Ionización a presión atmosférica - Departamento de Química Orgánica
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METODOS DE IONIZACION Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 1 METODOS DE IONIZACION TÉCNICAS DE IONIZACIÓN EN FASE GASEOSA TÉCNICAS DE IONIZACIÓN EN FASE CONDENSADA TÉCNICAS DE IONIZACIÓN EN FASE LÍQUIDA A PRESIÓN ATM. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 2 Incompatibilidad LC-MS HPLC MS Opera en fase líquida Opera a T 25-50 ºC No hay limitación a tipo de muestra No hay limitación a PM Usa buffers Opera en fase gaseosa Opera a 100-350 ºC Volatilidad deseable Limitación en PM No tolera bien buffers Genera flujos de gases mayores de 10 torr x l x s-1 Acepta flujos de gases menores de 0.15 torr x l x s-1 Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 3 Incompatibilidad LC-MS Solución ? Aumentar la capacidad de bombeo J caro Eliminar el solvente J discrimina Hacer split J baja la sensibilidad Hacer split con enriquecimiento J difícil Técnicas API (Ionización a Presión Atmosférica) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 4 METODOS DE IONIZACION TÉCNICAS DE IONIZACIÓN EN FASE LÍQUIDA A PRESIÓN ATM CFFAB PB TS Técnica Flujo contínuo de FAB (1985) Haz de Partículas (1988) Thermospray (1983) ESI APCI APPI APLI Técnicas API Electrospray (Ionspray + Nanospray) (1988) Ionización Química a Presión atmosférica (1986) Fotoionización a Presión atmosférica (2000) Ionización por láser a Presión atmosférica (2005) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 5 Métodos de ionización Flujo contínuo de FAB - CFFAB Flujo: 1 a 20 µl/min Transportador: H2O:glicerol 95:5 Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 6 Métodos de ionización Flujo contínuo de FAB - CFFAB FAB estático CFFAB • Análisis intermitente • Análisis contínuo • Mayor ruido (mayor % de matriz) • Menor ruido • Menor sensibilidad • Mayor sensibilidad • Supresión de la ionización • Menor % de supresión de ioniz. • Difícil de cuantificar • Más fácil de cuantificar • Puede incorporar sc acuosas • Lím. PM > 5000 • Lím. PM 2000 Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 7 Métodos de ionización Flujo contínuo de FAB - CFFAB Espectros de FAB y CCFAB de una mezcla de 7 péptidos en similar concentración Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 8 METODOS DE IONIZACION TÉCNICAS DE IONIZACIÓN EN FASE LÍQUIDA A PRESIÓN ATM CFFAB PB TS Técnica Flujo contínuo de FAB (1985) Haz de Partículas (1988) Thermospray (1983) ESI APCI APPI APLI Técnicas API Electrospray (Ionspray + Nanospray) (1988) Ionización Química a Presión atmosférica (1986) Fotoionización a Presión atmosférica (2000) Ionización por láser a Presión atmosférica (2005) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 9 Métodos de ionización Haz de partículas – PB particle beam MAGIC: Monodisperse Aerosol Generating Interface for Chromatography Nebulización LC Desolvatación Transf. Gotas 50-200 nm He Ionización 2-10 torr 0.1-1 torr EI, CI !! Separador por momento nozzle skimmers Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 10 Métodos de ionización Haz de partículas – PB particle beam Características muestra/técnica Flujos: 0.1 a 0.5 ml/min Límite de masa: 1000 u • Difícil de cuantificar • La sensibilidad depende de las condiciones experimentales • No es útil con compuestos muy lábiles o muy no volátiles (o muy volátiles) • La performance se deteriora a medida que aumenta el % de agua de la fase móvil Se puede obtener información estructural de compuestos térmicamente lábiles Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 11 Métodos de ionización Haz de partículas – PB particle beam PB DEI Comparación de espectros obtenidos por PB y DEI Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 12 METODOS DE IONIZACION TÉCNICAS DE IONIZACIÓN EN FASE LÍQUIDA A PRESIÓN ATM CFFAB PB TS Técnica Flujo contínuo de FAB (1985) Haz de Partículas (1988) Thermospray (1983) ESI APCI APPI APLI Técnicas API Electrospray (Ionspray + Nanospray) (1988) Ionización Química a Presión atmosférica (1986) Fotoionización