TRABAJO PRÁCTICO Nº 5: ÁCIDOS NUCLEICOS DOCENTES: Dr

TRABAJO PRÁCTICO Nº 5:
ÁCIDOS NUCLEICOS
DOCENTES: Dr. Andrés Ciochinni, Dra. Gabriela Niemirowicz.
DESCRIPCIÓN DE LOS MÉTODOS A UTILIZAR
Purificación de ácido desoxiribonucleico (ADN).
El ADN es un polímero de nucleótidos, altamente hidrofílico y con carga neta
negativa debido a la presencia de un grupo fosfato en cada monómero. Por esta razón su
solubilidad en solventes polares es muy alta. En este TP usaremos esta propiedad para
separar ADN bacteriano, en conjunto con un surfactante, el CTAB, el cuál en presencia
de altas concentraciones de sal es capaz de unirse a polisacáridos removiéndolos de la
solución. Por otra parte, el agregado de solventes orgánicos (ej. cloroformo) produce la
partición de las diferentes moléculas en base a su afinidad por los distintos solventes y
ayuda a remover los complejos formados entre CTAB, polisacáridos y proteínas.
Precipitación de ácidos nucleicos
Este método se basa nuevamente en la solubilidad diferencial del ADN. Una
muestra de ADN en solución acuosa precipita al agregársele cationes (para neutralizar
las cargas negativas que posee) y alcohol. El alcohol disminuye la constante dieléctrica
del solvente acuoso, provocando una disminución en la solubilidad del ADN, que en
presencia de altas concentraciones de sales, precipita. Este método es ampliamente
utilizado como una forma de concentrar ADN. Se utilizan dos tipos de alcohol en este
método. El etanol y el isopropanol. La diferencia entre ambos es la capacidad de
disminuir la constante dieléctrica. Mientras que el isopropanol posee una mayor
capacidad y por lo tanto es posible usar menor volumen (solo 0,7 volúmenes, contra 2,5
volúmenes de etanol), tiene la desventaja de precipitar más sales y por lo tanto rinde un
ADN de menor pureza que el etanol. La elección se basa en el volumen manejable,
prefiriéndose el etanol siempre que sea posible debido a la mejor calidad del ADN
obtenido.
Electroforesis en geles de agarosa. Detección de ácidos nucleicos
La electroforesis es una técnica muy utilizada para separar moléculas de acuerdo
a su diferente movilidad en un campo eléctrico. Básicamente la velocidad con la que se
mueve un electrolito es proporcional a la relación carga/masa.
Es de gran utilidad en la separación de proteínas y ácidos nucleicos, debido a que ambas
macromoléculas poseen carga neta. En el caso que nos ocupa, el ADN tiene como ya
hemos señalado, una fuerte carga negativa, por lo que si se lo somete a un campo
eléctrico, migra hacia el ánodo. Sin embargo, la relación carga/masa se mantiene
constante, pues cada unidad monomérica que se agrega aporta la misma carga y masa,
sin modificar así la relación. Con el objetivo de separar moléculas de ADN de distinto
tamaño, es necesario introducir en el medio móvil, una malla que impida la difusión
libre de las moléculas. De este modo, los fragmentos de ADN de mayor tamaño, serán
efectivamente retenidos en relación a aquéllos más pequeños, consiguiendo así resolver
una mezcla heterogénea de fragmentos de acuerdo sólo al tamaño de los mismos.
Para visualizar el ADN utilizamos un compuesto aromático, el bromuro de
etidio, que intercalándose entre las bases nitrogenadas de los pares de nucleótidos,
produce una concentración alta localizada en forma proporcional a la masa de ADN
presente en cada banda. De esta manera, cuando iluminamos el gel con luz UV, ésta
excita las moléculas de colorante emitiendo luz visible. Dado que el colorante se ha
concentrado en las bandas que contienen ADN, el fondo de luz en el resto del gel es
despreciable, y el método es de gran sensibilidad.
Cuantificación de ácidos nucleicos.
Existen dos métodos para cuantificar ácidos nucleicos. 1) Estimación a partir de
la intensidad de fluorescencia emitida por bromuro de etidio, como se describió
anteriormente. 2) Medición espectrofotométrica de la cantidad de irradiación
ultravioleta absorbida por las bases purínicas y pirimidinicas. El primero se utiliza
cuando la concentración de ácidos nucleicos es muy baja o cuando la muestra presenta
cantidades significativas de impurezas mientras que el segundo requiere que la muestra
esté pura (sin proteínas, fenol, agarosa, u otros acidos nucleicos que puedan interferir
con el mismo).
El método espectrofotométrico aprovecha la capacidad de absorción a la luz UV
que presentan las bases purínicas y pirimidinicas presentes tanto en el ADN como en el
ARN. Las purinas y pirimidinas son estructuras que presentan dobles enlaces
conjugados, esta característica permite que los ácidos nucleicos presenten una fuerte
absorción a longitudes de onda cercanas a los 260 nm. En el trabajo práctico
aprovecharemos esta característica para estimar la concentración de ADN bacteriano
purificado.
