Vías moleculares involucradas durante la regeneración de la

Vías moleculares involucradas durante la regeneración de la estructura caudal
del pez cebra.
María Montserrat García Romero
La regeneración biológica por si misma es tan intrigante y cautivadora que ha
permanecido como un enigma el entender como ciertos organismos son capaces de restaurar
extremidades, órganos y tejidos amputados, no solo en forma, si no también en función
(Nakatani et al, 2007). Sin embargo es importante mencionar que este fenómeno es
ampliamente encontrado en organismos del reino animal ya que es un mecanismo esencial,
que permite la organización, celular y tisular del organismo así como su mantenimiento a
través del tiempo (Kawakami, 2010). Ejemplos de regeneración tisular pueden ser
encontrados en la remodelación de hueso y piel así como la nueva producción de sangre,
incluso el hígado es capaz de regenerar mas de la mitad de su masa (Poss, 2010).
De los diferentes tipos de regeneración que existen, una de las más estudiadas es la
regeneración epimorfica (Nakatani et al 2007). La cual es mediada por la formación de dos
estructuras características, la capa epidermal y el blastema, el proceso se describe a
continuación. Después de la amputación o extirpación del tejido, el área afectada necesita
ser cubierta y reparada, donde las células adyacentes al área afectada, migran y dan lugar a
la capa epidermal, una estructura con función desconocida pero necesaria para llevar acabo
la regeneración biológica. Eventualmente células adjuntas a esta estructura experimentan
dediferenciación celular, migran hacia la capa epidermal y debajo de la misma, este grupo
se concentra, y forman la estructura conocida como “blastema” la cual es altamente
proliferativa. Finalmente las células que conforman el blastema volverán a diferenciarse
hacia un estado mas maduro y darán lugar a la restructuración del tejido o extremidad
amputada.
En el campo de la medicina regenerativa el uso de tritones y axolotes ha sido ampliamente
estudiado debido a la increíble capacidad que poseen de reconstruir extremiades (incluyendo
la estructura caudal) medula espinal, músculo cardiaco, incluso retinas han sido manipuladas
y analizadas a manera de entender los procesos clave involucrados en la regeneración
epimorfica. (Poss, 2010; Odelberg, 2005).
Sin embargo el uso de peces teleósteos tales como el pez cebra ha emergido como un
modelo apropiado para la investigación de la regeneración epimorfica debido a la gran
variedad de estructuras que es capaz de regenerar, tales como aletas, retina, medula espinal,
músculo, cardiaco, rayos de las aletas, células ciliadas, etc. Las ventajas sobre el uso de este
modelo es la rápida regeneración que presenta, por ejemplo en el pez cebra las aletas tardan
en regenerar de una a dos semanas en comparación con 40 días que toma la regeneración de
las extremidades de las salamandras. Más aún diferentes tipos de técnicas moleculares, tales
como el sistema Cre lox, así como la creación de líneas transgénicas, pueden ser aplicadas,
sin olvidar que el genoma de este modelo ha sido secuenciado en su mayoría; estas
característica hacen del pez cebra un modelo idóneo y fácil de manipular (Nakatani et al,
2007). Sus propiedades no se limitan a las antes mencionadas, el uso del estadio juvenil (2-7
días de edad), después de la amputación de la estructura caudal también presenta estructuras
tales como la capa epidérmica y el blastema por lo que
ha demostrado ser igual de
conveniente que el pez cebra adulto, con un tipo de regeneración incluso mas corta (3-4 días)
y que por su tamaño permite el uso de un mayor número de organismos y una fácil
manipulación (Kawakami, 2010). Modelo que es usado en el presente estudio.
Durante la regeneración de la estructura caudal, diferentes marcadores genéticos son
expresados, por ejemplo en el blastema pueden ser encontrados los siguientes, msxc, msxb,
msxe (Akimenco et al., 1995; Nechiporuk and Keating 2002; Kawakami et al., 2004), raldh2
y fgf20a (Whitehead et al., 2005; Mathew et al., 2009). En tanto que la capa epidermal
también presenta marcadores característicos como por ejemplo dlx5a (Schebesta et al.,
2006).