a Presión atmosférica (2000) Ionización por láser a Presión atmosférica (2005) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 13 Métodos de ionización o TS (95%) Electrodo de descarga Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 14 Métodos de ionización Thermospray (iones preformados) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 15 Métodos de ionización Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 16 Métodos de ionización Thermospray Facultad de Ciencias Exactas y Naturalesumbeliferilo Espectro TS de glucurónido de 4-metil UBA 17 Métodos de ionización Thermospray Corriente iónica vs voltaje del electrodo repulsor para: Furosemida (diurético) a) m/z 81 b) m/z 331 (M+H)+ c) m/z 348 (M+NH4)+ Altura del electrodo repulsor A 2 mm B 4 mm C 6 mm Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 18 Métodos de ionización Thermospray Características muestra/técnica Flujos: 0.5-2 ml/min Límite de masa: 2000 u • Útil con compuestos térmicamente lábiles, polares o iónicos • Puede usarse (es mejor) con altos contenidos de agua en la fase móvil • La adición de un electrodo de descarga aumenta el tipo de compuestos a analizar • Más fácil de usar que los anteriores • La sensibilidad es compuesto dependiente, pero buena en general • Difícil de reproducir y cuantificar • Las condiciones óptimas de ionización tienen que ajustarse con cada compuesto • Es más suave que CI (Útil para determinar PM) • Se puede obtener información estructural (electrodo repulsor) aunque no es tan fácil de interpretar Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 19 Métodos de ionización Thermospray CI TS Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA Comparación de espectros CI vs TS 20 METODOS DE IONIZACION TÉCNICAS DE IONIZACIÓN EN FASE LÍQUIDA A PRESIÓN ATM CFFAB PB TS Técnica Flujo contínuo de FAB o FAB dinámico (1985) Haz de Partículas (1988) Thermospray (1983) ESI APCI APPI APLI Técnicas API Electrospray (Ionspray + Nanospray) (1988) Ionización Química a Presión atmosférica (1986) Fotoionización a Presión atmosférica (2000) Ionización por láser a Presión atmosférica (2005) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 21 Métodos de ionización APCI Skimmers + + Corona needle + + + + + heated N desechos + + + + detector Quadrupolo Octopolo Capilar + ++ + Lentes + 2 zona de fragmentación (CID) Esquema de la fuente APCI Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 22 Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 23 Métodos de ionización APCI APCI FacultadFuente de Ciencias Exactas y Naturales UBA 24 Métodos de ionización APCI EL PROCESO APCI aerosol conteniendo al analito Evaporación Vapor + ++ + + + ++ + + + + + + + + ++ + ++ ++ Formación de gas reactivo Reacciones ionmolécula + + + + + Iones de analito Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 25 Métodos de ionización APCI . Modo positivo . . . (M+H)+ . (M+NH4)+ . (M+sv)+ Modo negativo (M-H)gas reactivo O2H3O+ + M (M+H)+ Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 26 Métodos de ionización APCI Características muestra/técnica Flujos: 0.5-2 ml/min Límite de masa: 2000 u • Método de elección para análisis de drogas y metabolitos • Útil con compuestos térmicamente lábiles, de no polares a polares • Puede usarse con buffers • Más tolerante a cambios experimentales (fases móviles, gradientes, etc) • Extremadamente sensible • Reproducible y cuantificable • Es más suave que CI (Útil para determinar PM, cuidado con los clusters!) • No se puede obtener información estructural (salvo CVF o MS-MS) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 27 Métodos de ionización APCI Aplicaciones HPLC-APCI de cinco benzodiazepinas Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 28 Métodos de ionización APCI Aplicaciones Espectros APCI (+) de metil prednisilona Sin y con 100 mM de acetato de amonio Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 29 Métodos de ionización APCI Aplicaciones Espectros APCI (-) de metil prednisilona Sin y con 100 mM de acetato de amonio Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 