TRABAJO PRÁCTICO
Objetivos:
Extracción de ADN bacteriano a partir de un cultivo de Escherichia coli
utilizando el método de partición diferencial en solventes orgánicos.
Análisis de la integridad y características de los ADN cromosómico y viral
extraídos, sometidos a manipulaciones enzimáticas y físicas.
1º Parte:
Extracción de ADN cromosómico
Principio
Las bacterias provenientes de un cultivo líquido son lisadas y las proteínas
presentes en el extracto son eliminadas mediante la digestión con proteinasa K. La pared
celular, polisacáridos y proteínas remanentes presentes en el extracto son removidas
mediante una precipitación selectiva empleando CTAB. El ADN de alto peso molecular es
recuperado posteriormente del sobrenadante empleando isopropanol.
Materiales
TE buffer (Tris-HCl 20 mM pH7.6 - EDTA 1mM)
10% dodecil sulfato de sodio (SDS)
20 mg/ml proteinasa K
5 M NaCl
Solución CTAB/NaCl (hexadecyltrimethyl ammonium bromide)
24:1 cloroformo/alcohol isoamílico
25:24:1 fenol/cloroformo/alcohol isoamílico
Isopropanol
Etanol 70%
Protocolo
1. Inocular 5 ml de medio de cultivo con la cepa bacteriana de interés. Crecer en las
condiciones adecuadas para la misma (ej. Medio adecuado, temperatura) hasta que
el cultivo se sature.
2. Centrifugar 1.5 ml del cultivo por espacio de 2 min. Descartar el sobrenadante.
3. Resuspender el pellet en 567 μl de buffer TE. Agregar 30 μl de SDS 10% y 3 μl de
proteinasa K (20 mg/ml). Mezclar suavemente por inversión e incubar 1h a 37°C.
En este punto la solución se debe volver viscosa por acción del detergente el cual provoca
la lisis de la pared bacterina. Alternativamente, se podría emplear lisozima para digerir la
pared bacteriana. ¿Sobre que enlaces actúa la lisozima?
4. Agregar 100 μl de 5 M NaCl. Mezclar cuidadosamente por inversión.
Este paso es muy importante ya que se puede formar un complejo entre el CTAB y el ADN
si la concentración de sal es menor a 0.5 M.
5. Agregar 80 μl de la solución CTAB/NaCl. Mezclar suavemente por inversión e
incubar 10 min a 65°C.
El CTAB es un surfactante empleado para aislar ADN de tejidos que contienen grandes
cantidades de polisacáridos En presencia de altas concentraciones de sal este es capaz de
unirse a polisacáridos removiendolos de la solución.
6. Agregar 1 volumen de cloroformo/alcohol isoamílico. Mezclar por inversión y
centrifugar 5 min.
Esta extracción remueve los complejos formados entre CTAB, polisacáridos y proteínas.
7. Pasar la fase acuosa a un tubo eppendoff nuevo. Agregar 1 volumen
fenol/cloroformo/alcohol isoamílico . Mezclar por inversión y centrifugar 5 min.
8. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo. Agregar 0.6 volumenes de isopropanol
par precipitar el ADN. Agitar el tubo hasta que el ADN comience a precipitar (hilo
blanco). En este punto es posible “pescar” con una pipeta Pasteur de vidrio o
alternativamente se puede centrifugar el tubo eppendorff.
9. Lavar el ADN con etanol 70%.
10. Disolver el pellet en 50 μl de buffer TE.
11. Una vez en el TE, calentarlo a 55oC 10 min. y resuspender muy cuidadosamente
“pipeteando” repetidas veces.
12. Algunos grupos sonicarán el ADN resuspendido, con un tip pequeño dando 2 y 4
pulsos a mediana potencia (6) en un sonicador convencional.
2º Parte:
Cuantificación del ADN genómico purificado.
La cuantificación del ADN bacteriano purificado se llevará acabo mediante el método
espectrofotomético. Para ello se efectuarán lecturas a 260 nm y 280 nm contra blanco
de TE. Considere que una OD de 1 corresponde a aproximadamente a:
- 50 μg/ml de ADN doble cadena.
- 40 μg/ml de ADN simple cadena o RNA.
Determine la concentración de ácidos nucleicos presentes en su muestra. Calcule el
cociente OD260/OD280. ¿Cómo se modifica este resultado de acuerdo a lo visto en la
clase de problemas?
- ¿Por qué efectúa lecturas a 280 nm? ¿Para que se utiliza el cociente OD260/OD280?
- Si ud no conociera la relación 1 OD=50 μg/ml, ¿cómo haría para determinar la
concentración de ADN en la muestra?
- ¿Por qué el ADN doble cadena absorbe menos que el simple cadena? ¿Qué es el
efecto hipocrómico?
Digestión de ADNde λ.
El bacteriófago (fago) λ es un virus de ADN doble cadena capaz de infectar y replicarse
en bacterias. En el trabajo práctico realizaremos distintos tratamientos sobre el ADN
obtenido a partir de este virus.
