Métodos usados para diagnosticar las infecciones

I+D EMPRESAS I IDT BIOLOGIKA
Métodos usados para
diagnosticar las infecciones
por Escherichia coli
Verena Gotter
International Technical Service
of IDT Biologika
[email protected]
Las infecciones por Escherichia coli son
muy comunes en los cerdos. Esto no es
ninguna sorpresa, ya que E. coli forma
parte de la flora intestinal. Sin embargo, los cerdos pueden enfermar cuando
aumenta el número de E. coli patógenas
en la microbiota normal del intestino. Se
calcula que anualmente mueren unos 10
millones de cerdos debido a este tipo de
infecciones. Los signos clínicos observados dependen en gran medida del tipo
de E. coli, pero pueden incluir: diarrea,
anorexia, letargo, edemas de la frente,
párpados y garganta, así como trastornos
del sistema nervioso central tales como
la ataxia o convulsiones tónico-clónicas.
También puede producirse la muerte súbita sin signos clínicos previos.
Otro factor que afecta a la forma de manifestarse una infección por E. coli es la
edad del cerdo. Este artículo se centrará
en las infecciones en el periodo posdestete.
Los patotipos ETEC y STEC/VTEC son
los que principalmente causan enfermedades en los cerdos después del destete.
Los investigadores creen que alrededor
del 50 % de las muertes debidas a infecciones por E. coli son causadas por
ETEC. En cuanto a VTEC y STEC, la
prevalencia varía entre países, pero diferentes estudios han mostrado rangos que
se sitúan entre el 11 y el 75 %.
En estos dos grupos, E. coli tiene diferentes tipos de factores de adhesión y toxinas. ETEC tienen factores de adhesión y
toxinas que causan diarrea, mientras que
STEC/VTEC producen principalmente
la llamada shigatoxina (o verotoxina),
que es la causa de la enfermedad de los
edemas (ED).
DIAGNÓSTICO
Los signos clínicos de una infección
con ETEC o STEC/VTEC son diversos
e inespecíficos. El diagnóstico diferencial de enfermedades infecciosas para la
diarrea (en cerdos destetados) incluye,
por ejemplo, Salmonella spp., Lawso-
nia intracelluralis, Brachyspira hyodysenteriae y Brachyspira pilosicoli. En
cuanto a los otros signos, tales como los
trastornos del sistema nervioso central,
estos también pueden ser causados por
Streptococcus suis, Haemophilus parasuis, enterovirus o teschovirus porcinos
y virus de la enfermedad de Aujeszky;
por citar sólo los más comunes. Y, por
supuesto, también hay numerosas fuentes no infecciosas que pueden causar los
mismos signos clínicos, como la alimentación con colza, la intoxicación por sal,
vitamina E/selenio o el estrés debido a
bajas condiciones de alojamiento (espacio en el corral, temperatura, número de
cerdos por comedero, etc.).
Por esta razón, el diagnóstico es tan importante. Aunque el profesional veterinario puede hacer una suposición sobre
cuál es la posible causa de la enfermedad
basándose en los diferentes signos clínicos y la historia de la explotación, realmente no sabe cuál es la causa principal
hasta que no ha hecho algunas pruebas
más.
Como se menciona anteriormente, hay muchos tipos diferentes de E. coli. La diferenciación y la clasificación han cambiado a lo
largo de los años, ya que con las nuevas técnicas moleculares se han podido establecer
perfiles más precisos. Casi diariamente se
descubren nuevos detalles y las antiguas clasificaciones pierden rápidamente su validez.
En la actualidad, E. coli se clasifica según los
factores de adhesión con los que se adhieren
a los enterocitos del intestino y las toxinas
que producen. Esto se llama patotipo.
Los patotipos definidos en la actualidad
son:
■ E. coli enterotoxigénica (ETEC).
■ E. coli enteropatogénica (EPEC).
■ E. coli productora de shigatoxina o verotoxina (STEC o VTEC).
■ E. coli patógena extraintestinal (ExPEC).
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Suis
CLASIFICACIÓN
Es importante realizar una necropsia completa.
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Tabla 1. Muestras para cultivo bacteriano y PCR.