30 Métodos de ionización APCI Aplicaciones APCI- : 12V 219.0 695 [M-H]- EI 203.0 159.0 147.0 220 278.1 277 200 245.0 300 277 400 500 600 700 800 m/z 528.0 584.4 696.7 m/z 100 200 300 400 500 600 700 800 417 APCI- : 40V 695 220 HO 231 CH CH C O CH CH NH C 2 2 2 2 O O 2 m/z 200 300 400 500 600 700 Naugard: MW696 800 Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 31 Métodos de ionización Aplicaciones Carbamatos por APCI: Extracto de tomate con 11 carbamatos 200 pg/µl; inyección 50 µl; modo scan Abund. MS TIC 120000 120000 80000 60000 MS TIC 40000 12000 mAU 6000 80 m/z 163 aldicarb oxamyl UV @ 254 nm 60 1500 40 750 20 5 10 15 20 25 min Condiciones: Muestra: 50 µl x 200 pg/µl Columna: 100 x 4 mm i.d. 3 µm Hypersil BDS cartridge Solventes: A: agua, B: metanol Gradiente: 25-75% B in 20 min @ 0.8 ml/min MS Data: Scan de 100 -510 u APCI Vap 400 °C, Drying Gas = 350 °C aldicarb sulfone m/z 116 aldicarb sulfoxide 12000 m/z 222 carbofuran 6000 2000 m/z 202 carbaryl 1000 m/z 226 promecarb 3000 methiocarb 1500 2.5 5 7.5 Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 10 12.5 15 17.5 min 32 METODOS DE IONIZACION TÉCNICAS DE IONIZACIÓN EN FASE LÍQUIDA A PRESIÓN ATM CFFAB PB TS Técnica Flujo contínuo de FAB o FAB dinámico (1985) Haz de Partículas (1988) Thermospray (1983) ESI APCI APPI APLI Técnicas API Electrospray (Ionspray + Nanospray) (1988) Ionización Química a Presión atmosférica (1986) Fotoionización a Presión atmosférica (2000) Ionización por láser a Presión atmosférica (2005) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 33 APPI Métodos de ionización Esquema de la interfase APPI-MS Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 34 Métodos de ionización APPI Fotoexitación AB + hν AB* MP + hν MP* Fotodisociación: AB analito MP fase móvil AB* Decaimiento radiactivo: AB* A+B AB + hν ¨Quenching¨ colisional: AB* + MP AB + MP* ¨Quenching¨ colisional: AB* + gas AB + gas* Cuando hν > IE Ionización: AB* Recombinación: AB AB gas, MP, e Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA +e - AB 35 Métodos de ionización APPI dopantes Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Energías de ionización para UBA diferentes compuestos 36 Métodos de ionización APPI dopantes Modo positivo (M+H)+ D + hν D M D + AB D + AB Modo negativo (M-H)D + MP (MP + H) (D-H) + (MP+H) + AB MP + (AB + H) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA M 37 Métodos de ionización APPI HPLC-MS de pesticidas Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 38 Métodos de ionización APPI Influencia de solventes sobre HPLC-MS Requerimientos similares para APPI y APCI (ambos útiles con moléculas de polaridad media y compatibles con fase normal) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 39 METODOS DE IONIZACION TÉCNICAS DE IONIZACIÓN EN FASE LÍQUIDA A PRESIÓN ATM CFFAB PB TS Técnica Flujo contínuo de FAB o FAB dinámico (1985) Haz de Partículas (1988) Thermospray (1983) ESI APCI APPI APLI Técnicas API Electrospray (Ionspray + Nanospray) (1988) Ionización Química a Presión atmosférica (1986) Fotoionización a Presión atmosférica (2000) (Ionización por láser a Presión atmosférica) (2005) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 40 Métodos de ionización APLI Ionización por láser a Presión atmosférica Mecanismo de ionización: ionización multifotónica resonante (REMPI Resonantly enhanced multi-photon ionization) sin electrodo IS Ion source DP vacío diferencial IO óptica iónica A analizador + y – electrodos de repulsión/extracción Láser: 248 nm (KrF) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Ref.: RCM (2005) 19, 326-336. UBA 41 Métodos de ionización APLI Espectro APLI de una muestra control en la síntesis del producto indicado arriba C114H138Ir N3 Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 42 METODOS DE IONIZACION TÉCNICAS DE IONIZACIÓN EN FASE LÍQUIDA A PRESIÓN ATM CFFAB PB TS Técnica Flujo contínuo de FAB o FAB dinámico (1985) Haz de Partículas (1988) Thermospray (1983) ESI APCI APPI APLI Técnicas API Electrospray (Ionspray + Nanospray) (1988) Ionización