es 1.7 x 10-5
M y la concentración del inhibidor [I] es 7.5 x 10-5 M. Calcule la concentración de
sustrato a la cual la velocidad observada en presencia del inhibidor es 3/4 de la
velocidad observada sin inhibición, es decir, una actividad relativa igual a 0.75
Solución:
Para un inhibidor competitivo la actividad relativa está dada por:
K M + [S ]
;
despejando [S]
a=

[
I]
 + [S ]
K M 1 +
K i 

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 [I ] 
a ⋅ K M 1 +  − K M
 Ki 
[S ] =
= 4.28x10−3 ⋅ M
(1 − a )
En un experimento se midió la tasa inicial de una reacción enzimática, v, a varias
concentraciones de substrato [S]. La concentración de la enzima es 10 nM. Se graficó
1/v versus 1/[S] y se observó una línea recta en la cual el intercepto-y es 0.005 nM-1 seg
y la pendiente es 200 seg. ¿Cuál es el valor de KM y el de Vmax para esta reacción
enzimática? ¿Cuál es el valor de kcat para esta enzima? ¿Determine el coeficiente de
especificidad? 30 µM de un inhibidor, E, es adicionado y se observó que el interceptoy es 0.0065 nM-1 seg y la pendiente es 260 seg. ¿Qué tipo de inhibición se observó?
¿Cuál es el valor de Ki para el inhibidor con esta enzima?
Solución:
Se observa que se utilizó la ecuación de Lineweaver-Burk
1 KM 1
1
=
+
v Vmax [S ] Vmax
1/v
1/Vmax
Los datos del problema son:
m = 200 s
b = 0.005 s nM-1
KM/Vmax
-1/KM
1
= 200 ⋅ nM ⋅ s −1
0.005
K M = 200 ∗ Vmax = 200 ∗ 200 = 40,000 ⋅ nM
Sabemos que Vmax = kcat [E]t, por lo tanto
V
200 ⋅ nM ⋅ s −1
k cat = max =
= 20 ⋅ s −1
10 ⋅ nM
[E ]t
El coeficiente de especificidad es:
k
20 ⋅ s −1
α = cat =
= 0.0005 ⋅ s −1nM −1
K M 40,000 ⋅ nM
En presencia del inhibidor tenemos
m = 260 s
b = 0.0065 s nM-1
1
app
Vmax
=
= 153.846 ⋅ nM ⋅ s −1
0.0065
K Mapp = 260 ∗ Vmax = 260 ∗ 153.846 = 40,000 ⋅ nM
Vmax =
1/[S]
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K M = K Mapp ,
Se observa que:
app
Vmax > Vmax
y
Por lo tanto se trata de una Inhibición no competitiva, entonces
app
Vmax
=
Vmax

[I ] 
1 +

K i 

Despejando Ki
Ki =
[I ]
V max
app
V max
−1
=
30,000
= 100,000 ⋅ nM
200
−1
153.846
Para una reacción enzimática en presencia de un inhibidor competitivo, la velocidad
de reacción observada a una concentración de sustrato [S]i = 1.5 x 10-3 M es igual a la
velocidad de reacción sin el inhibidor a una concentración de sustrato [S]0 = 7.69 x 105
M. Calcule la constante de inhibición, Ki, del inhibidor si su concentración [I] = 3.7 x
10-4 M.
Solución:
Para un inhibidor competitivo la relación [S]0 a [S]i para observar una misma velocidad es:
[S ]i = [S ]0 1 + [I ] 



Ki 
Despejando Ki
Ki
[I ]
=
[S ]i − 1 =
[S ]0
−4
3.7 x10 M
= 2 x10 −5 M
−3
1.5x10 M
−1
7.69x10 −5 M
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Utilice los siguientes datos experimentales para obtener la concentración de sustrato
[S] en la cual se obtiene un grado de inhibición del 60 % para una reacción enzimática
en presencia de un inhibidor [I].
[S]
mM
0.200
0.250
0.333
0.500
1.000
2.000
2.500
3.330
4.000
5.000
Velocidad (nM/min)
Control
[I] = 6 µM
16.67
6.25
20.00
7.69
24.98
10.00
33.33
14.29
50.00
25.00
66.67
40.00
71.40
45.45
76.92
52.63
80.00
57.14
83.33
62.50
Solución:
Primero se determina qué tipo de inhibición se tiene, por lo tanto
Analizando los datos cinéticos mediante Lineweaver-Burk se tiene que:
app
Vmax = Vmax
= 100nM / min
K M = 999,860 ⋅ nM
K Mapp = 2,999,900 ⋅ nM
<
Por lo tanto es una inhibición competitiva, y Ki se calcula como:
Ki =
[I ]
app
M
K
−1
KM
=
6,000 ⋅ nM
= 2,999.52 ⋅ nM
2,999,900nM
−1
999,860nM
Despejando [S] de:
i% =
100[I ]

[S ]  + [I ]
K i 1 +
K M 

se tiene:
[S ] = K M  [I ]  100 − 1 − 1 = 333,500 ⋅ nM


 K i  i%




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En un experimento se midió la tasa inicial de una reacción enzimática, v, a varias
concentraciones de substrato [S]. La concentración de la enzima es 3 nM. Se graficó
[S]/v versus [S] y se observó una línea recta en la cual el intercepto-y es 590.6 s y la
pendiente es 0.3684 s µM-1. ¿Cuál es el valor de KM y el de Vmax para esta reacción
enzimática? ¿Cuál es el valor de kcat para esta enzima?
Solución:
Se observa que se utilizó la ecuación de Hanes-Woolf
[S ] = 1 [S ] + K M
[S]/v
v Vmax
Vmax
Los datos del problema son:
m = 0.3684 s µM-1
b = 590.6 s
KM/Vmax
1/Vmax
-KM
Vmax =
1
= 2.7144 ⋅ µM ⋅ s −1
0.3684
K M = 590.6 ∗ Vmax = 590.6 ∗ 2.7144 = 1,603.12 ⋅ µM
Sabemos que Vmax = kcat [E]t, por lo tanto
k cat =
Vmax 2.7144 ⋅ µM ⋅ s −1
=
= 904.8 ⋅ s −1
[E ]t
0.003 ⋅ µM
El coeficiente de especificidad es:
α=
kcat
904.8 ⋅ s −1
=
= 0.564 ⋅ s −1µM −1
K M 1,603.12 ⋅ µM
[S]