No obstante las vías moleculares que regulan este proceso no han sido completamente
entendidas, sin embargo la activación de ciertas vías ha sido descrita durante la regeneración
de la aleta caudal del pez cebra. Por ejemplo la vía molecular FGF (Factor de creamiento de
fibroblastos) ha sido sugerida como esencial al momento de la formación del blastema así
como proliferación del mismo (Poss et al., 2000). Mientras que la vía Wnt ha sido también
descrita en la contribución de este proceso (Stoick-Cooper et al 2007). En el caso de la vía
hedgehog (HH) el rol en el que participa es mencionado al establecer un patrón en la rayos
de las aletas así como conservación del blastema (Avaron et al., 2008).
El objetivo del presente estudio es identificar vías involucradas en el desarrollo temprano,
(como las antes mencionadas) que podrían ser activadas nuevamente durante la regeneración
epimorfica. Este análisis molecular involucró la inhibición algunas vías moleculares con
diferentes inhibidores químicos (durante dos días después de la amputación) tales como HH,
(inhibidor ciclopamina) y FGF, (inhibidor SU5402) la activación de Wnt (GSK3 inhibidor)
así como la administración ectópica del metabolito, acido retinoico (RA). Después del
tratamiento químico los peces fueron tratados para su posterior análisis, a manera de detectar
la expresión de marcadores genéticos de regeneración con el uso de la técnica de hibridación
in situ.
La continúa administración de los diferentes tratamientos químicos mostró diferentes niveles
de expresión en los tres marcadores genéticos de regeneración (dlx5a, msxc y raldh2), donde
una completa ausencia en la expresión de estos fue observada en el tratamiento que
involucro la supresión de la vía molecular HH (por ciclopamina). Lo cual siguiere una
función esencial de HH para iniciar regeneración de la estructura caudal del pez cebra así
como mediador de genes involucrados en este proceso. Sin embargo estos resultados no
excluyen la posibilidad de que HH regule otra u otras vía(s) moleculares
durante la
regeneración y que estas vías sean las que regulen directamente el proceso de regeneración
caudal. Siendo así una continua exposición del ciclopamina podría primero suprimir HH,
donde la ausencia de esta vía pudo haber dado como resultado la ausencia de la otra posible
vía molecular que podría actuar directamente en los marcadores genéticos de regeneración.
A manera de analizar esta posibilidad un nuevo experimentó fue establecido, con un
tratamiento químico a pulso, en el cual el tratamiento es administrado solo algunos horas
antes de la fijación de los peces, pero a una más alta concentración. De esta manera se
pretende acortar el tiempo con la idea de inhibir solo una vía molecular, y después analizar la
expresión de los marcadores genéticos.
El resultado de este nuevo experimento nuevamente mostró diferentes niveles de expresión
de los marcadores genéticos, no obstante esta vez los peces tratados con ciclopamina
presentaron cierto nivel de expresión de los mismos, lo que siguiere que HH podría estar
influenciado otra vía o vía(s) que a su vez participan en el proceso de regeneración. Sin
embargo en este ultimo experimento otro tratamiento químico también mostró un interesante
nivel de expresión de los marcadores genéticos, el cual involucra un incremento en la
expresión de la vía molecular Wnt (GSK3 inhibidor), donde la expresión de los marcadores
es notablemente más alta que los controles. Lo que siguiere que posiblemente esta vía
molecular este mediando directamente el proceso de regeneración.
Seguimiento de diferentes linajes celulares durante la regeneración de la
estructura caudal del pez cebra.
Otros de los aspectos de la regeneración epimorfica que sigue siendo una interrogante, es el
tipo de linajes celulares que participan en este proceso, las interrogantes mas comunes tratan
de encontrar una respuesta acerca del tipo de células que participan en la formación del
blastema así como de la capa epidermal, otro aspecto importante es estudiar la posibilidad de
que un cierto tipo de célula por ejemplo una célula de la piel, durante el proceso de
regeneración tenga la plasticidad para trans-diferenciar en otro tipo de linaje celular como
músculo.
A manera de elucidar los aspectos antes mencionados, células de diferentes linajes (piel,
hueso, músculo, neuronas, posibles precursores de células madres, fibroblastos y células
sanguíneas) serán modificadas genéticamente a manera de expresar la proteína fluorescente
verde, la cual hará posible el seguimiento celular durante la regeneración caudal. El sistema
Cre lox permitirá la expresión de la proteína fluorescente solo en los tejidos de interés.
Posibles resultados
Dediferenciación limitada – mismo linaje
Piel
Piel
Dediferenciación limitada – diferentes linajes
Músculo
Piel
Piel
Participación de células madre
Músculo
Células
madre
Piel
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