Química a Presión atmosférica (1986) Fotoionización a Presión atmosférica (2000) (Ionización por láser a Presión atmosférica) (2005) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 43 Métodos de ionización FUENTE de ESI HPLC detector octopolo gas nebulizador cuadrupolo + ++ + + + ++ + + + + + + N2 caliente 0.6 mm I.D. capilar dieléctrico 3-6 kV + 1 x 10-5 Torr 3 Torr skimmer lentes Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 44 Métodos de ionización FUENTE ESI Entrada a la fuente Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 45 Métodos de ionización FUENTE ESI Inlet Cono Waters Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 46 Métodos de ionización ESI CH 3 O NH 2 S N NH N O CH 3 Sulfamethazina 12,000 Cono de extracció extracción 12,000 [M+H]+ Región Ion precursor 10,000 10,000 8,000 Intensity 6,000 Cono de ingreso de muestra 30V 8,000 4,000 MW 278 Positive ion mode, ESI, 2 ul/min, 50% MeOH:49% H2O:1% HOAc 2,000 6,000 277 278 279 280 281 282 m/z 4,000 Hexapolo 2,000 0 100 150 200 m/z 250 300 Waters Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 47 Métodos de ionización ESI 156 CH 3 92 O NH 2 S O N NH N CH 3 186 Sulfamethazina Cono de extracció extracción 10,000 10,000 MW 186 8,000 C6H8N3O2S Intensity 6,000 Cono de ingreso de muestra 70V 8,000 4,000 2,000 6,000 183 184 185 186 187 188 m/z 4,000 [M+H]+ Disociació Disociación inducida por colisiones antes del ingreso al analizador Hexapole ionion-bridge 2,000 0 100 150 200 m/z 250 300 Waters Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 48 Métodos de ionización FUENTE ESI variantes Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 49 Métodos de ionización EL PROCESO ESI Gotas cargadas Analitos: Iones Clusters Ion-Solvente Pares sales/Iones Neutros + + + + + - + + + + + Evaporación + ++ + --- + - + + + + Cluster ion-solvente + Ion de analito + + + + + + + -- + + + Se alcanza elLimite Rayleigh + + -- + + Explosiones coulómbicas Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 50 Métodos de ionización EL PROCESO ESI Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 51 Métodos de ionización EL PROCESO ESI Fotografía de una gota cargada en el acto de fisionarse Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 52 Métodos de ionización EL PROCESO ESI Es conveniente la formación de gotas pequeñas Solvente: Evitar sv con elevada tensión superficial o muy densos 50% orgánico polar : H2O Potencial sobre el capilar Exceso de carga descargas Buffers Alta conc. de buffer reduce el tamaño afecta la ionización Flujo: nl/min (nanoESI), 0.5-5 µl/min (microESI), 1-10 µl/min (ESI), 1-2 ml/min (ionspray) Diámetro del capilar: 1-2 µm (nanoESI), 15-20 µm (microESI), 100-200 µm (ESI) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 53 Métodos de ionización ESI 23+ 14+ 10+ Espectro ESI de mioglobina (M+nH)n+ Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 54 Métodos de ionización Electrospray - ESI MH = 1 mi = MR + i MH i mi+1 = MR + ( i + 1) MH i = MR + i mi i ( m i - 1) = M R MR = m i + 1 ( i + 1 ) - ( i + 1 ) i+1 i = mi+1 - 1 mi -mi+1 Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 55 Métodos de ionización Electrospray - ESI Espectro ESI de una proteína de PM 47005 procesada con diferentes algoritmos Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 56 Métodos de ionización Electrospray - ESI Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 57 Métodos de ionización Electrospray - ESI ESI vs pH Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Espectros ESI de citocromo c (se varió el pH con AcOH) UBA 58 Métodos de ionización Electrospray - ESI ESI de lisozima de huevo a dos potenciales de skimmers Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 59 Métodos de ionización Electrospray - ESI Tipos de analito • Compuestos iónicos (cargados en solución) • Compuestos neutros polares que puedan protonarse-deprotonarse (aditivos) • Compuestos no polares que puedan oxidarse en el capilar Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 60 Métodos de ionización Electrospray - ESI Efectos de