Tipo de muestra
Análisis
Para diagnosticar/excluir
Cerebro
Cultivo bacteriano
Todas las bacterias
Médula espinal craneal (2-3 cm)
PCR
Enterovirus/teschovirus porcino
Tonsilas (2-3 cm)
PCR
Virus de la enfermedad de Aujeszky
Ganglio linfático mesentérico (2-3 cm)
Cultivo bacteriano
E. coli
Yeyuno distal (2-3 cm)
Cultivo bacteriano
E. coli
Según los signos clínicos observados, se
tomarán las muestras y se realizará el
procedimiento de diagnóstico más adecuado.
En un caso de diarrea tiene sentido tomar
muestras de heces. Estas deben de ser de
cerdos con afección aguda, tomadas directamente del recto y no del suelo del
corral. En los cerdos más pequeños, es
posible tomar muestras con hisopos. El
número de muestras que se recoge depende de la prevalencia de la enfermedad y
del número total de animales de la misma
edad. Hay tablas en las que se ha precalculado cuántas muestras hay que tomar
en función de la prevalencia y el tamaño
del grupo (Cannon y Roe, 1982). Sin embargo, en términos generales, no se debe
tomar menos de 10 muestras. Se recogen
muestras e hisopos de heces para cultivo,
pero no deben ser más de tres muestras
individuales en un pool.
Necropsia e histopatología
Si hay otros signos clínicos además de la
diarrea, el diagnóstico es un poco más
difícil, debido a que las bacterias o los
virus que causan la enfermedad generalmente no se encuentran en las heces. En
estos casos, se debe realizar la necropsia
de los cerdos afectados. Esta se puede
realizar a los animales que murieron debido a la enfermedad o practicar la eutanasia de los que presenten signos clínicos típicos. De cualquier manera, con el
fin de obtener los mejores resultados, los
cerdos no deberían llevar muertos más
de cuatro horas (dependiendo de la temperatura exterior).
Es importante realizar una necropsia completa, no sólo de los órganos que se consideran más relevantes. Además, es crucial
no contaminar las muestras. Por esto, las
necropsias deben tener lugar en un ambiente limpio, y todas las herramientas
(cuchillos, tijeras, fórceps), así como los
Vit Kovalcik/shutterstock.com
Toma de muestras
Los investigadores buscan una PCR que pueda realizarse directamente sobre heces u otras muestras.
contenedores de la muestra, deben ser estériles. Hay que utilizar diferentes herramientas y contenedores para cada cerdo y
los hisopos deben tener medio Amies.
Idealmente, se debe comenzar por la cabeza del animal y continuar en dirección a
la cola. De esta manera se asegura que las
muestras tomadas en el intestino no contaminan otras muestras. La tabla 1 enumera las muestras que se pueden tomar
para cada análisis.
Si no es posible tomar muestras de órganos, también se pueden cortar y abrir los
ganglios linfáticos, o el yeyuno, y tomar
un hisopo de ellos. Ni los hisopos ni las
muestras de órganos se deben mezclar, ni
siquiera si son del mismo cerdo, porque
esto puede falsear los resultados.
Durante la necropsia deben buscarse las
lesiones macroscópicas típicas asociadas a la enfermedad de los edemas, que
son los edemas del tejido subcutáneo de
la frente, los párpados, la vesícula biliar
y del mesenterio del colon. Sin embargo,
puede que ninguno de estos signos estén
presentes, porque la presencia de edemas
depende del tiempo que el cerdo llevaba
enfermo antes de morir y lo pronto que
se le practicó la necropsia. Por lo tanto,
es recomendable tomar muestras de cerebro, médula espinal craneal, ganglios
linfáticos mesentéricos y yeyuno distal
para realizar un análisis histopatológico.
Si es posible, se debe poner en formol
al 10 % el cerebro entero y 3-4 cm de
las otras muestras. Las diferentes muestras del mismo animal se pueden poner
en un recipiente, que debe cubrirse con
formol. La histopatología es importante
porque ayuda a clarificar el diagnóstico
si las lesiones de una patología general
son inespecíficas, y también para juzgar
la relevancia de los resultados del cultivo
bacteriano y PCR.
Si es posible, se debe realizar la necropsia
de 4 o 5 cerdos y tomar, al menos, tres
Tabla 2. Lista de los factores de adhesión y las toxinas más comunes.