A- Digestión sitio específica.
Concentración
ADN λ.
NEB Buffer
H 2O
Volumen final
1 μg/μl
10X
-
Concentración
final
50 ng/μl
1X
-
μl
100
1. Agregar 0.5 μl de la enzima de restricción BstEII.
2. Mezclar muy bien por agitación, y traer todo el volumen al fondo del tubo mediante
una breve centrifugación.
3. Colocar el tubo en un baño equilibrado a la temperatura óptima de digestión con la
enzima. Digerir por el lapso de 1 hora.
-¿Cuál es el tamaño del genoma del fagoλ? Utilice las bases de datos del National Center
for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Número de acceso a
GenBank: J02459 o M17233.
-Utilice el programa NEB cutter 2 (http://tools.neb.com/NEBcutter2/index.php) para
predecir cuantos sitios de corte para la enzima BstE II presenta el fago λ. Para ello copie
y pegue la secuencia de ADN de λ en este programa o seleccione la opción “Lambda” del
menu de secuencias estándar (esto cargará automáticamente el genoma del fago).
¿Cuántos fragmentos de y de que tamaño debería ver en un gel de agarosa 1%? ¿Y si
utilizara las enzimas BamHI y NotI? ¿Qué secuencias reconocen las tres
endonucleasas?
B- Digestión sitio inespecífica (DNAsa y RNAsa).
1. Preparar 4 eppendorfs conteniendo 5 μg de ADN de λ (500 ng/μl).
2. Diluir 1/100 el stock de DNAsa (5 mg/ml) en 50 mM Tris-HCl pH 7.6, 5 mM MgCl2.
Preparar 100 μl (Dilución 1).
3. A partir de la dilución anterior, preparar una solución 1/10 (Dilución 2) y 1/100
(Dilución 3) utilizando 50 mM TrisHCl pH 7.6, 5 mM MgCl2. Preparar 100 μl de cada
una de ellas.
4. Tomar 10 μl de cada una de las diluciones (1, 2, 3) y agregárselos a 3 de los
eppendorfs preparados en el paso 1.
5. Incubar 5 minutos a temperatura ambiente. Inactivar la DNAsa 20 minutos a 80º C.
Sembrar en gel de agarosa 1%.
6. Al cuarto eppendorf agregarle 10 μl de 50 mM TrisHCl pH 7.6, 5 mM MgCl2 y 1 μl
RNAsa (10 mg/ml).
3º Parte:
Electroforesis de ADN en geles de agarosa
1. Preparar una solución de agarosa 1% en buffer de electroforesis TBE 1X. Para lograr
que se disuelva es necesario hervir la mezcla.
2. Enfriarla hasta 40-45 oC y antes de que gelifique, agregar bromuro de etidio 0.5
μg/ml (usualmente la solución stock está 20000X), agitar suavemente para mezclar sin
que aparezcan muchas burbujas y verter en las cubas ya preparadas (con topes y peine).
MUCHO CUIDADO CON EL BROMURO DE ETIDIO: ES CANCERIGENO.
MANEJARLO CON GUANTES, DEL MISMO MODO QUE TODO LO QUE
ESTE EN CONTACTO CON ESA SAL (EL GEL, EL BUFFER DE CORRIDA,
LA CUBA). CAMBIARSE LOS GUANTES ANTES DE TOCAR CUALQUIER
OTRA COSA LIMPIA!!!!!!!!!
3. Cuando ha gelificado completamente, agregar TBE 1X hasta cubrir todo el gel,
extraer con cuidado el peine y los topes de plástico, y terminar de agregar buffer (en
caso necesario) como para cubrir los electrodos de la cuba y el gel.
4. Preparar las muestras a sembrar (ADN cromosómico, ídem pero sonicado, ADN
plasmídico aportado por los docentes digerido y sin digerir, y marcadores de peso
molecular), por agregado de buffer de siembra. Calcular cuánto agregar sabiendo que el
buffer de siembra está 6X. Mezclar muy bien.
5. Sembrar no más de 20 μl por calle. Asegurarse la correcta orientación de los
electrodos en relación al extremo del gel donde se realizó la siembra. Correr a 8 V/cm.
6. Cuando el frente llega a correr 3/4 partes del gel, cortar la corrida, y observarlo con
un transiluminador de luz UV. MUCHO CUIDADO CON LA LUZ UV: PRODUCE
DAÑOS IRREVERSIBLES A LA VISTA Y A LA PIEL. NO MIRAR SIN
PROTECCION ADECUADA (ANTEOJOS O MASCARAS PARA UV), NO
EXPONER LA PIEL INNECESARIAMENTE (USAR GUANTES DE LATEX, Y
NO ESTAR DEMASIADO TIEMPO CON LA LUZ UV PRENDIDA)!!!!!!!!!!!
Informe:
Los alumnos escribirán un informe con los resultados obtenidos, discutiéndolos
en base a lo visto en clases teóricas.