competición/supresión Facultad Ciencias Exactas y Naturales Espectro ESI de unademezcla equimolar de tripéptidos UBA 61 Métodos de ionización Electrospray - ESI Efectos de competición/supresión Uso de buffers volátiles Uso de ácidos que no forman pares iónicos Uso de sales neutras (modo positivo) Uso de solventes halogenados (modo negativo) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 62 Métodos de ionización ESI Mapeo de péptidos Chromatographic Conditions mAU Column: 150 x 2.1mm Zorbax® Extend SB-C8, 5 µm Mobile phase: A=10 mM NH4OH in water B=15 mM NH4OH in 60% acetonitrile/water Gradient: start at 0% B for 5 minutes then 58% at 40 minutes Flow rate: 0.2 ml/min Column temperature: 40°C Sample: tryptic digest of cytochrome C Injection volume: 2 µl (164 pg on column) Diode-array detector: signal 210, 4 nm UV 210 nm 40 20 0 -20 -40 10 15 20 25 30 min ESI MS Conditions Source: ESI Ion mode: positive Vcap: 4500 V Nebulizer: 25 psig Drying gas flow: 10 l/min Drying gas temp: 300 °C Scan range: 300 - 2500 amu Stepsize: 0.15 Peakwidth: 0.22 min Time filter: on Fragmentor: 100 V MS 300000 200000 100000 0 10 15 20 25 30 min Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 63 Métodos de ionización Electrospray - ESI + de fumonisina FacultadESI de Ciencias Exactas y Naturales Espectro FB1 UBA 64 Métodos de ionización ESI vs LSIMS LSIMS ESI Espectros de lisozima PM 14305 Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 65 Métodos de ionización Thermospray: 1-10 torr Temp. altas Distribución estadística del exceso de cargas (= nº +/ -) Gotas más grandes (10-20 µm) Necesidad de usar electrolito. Solventes acuosos No se pueden usar buffers no volátiles Flujos: 1-1.5 ml/min PM h/2000 Moléculas moderadamente no volátiles y lábiles Electrospray: P. atm (ISP= ion spray) T. amb. Exceso de un tipo de carga Gotas más chicas (1-2 mm) Se pueden usar aditivos Solventes de no tan alta conductividad (ISP no) y que nebulicen bien (ISP no) Flujos: h/ 10 µl/min (ISP h/ 2 ml/min) PM muy altos Moléculas muy polares APCI: P. atm Temp. altas (aprox) Cualquier solvente y buffer Flujos: 0.5-2 ml/min PM no muy altos (T) Moléculas moderadamente no volátiles lábiles (sin sitios ácidos o básicos) Facultad de Ciencias Exactas yyNaturales 66 UBA Métodos de ionización Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 67 Comparación de técnicas de ionización Lím. PM (práctica) Ventajas Desventajas Tipo de compuestos EI 1000 (500) Amplia disponibilidad Utilidad de fragmentaciones Alta sensibilidad Alta resolución Fácil acoplamiento GC/MS Bajo lím. de PM Puede haber demasiada fragmentación Moléculas pequeñas No polares Térmicamente estables CI 1000 (500) Amplia disponibilidad Fácil acoplamiento GC/MS y EI/CI Bajo lím. de PM Requiere uso de gases de alta pureza Moléculas pequeñas No polares Térmicamente estables FAB 24000 (7000) Alta disponibilidad Adaptable a alta resolución Requiere matriz Interferencia de la matriz Menor sensibilidad Péptidos Carbohidratos Nucleótidos Moléculas polares relativ. pequeñas MALDI 450000 (200000) Tolerancia de mezclas Alta sensibilidad Requiere matriz Interferencia de la matriz Proteínas Carbohidratos Nucleótidos Moléculas polares ESI 200000 (70000) Cargas múltiples Cargas múltiples Alta capacidad LC/MS Sensible a condiciones experim. Alta sensibilidad (sales, pH, etc.) Técnica más suave Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA Proteínas Carbohidratos Nucleótidos Moléculas polares 68 Bibliografía - Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Cole R. B. 1997. John Wiley & Sons - A global view of LC/MS. Willoughby R., Sheehan E., Mitrovich S. 2002. Global view publishing. - Continuous-Flow Fast Atom Bombardment Mass Spectrometry. Caprioli R. M. 1990. John Wiley & Sons. - Liquid Chromatography-Mass Spectrometry. An Introduction. Ardrey B. 2003. Wiley. - Liquid Chromatography-Mass Spectrometry. Niessen W. M. A. 1999. Marcel Dekker, inc. - Practical Organic Mass Spectrometry. Chapman J. R. 1993. John Wiley & sons Ltd. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA 69