Patotipo
Factores de adhesión
Toxinas
ETEC
F4, F18, AIDA, Eae
STa, STb, LT, Stx (VT), EAST-1, hemolisina a
STEC/VTEC
F18, AIDA, Eae
Stx2e (VT2e), EAST-1, hemolisina a
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identifica E. coli por sus antígenos. Este
método se denomina aglutinación en
portaobjeto o serotipificación. El resultado es el serotipo y se enumerará, por
ejemplo, como O139: K82.
Suis
PCR
Toma de muestras con hisopo directamente del recto de un lechón.
de esas muestras para su análisis. Estas
deben ser sólo de los cerdos que no murieron por otras causas obvias, como la
torsión del intestino. Las muestras se deben refrigerar (pero no congelar) y llevar
lo más rápidamente posible al laboratorio
más próximo.
A su llegada, es necesario proporcionar
al laboratorio una historia clínica completa (prevalencia de animales afectados,
duración de la enfermedad, tratamientos previos, etc.), qué signos clínicos
específicos presentaban los animales de
las muestras que se tomaron, así como
la presunta causa etiológica. Asimismo,
hay que informar al laboratorio sobre
qué patógenos deberían analizarse y con
qué método deberían hacerlo. Esto es
importante, ya que hay varios métodos
para identificar un patógeno, que pueden ser muy diferentes según la sensibilidad, la especificidad y el coste. Sólo si
el laboratorio cuenta con toda la información o antecedentes puede realizar el
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análisis adecuado para posteriormente
aconsejar sobre el método a utilizar.
Cultivo
Cuando se sospecha de infección por
ETEC o STEC/VTEC, el primer paso del
análisis es el cultivo bacteriano. Después
de esto, se puede identificar E. coli mediante la determinación de los factores de
adhesión y las toxinas. Las más comunes
se enumeran en la tabla 2. Sin embargo, esta lista puede estar sujeta a cambios cuanto más se conoce sobre ETEC,
STEC/VTEC.
Los factores de adhesión nombrados en
esta lista son principalmente fimbrias
(F). La primera clasificación de E. coli
está basada en la combinación de antígenos fimbriales, somáticos (O), capsulares (K) y flagelares (H). Esto se hizo
poniendo algunas colonias de E. coli
en un portaobjetos y mezclándolas con
suero que tenía anticuerpos específicos.
Cuando se produce la aglutinación, se
Durante muchos años, el diagnóstico
ha dependido de este método, que se ha
considerado una forma barata y fácil de
identificación de E. coli. Con la aparición
de la biología molecular, sin embargo, se
ha hecho evidente que muchas E. coli no
se pueden identificar de esta manera, ya
que no tienen los antígenos que están presentes en los antisueros comunes. Por lo
general, sólo la E. coli que muestra hemólisis en el hemocultivo se somete a la serotipificación, porque todas las cepas de E.
coli más comunes muestran esta característica particular. Sin embargo, investigaciones recientes han demostrado que las
cepas no hemolíticas pueden producir las
toxinas que causan la enfermedad.
Por lo tanto, hoy en día la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se considera
una técnica para identificar E. coli. Este
método muestra los genes que tiene la
cepa de E. coli. Se prueban muchos factores de adhesión y toxinas diferentes; por
lo general más de los que se analizan por
serotipificación. Otra ventaja es que el
método puede ser rápidamente actualizado cuando se identifican nuevos factores.
Sin embargo, la PCR es más costosa que
la serotipificación y más difícil de manejar, por lo que no todos los laboratorios
la ofrecen. Actualmente, se sigue realizando PCR a partir de cepas de E. coli
cultivadas, pero los investigadores están
trabajando en una PCR que pueda realizarse directamente sobre heces u otras
muestras. Esta sería otra gran ventaja, ya
que a menudo no es posible que crezca E.
coli cuando los cerdos han sido tratados
previamente con antibióticos.
CONCLUSIÓN
Cuando se finalizan los diferentes análisis
(necropsia, histopatología, cultivo, PCR,
etc.), y se ponen en común con el historial
de la explotación y las observaciones de
campo, ya se tiene lo necesario para hacer
un diagnóstico adecuado. La veracidad
de estos diagnósticos se basa en pruebas
sólidas. Las medidas que se adopten a
partir de entonces, bien sean terapéuticas
o profilácticas, serán las más sostenibles
en la lucha contra la enfermedad.